《生长与环境影响》PPT课件.ppt

第7章微生物的生长及环境的影响 7 1微生物的生长 生长 微生物在适宜的环境条件下进行新陈代谢 各细胞组分协调而平衡地增长 称为生长 繁殖 单细胞微生物生长到一定程度时 就以二分裂等方式形成子细胞 引起个体数目的增加 称为繁殖 多细胞微生物细胞数目的增加若不伴随着个体数目的增加 只能叫生长 不能称繁殖 唯有通过形成无性孢子和有性孢子等使个体数目增加的过程才能称为繁殖 1 微生物生长的基本概念 当微生物的培养时间一定时 他的世代时间基本上也是稳定的 但是如果外界条件发生变化 世代时间也会变化 发育 从生长到繁殖是一个从量变到质变的过程 这个量变与质变的全过程叫发育 世代时间 细菌两次分裂之间的时间 世代时间越短 繁殖速度越快 一般 原核微生物的繁殖速度大于真核微生物 好氧微生物快于厌氧微生物 延滞期 对数期 稳定期 衰亡期 培养时间 细菌浓度 2 微生物的生长规律 单细胞微生物 群体 的生长曲线 将少量单细胞纯培养接种到一定容积的新鲜培养液中 在适宜条件下培养 随着细胞生长繁殖 培养液混浊度逐渐增加 定时取样测定含菌量 以培养时间为横座标 以微生物细胞数目的对数为纵座标作图 得生长曲线 生长曲线代表微生物在新的适宜的环境中生长繁殖至衰老死亡整个过程的动态变化 可分延滞期 对数期 稳定期和衰亡期四个阶段 1 延滞期 lagphase 亦称迟缓期 停滞期 滞后期 延滞期的长短与菌种的遗传性 菌龄及移种前后所处的环境条件等因素有关 此时细菌数量几乎不变 但细胞内物质含量又增加 相对细胞体积较大 2 对数生长期 logphase 又称指数期 exponentialphase 细胞代谢活性 酶活性高而稳定 组成新细胞物质最快 细胞数以几何级数增加 增代时间最短 细胞数目的增加与菌液浊度的增加均呈正相关 处于对数期的微生物其个体形态 化学组成和生理特性等较一致 代谢旺盛 生长迅速 代时 单个细胞完成一次分裂所需的时间 稳定 是研究基本代谢的良好材料 也是发酵生产的良好种子 3 稳定期 stationaryphase 又称恒定期或最高生长期 静止期 细胞增殖与死亡处于动态平衡 总数不再增加 细胞内贮存物的积累增加 菌体出现颗粒 脂肪球等 大多数芽孢细菌在此阶段形成芽孢 是生产上收获菌体和代谢产物的重要阶段 稳定期时 菌体的总产量与消耗的营养物质之间的关系 生产上称为产量常数 y y 菌体总生长量 消耗营养物质总量y值的大小可说明该种微生物同化效率的高低 稳定期的长短 与菌种和外界环境条件有关 生产上常通过补料 调节pH 调整温度等措施 延长稳定期 以积累更多的代谢产物 4 衰亡期 declinephase 细胞分裂由缓慢而停止 死亡率提高 其中有一段时间 活菌数成几何级数下降 故有人称之为 对数死亡阶段 由于环境中营养消耗殆尽 微生物开始利用自身的贮藏物甚至菌体的组成成分作为养料 维持生命 此时称为内源代谢阶段或内源呼吸 endogenousrespiration 阶段 细胞内颗粒更明显 原生质中出现液泡与空泡 有些菌细胞常呈畸形或多形态性 有些细胞自己消解而死亡 对数期 衰老期 平推流式活性污泥法 稳定期 7 2微生物的培养方式 将微生物置于一定容积的培养基中 经培养 最后一次收获 谓分批培养 在分批培养中 培养基一次加入 不予补充 不再更换 由于营养消耗 代谢产物积累 对数生长期不能长期维持 1 分批培养 batchculture 在培养器中不断补充新鲜营养物质 并不断排出部分培养物 包括菌体和代谢产物 以保持长时间生长状态的一种培养方式 主要有恒浊连续培养和恒化连续培养两类 恒浊连续培养通过不断调节流速 使培养液浊度保持恒定 因而可不断提供具有一定生理状态的细胞 并可得到以最高生长速率进行生长的培养物 恒化连续培养通过控制恒定的流速使营养物浓度基本恒定 从而使微生物保持恒定的生长速率 用不同浓度的限制性营养物进行恒化培养 可得到不同生长速率的培养物 2 连续培养 continuousculture 在发酵罐中的一部分发酵液保留下来作为菌种液 放出其余部分 在剩余的培养液中加满新的未接种的培养液 继续培养 如此反复 谓之半连续培养 3 半连续培养 semi continuousculture 4 补料分批培养 fed batchculture 又称半分批培养 是指在分批培养过程中 间歇或连续地补加新鲜培养液 但不取出培养物 待培养到适当时期 将其从反应器中放出 从中提取目的生成物 菌体或代谢产物 若放出大部分培养物后 继续进行补料培养 如此反复进行 5 同步培养 能使培养的微生物处于较一致的 生长发育在同一阶段上的培养方法叫同步培养法 利用同步培养法控制细胞的生长 使它们处于同一生长阶段 所有细胞都能同时分裂 这种生长方式叫同步生长 用同步培养法得到的培养物叫同步培养物 synchronousculture 因为群体和个体行为一致 即可用研究群体的方法来研究个体水平上的问题 由于同步群体的个体差异 同步生长往往最多维持2个 3个世代 离心分离法硝酸纤维素滤膜法微孔过滤分离法 同步培养方法 影响生物体内的许多生化反应 因而影响代谢活动 温度可引起环境因子变化 可最终影响倍增时间 影响微生物群生态结构 在一定温度范围内 生化反应速率随温度上升而加快 微生物对低温的抵抗力较强 细菌芽孢和霉菌孢子可在 190 下存活半年 不同微生物有其生长的最低 最适和最高温度 低温可降低代谢活力 使生长繁殖停滞 故广泛应用于保藏菌种 但要注意 某些菌 在冰箱中比室温下更易死亡 幼龄菌对温度骤降很敏感 冷休克 冰点下保藏菌种时 悬藏液中要加保护剂 8 二甲亚砜或12 甘油 切忌冰冻与融化交替进行 7 3环境因素对微生物生长的影响 1 温度的影响 pH可引起细胞膜电荷的变化 从而影响营养物质的吸收 影响酶的活性 改变营养物质的可给性和有害物质的毒性 介质的pH不仅影响微生物的生长 甚至影响其形态 微生物有其最适的pH范围 强酸碱一般有致死作用 通常多数真菌适于偏酸性环境 细菌适于中性环境 嗜酸菌如氧化硫硫杆菌 Thiobacillusthiooxidans 最适pH为2 3 5 微生物代谢活动会改变环境pH 所以培养基中常加缓冲剂 对于要求pH6 5 7 5时 常用磷酸盐缓冲剂 要求碱性时 常用硼酸盐或甘氨酸 若要求pH 9 则可用重碳酸盐 要求微酸性可用柠檬酸盐 pH 4 5 可用乙酸盐或二甲基戊酸盐等 尽管对环境pH值不同微生物有不同要求 但其细胞内的pH值都十分接近中性 与最适温度一样 微生物生殖的最适pH与其合成代谢产物的最适pH常不一致 2 酸碱度的影响 好氧菌 aerobes 包括大多数细菌 几乎全部的放线菌 蓝细菌 藻类和丝状真菌 它们以氧为呼吸链的最终电子受体 最后与氢离子结合成水 在呼吸链的电子传递过程中 释放出大量能量 供细胞维持生长和合成反应使用 氧还参与一些生化反应 好氧菌缺氧不能生长 厌氧菌 anaerobes 主要包括细菌和原生动物中的少数类群 它们利用结合态的氧 由于在有氧条件下会产生电子结构特殊的单一态氧 超氧化物游离基和过氧化物等有害化合物 而厌氧菌缺少过氧化物酶和超氧化物歧化酶 无法消除这些毒物的作用 所以它们暴露在空气中将停止生长 甚至很快死亡 3 氧和氧化还原电位的影响 兼性厌氧菌 facultativeanaerobes 包括许多细菌 酵母菌和病原微生物中的一些类群 它们具有两套呼吸酶系 有氧时以氧作为受氢体进行呼吸作用 无氧时则以代谢的中间产物为受氢体进行发酵作用 通常在有氧时长得更好些 微好氧菌 microaerobes 在充分通气或严格厌氧的环境中均不能生长 只能在含氧量为2 10 的微好气条件下生长 耐氧菌与兼性厌氧菌类似 只是在缺氧时长得更好些 好氧微生物在Eh值 0 1V以上均可生长 以0 3V 0 4V为宜 厌氧微生物需Eh值 0 1V或更低才能生长 兼性厌氧微生物有氧时进行好氧呼吸 厌氧环境时进行厌氧呼吸 代谢途径不同 产物因此而异 往培养基中通空气 降低pH或加氧化剂 均可提高Eh 反之 提高pH值或加入还原性物质可降低Eh 微生物代谢活动耗氧 产生还原性物质如H2S 半胱氨酸等 均使Eh降低 微生物生长要求适宜的Eh值 光能是光能自养和光能异养型微生物的唯一或主要能源 非光合性微生物有少数类群 如闪光须霉 Phycomycesnitens 能表现趋光性 另一些真菌 如蘑菇和灵芝等 在子实体和色素形成时需要散射光 伤害作用菌体内有一类通称为光敏化剂 photosensitizer 的化学物质 能被光能活化为高能状态 其能量可被菌体的有机分子或氧气所吸收 若被有机分子吸收 菌体受伤害较小 若被空气中氧气吸收 基态氧变成高活性强氧化态氧而伤害细菌 这种伤害作用能被猝灭剂所遏制 菌体内色素为自然猝灭剂 所以强烈可见光在有氧时可伤害不含色素的细菌 紫外线损伤DNA 形成胸腺嘧啶二聚体 从而抑制DNA复制 引起突变或致死 以波长为265nm 266nm的杀菌力最强 由于紫外线穿透力弱 通常应用于表面或空气杀菌 4 辐射的影响 不同波长的辐射对微生物生长的影响不同 波长愈短 能量愈高 电离辐射包括x y 和 等射线 它们波长短 能量大 可能使物质分子发生电离作用而产生游离基 游离基可与细胞内的大分子化合物作用使之变性失活 常用于土样 食品和药物等的杀菌 振频超过2 104HZ的声波 使细胞破裂 内含物外泄而亡 化学药剂对微生物的作用取决于药剂浓度 作用时间和微生物对药物的敏感性 超声波的影响 化学药剂影响 重金属离子尤其是Hg Ag 和Cu2 具有很强的杀菌力 重金属离子进入细胞后主要与酶或蛋白质上的 SH基结合而使之失活或变性 微量的重金属离子还能在细胞内不断累积并最终对生物发生毒害作用 此即微动作用 卤化物杀菌力高低顺序是 F CL Br I 最常用的是碘和氯 碘不可逆地与菌体蛋白质 或酶 的酪氨酸结合 生成二碘酪氨酸 使菌体失活 常用于皮肤消毒 氯与水结合成次氯酸 后者易分解产生新生态氧 为强氧化剂 常用于饮水和游泳池水消毒 Cl2 H2O HCl HClOHClO HCl O 有机废水厌氧消化过程 酸发酵 碱性发酵过程 沼气发生率 自养 在一些重金属离子含量甚高的环境中 也有微生物生长 例如在一些含铜量达到68000mg L的泥炭沼泽地和含铜量达100mg L水和泥土里仍有真菌生长 在含砷 锑的酸性矿泉水中 虽然浓度大大超过毒性水平 也仍然有藻类 真菌 原生动物和细菌组成的微生物群落存在 微生物对重金属离子毒害的抗性 利点 有用微生物的抵抗金属毒性能力强 不利点 生物污泥携带大量金属能 处理难度增加 通过改变细胞膜透性 阻止金属离子进入细胞例如 在酸性矿泉水里生长的真菌 在pH为2 3时 即使CuSO4的浓度达到lmol L 也不能进入细胞 而当pH中性时 真菌对 4 10 5 mol LCuSO4也敏感 这表明真菌对Cu2 的抗性与环境中pH变化有密切关系 产生某种螯合剂 抵抗金属离子的毒害微生物能产生某种螯合剂 抵抗金属离子的毒害 例如砷 锑等金属 可以在细胞内或细胞外 与微生物产生的螯合剂形成复合物 避免这些金属使酶失活或不被微生物细胞吸收 3 通过酶促反应 使有毒物质转变成无毒化合物HgCl2是和细胞酶蛋白的巯基结合使酶失活 一些微生物可以由甲基钴胺素作辅酶及提供甲基 使HgCl2转变成甲基汞或二甲基汞 不再与巯基结合 避免了毒害作用 甲基汞可被假单胞菌 金黄色葡萄球菌及肠道细菌还原成金属汞 微生物免除高浓度重金属离子毒害的机理 7 4环境微生物的检测 微生物是微生物环境工程的核心 微生物的监测分析方法十分重要 微生物的存在离不开环境 而微生物的数量分布和种群组成 理化性状 遗传变异等 又是环境状况的综合而客观的反映 利用微生物监测环境污染 通常有生态学监测法 生理生化监测法和毒理学监测法等 选用适当的方法 可了解不同污染状况及其近期 远期影响 新理论 新技术的渗透和应用 使监测方法不断完善 革新 更为灵敏 快速 准确 蛍光顕微照片 BX50OLYMPUS 相位差顕微照片 BX50OLYMPUS 染色法光学照片 1 光学显微镜检查 染色法 由于细菌细胞微小而透明 往往需经染色才能用显微镜观察 染色前要进行干燥固定 致使测得的菌体大小小于活菌体 若采用负染色法 使背景着色 衬托菌体 则标本会大于活菌体 相位差显微镜 普通光学显微镜观察未经染色的标本 如活细胞 时 其形态和内部结构难以辨认 细胞各部分的密度和厚度不同使光程和折射率不同 光线通过后会产生相位差 相位差显微镜可将相位差转变成人眼可察觉的振幅差 明暗差 是显微技术的一大突破 该项技术的发明 F Zernike 获得了1953的诺贝尔物理学奖 荧光显微镜 利用某些物质在紫外线照射下会发出荧光 在黑暗的背景下表现为光亮的物体的原理实现成像 7 4 1细菌形态学检查 对任何显微镜来说 分辨率是其观察效果的最重要的指标 光学显微镜分辨率受光干涉现象所制约有如下极限 分辨率 最小可能分辨距离 光源波长 最短可见光波长为450nm 试样与物镜间介质的折射率 高折射率的香柏油为1 52 物镜镜口角的半数 与物镜直径和与试样间工作距离有关 没有改进空间 一般认为 以可见光为光源时 分辨率不大可能超过0 18微米 而且人肉眼正常分辨能力为0 25毫米左右 进一步提高光学显微镜的放大倍数意义不大 因此目前光学显微镜总放大倍数只能达到1000 1500倍 2 透射电子显微镜 工作原理与光学显微镜极为相近 但以更短波长的电磁波取代可见光 是目前分辨率最高的显微镜 1933年德国人E Ruska制成第一台 1986获诺贝尔物理学奖 1 负染技术用电子密度高本身与样品几乎不反应的物质 多为重金属盐 来对样品 染色 这些金属盐不被样品成分吸附 而是沉积到样品周围或样品表面上凹陷的部分 从而以散射电子能力的差异把样品的外形与表面结构清楚的衬托出来 制样方法 2 超薄切片技术 电子束的透射能力较弱 观察细胞内部结构时 必须制作成100nm以下厚度的切片 基本步骤如下 SEM工作原理类似电视 电子枪发出的电子束被磁透镜会聚成极细的电子探针 对样品进行扫描 激发样品表面放出二次电子 也有其他信号 二次电子多少与电子束的入射角有关 即与样品表面形貌有关 在观察用荧光屏上有一个电子束做同步扫描 用二次电子放大信号对荧光屏电子束的强度进行控制 还原形成样品的立体形貌图像 图像的景深很好 可观察立体结构 3 扫描电子显微镜 scanningelectronmicroscope 溶藻細菌N 14株的電子顕微鏡照片 乳酸菌的扫描电子显微镜 SEM 照片 电子显微镜与后面将要介绍的探针扫描显微镜相比较 最大的缺陷是需要对样品进行表面处理 特别是表面导电性较差的样品 水処理担体AQ 7 扫描电子显微镜 SEM 的样品制备 样品制备比透射电子显微镜的样品制备方法要简单的多 但这种样品的处理制备使SEM的应用范围比后面将要介绍的扫描探针显微镜要小得多 样品制备主要内容脱水干燥喷镀金属导电层 样品制备的主要目的是便于观察 但高保真是样品制备技术好坏的基本标准 样品是否产生变形 关键在于干燥技术 自然干燥真空干燥冷冻干燥临界点干燥 临界点状态气液不分 没有气液界面 没有表面张力 利于保持样品的形态 4 扫描探针显微镜 扫描探针显微镜 scanningproblemicroscope SPM 家族中的老大是扫描隧道显微镜 scanningtunnelingmicroscope STM 1986年发明人G Binning和H Rohrer获诺贝尔奖 80年代初研制成功 它装有极细的金属探针 将探针尖和样品表面作为电极 探针作高精度的移动 当探针尖靠近待观察材料表面时 距离为0 5 2nm 双方原子外层的电子云有所重叠 这时在针尖和材料之间施加一个小电压 便会引起隧道效应 电子在针尖和材料之间流动 隧道电流随距离改变而剧烈变化 表面那些 凸凹不平 的原子所构成的电流变化 通过计算机处理 便能在显示屏上看到材料表面三维的结构图 STM具有极高的分辨率 横向可达0 1nm 纵向可达0 001nm 1959年 诺贝尔奖获得者理查德 费曼预言 人类可以用小的机器制作更小的机器 甚至可以根据人类的意愿 逐个排列原子或分子 制造超晶态产品 这是关于纳米技术最早的梦想 1982年 发明观察纳米结构的重要工具 扫描隧道显微镜 STM 为我们揭示一个可直接探测的原子 分子世界1990年7月 第一届国际纳米科学技术会议在美国巴尔的摩举办 标志着纳米科学技术的正式诞生 1991年 碳纳米管被人类发现 它的力学性质尤其引人注目 这种材料的质量只是相同体积钢的六分之一 强度却是钢的十倍 一度成为纳米技术研究的热点 1989年美国斯坦福大学搬运原子团 写 下斯坦福大学英文名字1990年美国国际商用机器公司在镍表面用36个氙原子排出 IBM 1993年 中国科学院北京真空物理实验室自如地操纵原子成功写出 中国 二字1997年 美国科学家首次成功地用单电子移动单电子 利用这种技术可望在20年后研制成功速度和存贮容量比现在提高成千上万倍的量子计算机 1999年 巴西和美国科学家在进行纳米碳管实验时发明了世界上最小的 秤 它能够称量十亿分之一克的物体 即相当于一个病毒的重量 此后不久 北京大学的科学家研制出能称量单个原子重量的 秤 STM的诞生带来了纳米科技的迅猛发展 没经清洗的菌細胞 用蒸馏水清洗1次的甲烷菌細胞 用蒸馏水清洗2次的甲烷菌細胞 用磷酸盐缓冲液清洗2次的甲烷菌細胞 雑質 用固定剂处理过后用蒸馏水清洗3次的产甲烷菌細胞 红色数据表示以细胞含量为最小需要量进行物质衡算时 培养液的微量元素含量小于最低要求量 显微镜检查确认 细胞的清洗和过滤操作在保持厌氧环境的氮气介质中进行 ICP inductivelycoupledplasma 感应耦合等离子分析 分析方法 细菌分离培养 富集培养 荧光显微镜 采集细胞 细胞清洗 原子力显微镜分析 离心分离 湿式分解法处理细胞试样 ICP分析 inductivelycoupledplasma 数据统计分析 误差分析 A B 观测分析细菌在各种吸附材料上的吸附机理与吸附强度 分裂增殖 活生理菌单细胞 活体细胞的分裂过程观测 菌体表面构造及作用 7 4 2微生物检测 1 水质指示微生物 大肠菌群的检测大肠菌群 coliformgroup 简称coliform 为饮水 食品等的细菌学常规检验指标之一 世界各国的水质 食品等卫生标准对此都有明确规定 我国目前水质标准中规定的大肠菌群数 个 L 为饮用水 3游泳池水 100地表水第一级 500第二级 10000第三级 50000流行病学研究确认 水携带的病原菌的存在与肠道来的细菌强相关 人粪内的大肠菌群细菌 是一项行之有效的水质污染的生物学监测指标 环境科学工作者还以大肠菌群这一指标 检验工业废水和城市污水的处理效果 研究饮用水 游泳池水的处理及水质的改良和提高等等 大肠菌群是一群需氧和兼性厌氧的 能在37 培养24h内使乳糖发酵产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌 包括埃希氏菌属 Escherichia 柠檬酸杆菌属 Citrobacter 肠杆菌属 Enterobacte 克雷伯氏菌属 Klebsiella 等 又称总大肠菌群 totalcoliform 检测大肠菌群方法比较简易 所以 在实际工作中常以大肠菌群为指示微生物来评价水的卫生质量 检测大肠菌群的标准方法有多管发酵法和膜滤法 多管发酵法是于一系列发酵管中接种一定量水样 根据乳糖发酵产酸产气的阳性管数 测知水样含大肠菌群数 大肠埃希氏菌 Escherichia 即最大可能数法 mostprobablenumber MPN 于一系列乳糖蛋白胨培养液发酵管 瓶 内注入一定量水样 乳糖发酵产酸产气者为阳性 根据成阳性的水样管数 定量说明水样含大肠杆菌数量 2 多管发酵法 基本原理 多管发酵法简介 1 初发酵试验无菌操作法向各乳糖蛋白胨培养液发酵管 瓶 内注入一定量水样 混匀后置37 温箱培养24h 产酸产气者为阳性 阴性者继续培养24h 3h再行检查 混浊而无气泡者 轻摇试管 观察有无小气泡上浮 有小气泡不断上浮 表示发酵正活跃 否则判为阴性 接种水样量 平行管 瓶 数参考如下 饮用水100ml 2瓶 10ml10管未污染水10ml 1ml 0 1ml各5管受污染水0 1ml 0 01ml 0 001ml各5管污水0 001ml 0 0001ml 0 00001ml各5管这里 0 1ml即稀释10倍的水样1ml 余类推 接种水样量大 10ml 100ml 的管 瓶 内培养液应是浓缩液 使其在加入水样后为单倍浓度 普通浓度 2 平板分离轻摇初发酵试验阳性管 用接种环或接种针取上述各阳性管的培养物 分别在伊红美兰平板上划线接种 平板倒置于37 温箱培养18h 24h 呈深紫红色 有或无金属光泽的菌落 为典型大肠菌菌落 粉红色 粘液状 不透明的为非典型菌落 其他状态的均为阴性菌落 3 复发酵试验取典型 无典型菌落时取非典型菌落 的部分培养物作涂片 革兰氏染色 镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌 则取该菌落的另一部分培养物再接种于普通浓度的乳糖蛋白胨发酵管内 每管可接种分离自同一初发酵管的最典型菌落1 3个 置37 温箱培养24h 产酸产气者证实有总大肠菌群存在 4 报告根据证实有总大肠菌群存在的阳性管数 查菌群检数表 并按初发酵试验接种水样