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文档简介

1培养细胞总蛋白的抽提1) 将代测细胞标准条件下培养48h，PBS洗涤2次，用细胞刮匙轻轻将细胞从培养瓶中刮下，收集细胞总量1107个。1500rpm离心10min，弃上清。2) PBS洗涤2min3，每次1500rpm 离心10min，弃去上清。3) 150l三去污细胞裂解液重悬细胞，冰上静置30min。15000rpm离心30min弃去沉淀，细胞总蛋白即在上清液中。三去污细胞裂解液的成分： 50mM tris-HCl, pH 8.0,150 mM NaCl,0.5% 去氧胆酸钠 1% NP-400.1% SDS1 mM EDTA 100 g/ml苯甲基磺酰氟(PMSF) （临用前配制）10U/ml aprotinin（临用前配制）4) 将蛋白定量、分装。细胞总蛋白经BCA Protein Assay Reagent Kit定量后分装保存。Western blot检测（ECL法）1） SDS-PAGE（凝胶）电泳：配制12%的分离胶和5%的浓缩胶。取15l样品液和3l 6加样缓冲液，混匀。煮沸5min使蛋白变性后上样，每孔上样量约为30g。110V恒压电泳约90min，至溴酚蓝完全消失。SDS-PAGE的配制成分分离胶(12%)浓缩胶(5%)去离子水1.6ml1.8ml3%AA母液2.0ml0.3ml1.5M Tris-HCl (PH8.8)1.3ml-1 M Tris-HCl (PH6.8)-0.75ml10% SDS50l30l10%过硫酸胺(APS)50l50lTEMED5l5l总体积5ml3ml2）转膜：电泳完毕后，切去浓缩胶，将胶浸于蛋白转移缓冲液中平衡10-20min。用湿转的方法将蛋白条带转移至硝酸纤维素膜上 ( SDS-凝胶位于负极，硝酸纤维素膜位于正极 )，0.3A恒流电泳80min。3）封闭：转膜结束后，取下硝酸纤维素膜，PBS浸泡5 min后将膜浸于含5%脱脂奶粉的PBS(MPBS)中1 h。已转膜的凝胶用考马斯亮蓝染液染色1h，脱色液脱色30min，观察胶上残留蛋白情况，判断转膜效率。4）一抗孵育（带有辣根过氧化物酶）：封闭结束后将膜置于杂交袋内，加入目的抗体(1%MPBS按试剂盒要求稀释)，4摇动下过夜。 5）二抗结合：PBS-T快速洗膜一遍后，PBS-T洗膜10min3遍。加入辣根过氧化物酶标记的相对于一抗的第二抗体(1%MPBS 按要求比例稀释)，室温下孵育1 h。PBS-T快速洗膜一遍，再洗膜10min3遍。6）E
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