HepG2细胞培养方法.doc

HepG2细胞培养方法细胞复苏：材料：HepG2细胞、RPMI-1640、胎牛血清、PS（青霉素+链霉素） 35cm细胞培养瓶、消毒的罗口离心管、消毒的吸管、水浴箱、计时器、离心机、光学显微镜试剂配制：100ml完全培养基：90mlRPMI-1640 + 10ml胎牛血清+1支PS，4保存步骤：1 罗口离心管加入含10%胎牛血清的完全培养基3ml.。2 从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速置37水浴1min至融化。3 打开冻存管，吸取细胞悬液至离心管，轻轻混匀。4 800rpm离心5min,弃上清。5 细胞沉淀中加入4ml完全培养基，转入35cm培养瓶37常规培养，第二天观察细胞生长情况。细胞传代与换液：材料：RPMI-1640、小牛血清、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、PBS、PS、35cm细胞培养瓶、消毒的罗口离心管、消毒的吸管、水浴箱、计时器、离心机、光学显微镜试剂配制：100ml终止液：90mlRPMI-1640 + 10ml小牛血清+1支PS，4保存步骤：1 对数增长期汇合度80%-90%的细胞可以传代，4ml PBS清洗两次。2 加入0.25%胰酶1ml,37孵育5min。3 加入3ml终止液，吹打细胞使其脱落并单个化，再移至罗口离心管。4 离心5min,800rpm，弃上清。5 罗口离心管加入完全培养基，混匀后分瓶培养。6 细胞隔日可以用PBS清洗后更换培养基。细胞冻存：材料：RPMI-1640、小牛血清、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、二甲基亚砜（DMSO）、PBS、PS、35cm细胞培养瓶、消毒的罗口离心管、消毒的吸管、消毒的冻存管、水浴箱、计时器、离心机、过滤器、光学显微镜试剂的配制：10ml冻存液：7ml完全培养基+2ml胎牛血清+1ml DMSO,混匀后过滤，4保存步骤：1 去除培养瓶中旧的培养基，加入4ml PBS清洗两次。2 混匀胰酶，每瓶加入1ml,37孵育5min。3 每瓶加入3ml终止液，反复抽打细胞使其脱落并单个化，移至罗口离心管。4 800rpm离心5min,弃上清。5 每管加入1ml冻存液，混匀细胞，移至冻存管中。将细胞冻存管放于-20保存2hrs。6 细胞冻存管-80过夜。7 第二天转入液氮中保存。细胞种板：材料：RPMI-1640、小牛血清、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、PBS、PS、35cm细胞培养瓶、六孔板、消毒的罗口离心管、消毒的吸管、水浴箱、计时器、离心机、光学显微镜、细胞计数器步骤：1 将汇合度为80%-90%的HepG2细胞加入4ml PBS清洗两次。2 加入1ml已混匀好的胰酶消化，37孵育5min。3 培养瓶中加入终止液3ml，反复吹打使其脱落并单个化，细胞悬液转移至罗口。4 800rpm离心5min,弃上清。5 加入6.5ml完全培养基，充分混匀细胞，取15ul细胞悬液进行细胞计数，要求六孔板约5*106 -1*106 /孔。6 将6ml细胞悬液转入六孔板，每孔1ml,轻轻摇匀悬液，使其均匀完全覆盖，37继续培养。软脂酸和炎症因子处理HepG2细胞：材料：RPMI-1640、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、甲醇、PBS、PS、 软脂酸(SIGMA P9767)、TNF-a、BSA 消毒的罗口离心管、消毒的吸管和EP管、过滤器、光学显微镜、测量计、过滤器试剂配制：1 BSA培养液：储存液：称取1g BSA溶于10ml RPMI-1640，混匀后过滤，4保存工作液：一瓶RPMI-1640加入2mlBSA储存液和一支PS,即浓度为0.2%，4保存2 软脂酸储存液：称取13.92mg软脂酸（分子量278.41）溶于1ml甲醇，即浓度为0.05mmol/ml，37水浴助溶，分为5份分装于EP管，-20保存3 TNF-a储存液：称取10ngTNF-a溶解于1mlPBS,及浓度为10ng/ml，分为10份分装于EP管，-20保存步骤：1 低倍显微镜观察六孔板里细胞状态，保证无污染，无杂质，汇合度为70%-80%的细胞才可以进行下一步实验。2 六孔板里的细胞加入1mlPBS清洗，每孔加入1ml 0.2% BSA的RPMI-1640，继续无血清培养24hrs。3 不同浓度软脂酸处理细胞24hrs。（每组三个复孔）（1） 对照组：用1mlPBS清洗后， 每孔1ml BSA继续培养。（2） 0.02mmol/L palmitate: 1.2ul 软脂酸储存液+2998.8ul BSA,每孔1ml。（3） 0.04mmol/L palmitate: 2.4ul 软脂酸储存液+2997.6ul BSA,每孔1ml。（4） 0.08mmol/L palmitate: 4.8ul 软脂酸储存液+2995.2ul BSA,每孔1ml。（5） 0.16mmol/L palmitate: 9.6ul 软脂酸储存液+2990.4ul BSA,每孔1ml。（6） 0.32mmol/L palmitate: 19.2ul 软脂酸储存液+2980.8ul BSA,每孔1ml。4 不同浓度TNF-a处理细胞24hrs。（每组三个复孔）（7） 对照组： 每孔1ml BSA继续培养。（8） 5ng/ml TNF-a: 1.5ul TNF-a储存液+2998.5ul BSA,每孔1ml。（9） 10ng/ml TNF-a: 3ul TNF-a储存液+2997ul BSA,每孔1ml。（10） 20ng/ml TNF-a: 6ul TNF-a储存液+2994ul BSA,每孔1ml。（11） 40ng/ml TNF-a: 12ul TNF-a储存液+2988ul BSA,每孔1ml。Trizol法提取细胞总RNA流程 材料：1. RNAiso Reagent: 购于Taraka（货号：D312），100ml2. 氯仿、异丙醇、无水乙醇：国产分析纯3. 0.1%DEPC-H2O、PBS、75%乙醇4. DEPC处理的EP管、滴头、50ml离心管，5ml注射器、计算器、低温离心机、冰盒材料的去RNA酶化：1 0.1%DEPC水 配好的DEPC水过夜灭活，高压蒸汽灭菌，2 EP管、滴头、离心管用0.1%DEPC水浸泡过夜，高压蒸汽灭菌，3 75%乙醇：75ml无水乙醇+25ml 0.1%DEPC水。4 新购买的异丙醇分装于DEPC处理的50ml离心管，4保存步骤：1. 吸出培养基，PBS清洗一次；2. 向100ml培养瓶（6孔板中2孔）加入1ml RNAiso Reagent，水平放置片刻，使裂解液均匀分布于细胞表面并裂解细胞，然后使用移液枪吹打细胞使其脱落（约30次）；将裂解液转移至1.5ml EP管，移液器反复吹打（推荐用5ml注射器抽打10次）；3. 室温静置5min后加入氯仿200ul（RNAiso Reagent：氯仿1ml:200ul），用力震荡后，室温静置5min，待分层后离心，12000g，4，15min；4. 取80无色上清液至另一干净1.5ml EP管（切忌吸出白色中间层），加入400ul异丙醇（异丙醇应与上清体积比为1:1），充分混匀后，静置10min；5. 12000g，4，离心10min，此时管底可见沉淀；6. 小心弃上清液，缓慢沿管壁加入75乙醇1ml，轻轻上下颠倒使沉淀飘起，12000g，4，离心5min，小心弃乙醇，可离心数秒后将残液吸走；7. 室温静置2-5min，干燥RNA；8. 加入DEPC-H2O 30或40ul溶解RNA，-80保存。RNA浓度的标化： 吸取4ul RNA+196ul DEPC水稀释50倍在分光光度计上测算样品的浓度，记好A260、Con(ug/ml)和A260/A280，原始浓度为测量浓度*50（A260和Con换算为Con:A260=40, A260/A280为1.6-2.0，线性范围最好），标化的方法是以最低浓度的一个样品为标准进行标化，标化10ulRNA,计算各个样品加DEPC水量，做RT时RNA加样量为X（0.5ug/原始浓度*1000）ul。 RT-PCR材料：逆转录试剂盒（TAKARA DRR047A）、PCR试剂盒（TAKARA DRR081A） PCR水（灭菌蒸馏水）、去RNA酶的200ul离心管、PCR 8连管、计时器、水浴箱逆转录反应体系为20ul（1） 基因组DNA的除去反应。5*g DNA Eraser Buffer 2ulg DNA Eraser 1ulRNase Free dH2O (10-2-1-X)ulTotal RNA Xul42 2min 水浴，4保存（2） 反转录反应。5*PrimeScript Buffer2 4ulPrimerScript RT Enzyme MIX 1 1ulRT Primer MIX 4 1ulRNase Free d H2O 4ul 37 15min85 5sec （PCR仪反应，约16min，迅速转入20保存） PCR反应体系为25ul SYBR Premix EX Taq 12.5ul 上游引物 0.25ul 下游引物 0.25ul PCR水 10ul c DNA 2ul *无论做RT还是PCR应先将按样品数计算每种试剂加