病毒性肝炎标志物的检测.pdf

2008 5 12JSCCL XUBIN 病毒性肝炎标志物的检测 江苏省临床检验中心 许 斌 2008 5 12JSCCL XUBIN 发 现 肝 炎 病 毒 的 历 史 背 景 1900年早期两种肝炎的自然传染性被认可 非常易传染 成为知名的类型 A 低传染性血清肝炎 成为知名的类型 B 1973 HAV 测试被应用 1978 HAV 不成为慢性 HAV 1980 faecal oral form of NANB recognised 1983 Virus distinct fron HAV polio or picorna viruses 1988 named HEV 1990 HGV cDNA cloned possible reservoir in macaques HEV 1965 澳洲发现 HBsAg 类型 B 抗原 renewed interest in hepatitis including post transfusion form HBV p t 肝炎的描述 1977 delta virus Ag described 1986 delta virus linked to HBV infection HDVHBV 1975 residual hepatitis after introduction of HBV screening suggested other p t hepatitis viruses 1988 cloning of HCV HCV residual cases another virus HGV GA GB 2008 5 12JSCCL XUBIN 甲型乙型丙型丁型戊型庚型输血传播 肝炎肝炎肝炎肝炎肝炎肝炎肝炎 病毒HAV HBV HCV HDV HEVHGV TTV 传播方式粪 口经血经血经血粪 口经血经血或粪口 慢性化 2 7 50 70 2 70 10 20 2 19 癌变危险性 无有有有无无无 潜伏期15 45 天30 120 天1 5 月20 90 天20 180 天不清不清 标志物 血清型 抗 HAV 二对半 抗 HCV HDAgHEAg IgG 前S1 S2抗 HDV抗 HEV IgM 抗原 体 基因型 RNA DNA RNA DNA RNA RNA DNA 各型肝炎的特征及标志物 2008 5 12JSCCL XUBIN 检测方法 核酸 定性 定量50COPY基因技术 血清 定量0 05 0 01化学发光 血清 定性 常规1 0 1ELISA 血清 定量1 0 1放射免疫 血清 定性 筛选10 5金标试纸 血清 定性 筛选100 10凝集反应 血清 初步定性500免疫扩散 适用灵敏度 ng ml 方法 2008 5 12JSCCL XUBIN 放射免疫 ng m l 2008 5 12JSCCL XUBIN ELISA 常规方法 特点 局限性 ng C V15 20 H D H O O K 2008 5 12JSCCL XUBIN ELISA原理 双抗体 原 夹心法 间接法 竞争法 2008 5 12JSCCL XUBIN 高值钩镰效应 HD HOOK 在二位点夹心ELISA中 其剂量反应曲线的高剂 量 HIGH DOSE HD 区段 线性走向不是呈 平台状无限后延 而是向下弯曲状 似一只钩子 或一把镰刀 HOOK MILES 1974 根据此 现象写实性地称之为 HD HOOK 效应 产生该 现象的分子机理有 分子变构说 和 浓度效应 等 推论 一步法和二步法均存在 只是前者出现的更早 些 大多数是高值低吸光度 很少阴性结果 2008 5 12JSCCL XUBIN ELISA原理 今后的发展方向 聚苯乙烯表面的高级制备 PVD F 酶促信号放大的改变 2008 5 12JSCCL XUBIN 试剂盒选择 卫生部规定乙肝试剂 丙肝试剂 艾滋病试剂 梅毒试剂及血型试剂 必须使用经卫生部生物制品检定所检定合格 并贴有防伪标签的产 品 试剂应从灵敏度 特异性 精密度 稳定性 简便性 安全性及 经济性作出全面的评价 灵敏度 1 2 特异性 精密度 ELI SA C V 15 2008 5 12JSCCL XUBIN CLSI I LA23 A Assessing the quality of immunoassay systems radiooimmunoassays and enzyme fluorescence and luminescence immunoassays approved guideline 11 2 The lower immunochemical detection limit for an assay represents the lowest level of an ananlyte that can be reproducibly detected the laboratory or test sensitivity is identical to the detection limit use cut off value Clinical diagnostic sensitivity the proportion of patients with a well defined clinical disorder whose test values are positive or exceed a defined decision limit i e a positive result and identification of the patients who have a disease use positive predictive value false negative results et al 2008 5 12JSCCL XUBIN 保存参考品的国际机构或组织 英国国立生物学标准及控制品研究院 NIBSC 免疫血清学IU ML 德国鲍尔 艾立希研究院 PEI 病毒学 免疫血清学等 传染病标志物最全 PEI ML 法国国家中心实验室 LNS 法国输血协会 SFTS 病毒性肝炎 艾滋等血清盘 NG ML 荷兰输血中心实验室 CLB 血型 病毒学 自身抗体等 丹麦国家血清研究院 SSI 病毒学 寄生虫 免疫蛋白等 美国BBI HBV HCV HIV 1 HIV 2 HTLV 1等 Panel 2008 5 12JSCCL XUBIN 2008 5 12JSCCL XUBIN 2008 5 12JSCCL XUBIN 2008 5 12JSCCL XUBIN 2008 5 12JSCCL XUBIN 2008 5 12JSCCL XUBIN 稳定性 37 37 4 10 简便性 安全性 经济性 2008 5 12JSCCL XUBIN 试剂盒选择 试剂评价需要有权威的血清考核盘 Panel 进行检测 一般实验室不易从生 检所或临检中心取得 每进一次试剂评价一次也很麻烦 可以通过间接的信息 对试剂进行选择 2008 5 12JSCCL XUBIN 仪器质控 为使仪器保持最佳工作状态应建立维护和校正仪器的标准操作程序 SOP 所要控制的仪器包括移液器 加样枪 水浴箱 温箱 洗板机和酶标仪 移液器 ELI SA 5 100 l 10 水浴箱 1 洗板机 2ul 酶标仪 2008 5 12JSCCL XUBIN 加样器合格标准 水合格标准 2008 5 12JSCCL XUBIN 标本的采集和保存 可用作ELISA的标本十分广泛 体液 如血清 血浆 各种积 液 分泌物 如唾液 和排泻物 如粪便 尿液 均可作为 标本以测定其中的抗原或抗体成分 一般使用血清 标本采集时应尽量避免溶血 因红细胞破裂可释放过氧化物酶 活性物质干扰立可读方法的结果 可造成假阳性 长菌的标本 同样的道理易产生假阳性 抗凝不完全的标本因纤维蛋白元的干扰而造成假阳性 建议尽 量不用抗凝血尤其是用肝素抗凝剂 标本在冰箱中保存时间过长易导致血清IgG聚合 使间接法的试 剂本底加深 一般血清置4 冰箱5天内完成测试 如需保存一 周以上则要 20 冰冻保存 融解时应上下颠倒充分混匀 同时 避免气泡 ELISA的灵敏度 1ng ml水平上 标本间的污染要尽量避免 尤其 不应与生化试验用同一管标本 最起码应先做免疫后做生化 2008 5 12JSCCL XUBIN 附 内外干扰物质的影响分析 溶血脂浊RF 自身抗体AFP 补体肝素EDTA A 0 165 0 200 0 250 0 264 0 186 0 1460 183 0 126 S 0 023 0 016 0 007 0 029 0 010 0 007 0 019 0 013 A对照0 151 0 195 0 1950 1950 116 0 116 0 1160 116 S 0 038 0 008 0 008 0 008 0 018 0 018 0 018 0 018 P 0 05 0 05 0 01 0 01 0 01 0 01 0 01 0 01 0 0 05 0 1 0 15 0 2 0 25 0 3 溶血RFAFP肝素 A 对照 2008 5 12JSCCL XUBIN 分析中质控 ELISA实验的结果受操作影响很大 每个步 骤包括加样 温育 洗涤 显色 酶 标仪读数均 应 认 真负 责才 能充 分发 挥 ELISA的高灵敏 强特异的优点 因此 应建立实验项目的标准操作程序 SOP 2008 5 12JSCCL XUBIN 加样 加样应用微量移液器 加样枪 按规定的量加入微孔板 的1 3处避免加在孔壁上部 并注意不可溅出 不可产 生气泡 每次加样应更换吸嘴 做到一人一吸头 以免发生交 叉污染 干吸头预先在血清中抽吸三次 样本稀释 目的是为了减少非特异性反应 所以一定 要先加稀释液后加样本 特别注意加样后要在微量振 荡器上振荡30秒钟 同时注意防止液体溢出 如后面 操作步骤中加二种以上试剂时均需振荡混匀 如用滴瓶滴加试剂应先将滴瓶摇匀并挤去第一滴有气 泡的试剂后加样 2008 5 12JSCCL XUBIN 温育 抗原抗体反应需要在一定温度下 37 C 经过 一定的时间才能达到反应的平衡点 ELISA边缘效应是由温育形成的 所以温育一般采用 能使反应液温度迅速达到平衡的水浴法 一种放在 水浴箱的隔板上 另一种是放在温箱的湿盒里 水要 浸至板条的1 3处 不可将板条叠加放置 边缘效应 2ng mlHBsAg一步法三种不同温育法的结果 水浴法孵箱法微波法 A中央 S 0 307 0 023 0 282 0 028 0 151 0 059 A周围 S 0 290 0 038 0 357 0 047 0 097 0 038 P 0 05 0 01 2 1换算而来 常用于夹心法 B C O 0 5 N 从抑止率公式换算而来 常用于竟争 中和法 C C O N C C为常数 用于间接法 D C O C P N C为常数 用于间接法 此公式最客 观 但对生产厂家要求很高 阴阳性对照测定值要基本恒定 2008 5 12JSCCL XUBIN 报告方式 定量分析 用已知量的标准品作一系列稀释 ELISA测 定 绘制标准曲线 结果以绝对量或单位表示 ELISA的标准曲线每次都要和待测标本做在同一块板 上 现有的ELISA定量试剂盒标准曲线只有在较窄的浓 度范围内成直线 要得到精确的结果实属不易 因此严禁用定性试剂盒做定量分析 2008 5 12JSCCL XUBIN CLSI NCCLS 有关质控的文件 C24 A3 Statistical Quality Control for Quantitative Measurement Procedures Publication Date 06 23 2006 H26 A Performance Goals for Internal Quality Control Multichannel Publication Date 12 01 1996 H38 P Calibration Quality Control of Automated Hematology Analyzer Publication Date 04 01 1999 ILA18 A2 Specifications for Immunological Testing for Infectious Diseases Publication Date 09 20 2001 ILA23 A Radioimmunoassays and Enzyme Fluorescence and Luminescence Immunoassays Publication Date 04 20 2004 2008 5 12JSCCL XUBIN 2008 5 12JSCCL XUBIN 2008 5 12JSCCL XUBIN 质控血清 人血清基质 分布均匀 无传染性 添加剂和调制物的数量少 瓶间变异小 冻干品其复溶后稳定 到实验室后的有效期应在1年以上 液体血清较优 无商品化质控物时建议自制 2008 5 12JSCCL XUBIN 荧光免疫分析技术 Fluorescence Immunoassay 常见荧光色素 异硫氰酸荧光黄 FITC 最大吸收光谱490 495nm 最大发射 光谱520 530nm 呈明亮的黄绿色荧光 四甲基异硫氰酸罗丹明 TRITC 最大吸收光谱550nm 最大 发射光谱600 620nm 呈现橙红色荧光 用于双标记示踪技术 藻红蛋白 PE 最大吸收光谱490 560nm 最大发射光谱 575nm 呈红色荧光 双标记 7 氨基 4 甲基香豆素 AMC 最大吸收光谱354nm 最大发 射光谱430nm 呈蓝色荧光 双 多标记 镧系元素铕 Eu3 钐 Sm3 铽 Tb3 等 在紫外光 340nm 激发下 发射出高强度荧光 613nm 持续时间 较长 10 1000 s 单 双 多标记 2008 5 12JSCCL XUBIN 荧光免疫分析技术 FIA 常见分析方法 均相技术 用二种荧光素分别标记抗原 抗 体 通过荧光激发传递使一种荧光被吸收 其 吸收量与样品中待测物质成正比 由标准曲线 推算出含量 一般用FITC 罗丹明 TRITC RB200 荧光偏振技术 酶促荧光放大技术 底物标记荧光技术 时间分辨技术 2008 5 12JSCCL XUBIN 酶促荧光放大免疫分析技术 Fluorescence Enzyme Immunoassay 原理 利用具有潜在荧光的底物作为酶标物催化放大 的显示系统 由于累积放大和荧光的高敏感性 使方 法学的灵敏度提高很多 FEIA应用的酶及荧光底物 酶底物产物激发光发射光 G MUG MU 360nm 450nm AP MUP MU 360nm 450nm HRP HPA 二聚体 317nm 414nm 脱氢酶 NADH NAD 450nm 2008 5 12JSCCL XUBIN 时间分辨荧光免疫技术 Time resolved Fluoroimmunoassay 一般荧光技术的缺点是荧光寿命短 背景荧光高 背 景荧光来自散射光 样品池中的胶体颗粒和溶剂分子 引起 和非特异荧光 血清中蛋白质及其他化合物 常见荧光团的荧光寿命 荧光团寿命荧光团寿命 非特异荧光1 10ns 异硫氰酸荧光素 4 5ns 白蛋白4 1ns 丹磺酰氯14ns 球蛋白3 0ns 稀土螯合物10 s 1ms 细胞色素C 3 5ns 2008 5 12JSCCL XUBIN 化学发光免疫技术 Chemiluminescence Immunoassay CLIA 发光物质 生物发光 荧火虫发光是荧光素和荧光素ATP Mg2 O2 的协同作用下产生 max562nm 发光细菌由黄素单核苷酸FMN 氧 直链脂肪醛RCHO 参与在细菌荧光素酶催化的复杂过程 max475 485nm 化学发光 鲁米诺衍生物 max425nm 三苯基咪唑 洛酚碱 max530nm 二甲基吖啶硝酸盐 光泽精 max470nm 三氯苯基草酸盐 TCPO max450nm 2008 5 12JSCCL XUBIN 电化学发光免疫分析 Electro Chemiluminescence Immunoassay ECLIA o 原理在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反 应 包括电化学和化学发光二个过程 o 发光剂 Ru bpy 3 2 三联吡啶钌 和电子供体TPA 三 丙胺 在阳电极表面各失去一个电子 Ru bpy 3 2 被 氧化成三价 成为强氧化剂 TPA被氧化成阳离子自由 基TPA TPA 不稳定 自发失去一个质子 H 形 成自由基TPA 一种强还原剂 TPA 给 Ru bpy 3 3 一个电子使其变成激发态 Ru bpy 3 2 后者极不稳 定 发射一个620nm的光子后回到基态 这一过程在电极表面周而复始的进行 产生许多光 子 使信号加强 2008 5 12JSCCL XUBIN 免疫传感器 Immuno Transducer 免疫传感器由敏感膜 换能器 信号处理三部分组 成 技术的关键是敏感膜的构建和能量的转换 敏感膜的构建 敏感膜由膜基质和敏感材料组成 膜基质 敏感材料的载体 影响膜的寿命 稳定 性 背景信号等 一般有金属材料 钯 铂 锑 无机材料 硅 氧化硅 硫化银 锗 有 机材料 聚苯乙烯 硅橡胶 乙酸纤维素 卵 磷脂 海藻酸 敏感材料 一般采用酶 抗体 受体 核酸片段 2008 5 12JSCCL XUBIN 基因诊断技术 核酸分子杂交 Southern Nouthern 检测103 104拷贝靶分子 靶序列扩增探针扩增信号放大 PCR Q 复制酶系统b DNA TMA 3SR 可检测1 10拷贝靶分子 LCR 2008 5 12JSCCL XUBIN PCR产物分析方法 方法原理定量时间费用 凝胶电泳辨别电泳条带否6 8h 5 杂交印迹 斑点 原位否8 24h 5 10 ELADA AMPLICOR COBAS 否 半4h 35 RFLP 限制酶切多态分析否8 10h 5 SSCP 单链配对多态分析否2天 4 序列分析核苷酸排列分析部分1 2天 10 HDP 异构双倍体分析否8 12h 5 CFLP 裂解片段多态分析否1天 20 NIRCA 非同位素RNA酶裂解分析否1天 50 LiPA线形产物分析部分8h 80 实时分析荧光定量是0 5 1h 15 2008 5 12JSCCL XUBIN 核酸检测要点 灵敏度 50copy ml 特异性 分型 突变 定量的一致性 2008 5 12JSCCL XUBIN 血清标志物用于 疾病诊断 流行病调查 基因检测用于 疗效监控 预后判断 2008 5 12JSCCL XUBIN 2008 5 12JSCCL XUBIN 确认试验 抗原检测 中和试验 抗体检测 RIBA Recombinant Immunoblot Assay 将病毒的各种抗原单独包被在纤维 素膜 尼龙膜等载体上 检测不同抗原的反应 性 或Western Blot 用十二烷基硫酸钠SDS处理的 待检血清经SDS 聚丙烯酰胺凝胶PAGE电泳 使抗原与抗体分离 将抗原转移到硝酸纤维膜 上 加入抗体 再用与酶或同位素标记的二抗 反应 显色或放射自显影判定结果 2008 5 12JSCCL XUBIN 2008 5 12JSCCL XUBIN HBsAg HBeAg HBcAb IgGHBcAg IgMHBeAbHBsAb临床意义 急性HBV感染早期HBV复制活跃 急慢性HBV感染 HBV复制活跃 急慢性HBV感染 HBV复制中跃 急慢性HBV感染 HBV复制低跃 异型慢性乙型肝炎 HBV复制停止或极低 平静的HBV携带状态 HbsAg 极低测不出 HBsAg 抗HBs空白期 HBV既往感染 未产生抗 HBs 抗HBs出现前期 HBV复制低 HBV感染恢复期 HBV感染恢复期 不同亚型 再感染 整合 病后或接种疫苗后获得免疫 2008 5 12JSCCL XUBIN 临 床 诊 断 对 HBsAg 检 测 的 要 求 灵 敏 度 106ng mL 检 测 高 病 毒 携 带 者 特 异 性 1 假 阳 性 结 果 检 测 时 间 1 小 时 2008 5 12JSCCL XUBIN HBV基因型和血清学亚型 以HBsAg的抗原决定族分血清学亚型 共同决定族a 相互排斥的二对决定族 d y w r w又分1 4 r又分q 和q 共有9种亚型 ayw1 ayw2 ayw3 ayw4 ayr adw2 adw4 adrq adrq 只表明包膜蛋白氨基酸差异 有流行病学意义 2008 5 12JSCCL XUBIN HBV基因型和血清学亚型 7 12 58 16 45 核心启动子 1762 1764 前C区 G1896A 183 195 183 183 183 183 183 185 核心 843 842 843 842 832 843 843 845 聚合 酶 前 s2 美洲1193215adw4H 中北美洲100 1083248adw2G 中南美洲16 1193215ayw4 adw2 F 西非27 1183212ayw4E 地中海 俄 美 印度 43 1083182ayw2 ayw3 ayw4 D 亚洲 澳洲 美国 50 1193215ayr adrq adrq adw2 C 亚洲50 1193215adw2 ayw1B 欧美非6 5 1193221adw2 ayw1A 流行地域突变频率表达 前s1 55aa s 226aa 基因 长度 血清型基 因 型 2008 5 12JSCCL XUBIN HBsAg A 急 慢性肝炎的诊断 B 献血员和各种血制品的筛选 C 急性肝炎最早期的预后指标 D 流行病学调查 注意事项 一 HBsAg假阳性 血清分离不佳或肝素抗凝血 二 HBsAg假阴性 感染早期易形成抗原抗体复合物 这种情况需要检测 抗HBc IgM及HBV DNA 多数商用试剂盒检测系统采用的为多克隆抗体检测 HBsAg的adr ayw型 S区的点突变即可导致临界测定值 或阴性结果 由于慢性病毒携带者 低水平HBsAg携带者 或 HBV感染潜伏期 HBsAg浓度低于检测水平的下限 2008 5 12JSCCL XUBIN 抗 HBs A 预后 抗HBs经常在肝炎症状出现后4 6个月出现 一般表示病毒清除 感染开始恢复 近年来的研究发现在抗HBs 阳性患者体内有5 HBV DNA阳性 慢性肝炎中的一些抗HBs阳性者 肝细胞中可检出HBsAg HBeAg HBV DNA 因此尽管自然感染者抗HBs阳转后 大多数预后良好 但也不能过于乐观 应 定期复查 B 流行病学调查 C 疫苗接种对象的筛选和效果观察 接种疫苗后 抗HBs浓度超过10 IU L 表明其具有保护性 加强免疫后4 8周 大于100 IU L 即便以后有所降低 其免 疫力能维持10年以上 注意事项 A 怀疑假阳性结果时要进行中和试验 B 抗HBs经常在HBsAg消失几周至几月后方呈阳性 窗期 极少数在HBsAg消失后即为阳性 同时可检出抗HBs及HBsAg见于以下几种情形 前后或同时感染两种亚型HBV 抗HBs及HBsAg同时检出通常 要持续很久 且浓度均很高 抗HBs假阳性 编码HBsAg的基因变异使得HBsAg抗原性改变 原型抗HBs不 能将其清除 2008 5 12JSCCL XUBIN HBeAg A 评价血清传染性 慢性HBsAg携带者中 HBeAg及HBV DNA 检测可以用来评估其传染危险性 90 HBeAg阳性HBsAg携带 者可以传染给她们的新生儿 而HBeAg阴性或抗HBe阳性的孕 妇中只有10 会传染给婴儿 B 预后 急性期HBeAg的消失通常伴随ALT的降低 预示着疾病 的好转 HBeAg持续阳性超过12周 提示HBV感染趋向慢性