蛋白质的结构和功能.doc

生化学习小组全体成员王品、陈洁琨、顾炎、王飞预祝大家期末考试中取得理想成绩第一章、蛋白质的结构和功能蛋白质重要性具体体现在：1.含量高n 人体固体成分的45%, 脾、肺、肌肉含量均超过80%,n 细菌的50-80%,n 干酵母的46.6%。2.种类繁多 n 生物界蛋白种类估计在10101012数量级n 结构、运动和支持功能：a角蛋白、胶原蛋白、肌动蛋白、微管蛋白等n 催化与代谢调节:酶、胰岛素等n 物质转运和贮存：膜转运蛋白、白蛋白、血红蛋白、铁蛋白等n 信号传导：受体、接头蛋白等n 免疫保护：抗体n 血凝功能：凝血因子等n 基因调控：转录因子等n 细胞增殖、分化、凋亡等：细胞因子、凋亡蛋白酶等第一节 蛋白质的分子组成一、蛋白质的元素组成n 从已获得的蛋白质结晶纯品，进行元素分析，得知蛋白质的元素组成: C H O N S 等。氮元素的平均含约 16%1克氮（N）= 6.25克 蛋白质 是凯氏(KJedahl)定氮法测定蛋白质含量的计算基础。3、氨基酸分类n 非极性疏水性氨基酸（Nonpolar Hydrophobic Amino Acids）极性中性氨基酸（Neutral Polar Amino Acids）碱性氨基酸（Basic Amino Acids）酸性氨基酸（Acidic amino acids）4、其它氨基酸n 蛋白质中存在的修饰氨基酸n 在蛋白质中不存在，但为哺乳动物代谢所必需的氨基酸-非蛋白质氨基酸 n D-氨基酸：抗菌肽等中存在（二）氨基酸的理化性质氨基酸等电点计算： n R基团 为非极性基团或基本不电离的极性基团的氨基酸的等电点是由a-COOH，a-NH2的解离常数的负对数pK1、pK2来决定：pI=(pK1+pK2)/2n 酸性和碱性氨基酸，其等电点由a-COOH，a-NH2和R基团 共同决定，只要写出由酸到碱的电离式，然后取兼性离子两边的pK值的平均值：n 酸性氨基酸： pI=(pK1+pKR)/2 碱性氨基酸： pI=(pK2+pKR)/2n 中性氨基酸的等电点一般在5.0-6.5之间；酸性氨基酸为2.7-3.2，碱性氨基酸为9.5-10.72、紫外吸收 芳香族氨基酸在波长约为280nm处有最大光吸收峰 吸收强度比较：TryTyrPhe 应用：测定生物样品中蛋白质的含量 3、氨基酸的呈色反应 茚三酮反应 原理：印三酮在弱酸性溶液中与氨基酸共热引起氨基酸氧化脱氨、脱羧反应，最后茚三酮与反应产物氨和还原茚三酮发生作用，生成Ruhemanns紫色物质，在570nm有光吸收。应用：适应于氨基酸、多肽和蛋白质的定性和定量分析。氨基酸小结：n 蛋白质氨基酸：20种L- -氨基酸（gly无手性碳原子，脯氨酸为亚氨基酸）n R-侧:非极性、极性中性、酸性和碱性n 理化特性：两性电离、紫外吸收、成色反应 二、肽（peptide）肽的一些要点：1、肽、二肽、寡肽（olygopeptide）、多肽（polypeptide）2、多肽链、氨基末端（N-末端）、羧基末端（C-末端）、氨基酸残基、主链、侧链3、多肽链书写要求： N-端（H表示） C-端（OH表示），如 脑啡肽的书写： H- Tyr. Gly. Gly. Phe. Leu-O或Y.G.G.F.或 酪 .甘 .甘. 苯丙.亮 （三）生物活性肽 指生物体内具有调节功能的肽 ,在调节代谢、生长、发育、繁殖等生命活动中起着重要作用如： n 谷胱甘肽n 多肽类激素：催产素（9肽）、加压素（9肽）、粗肾上腺皮质激素（39肽）n 神经肽：脑啡肽（5肽）、b内啡肽n 抗菌肽：短杆菌肽SGSH氧化还原作用神经肽(neuropeptide):第二节 蛋白质的分子结构n 一级结构（初级结构）空间结构（高级结构）：二、三、四级结构一、蛋白质的一级结构1、定义：蛋白质多肽链中的氨基酸种类、数目和特定排列顺序，还包括肽链数目和二硫键位置等。2、一级结构的重要性：n 蛋白质高级结构和生物功能的基础。遗传病研究（分子病）物种进化研究二、蛋白质的空间结构空间结构 表示方法 空间结构的作用力 二级结构 超二级结构 结构域 三级结构 四级结构n 空间结构的折叠问题二硫键（disulfidebridge）n 两个半胱氨酸的巯基脱氢氧化可产生二硫键n 二硫键可在同一条肽链内或不同肽链之间形成 n 二硫键属共价键，对于维持蛋白质的三级结构 和生物活性起很大作用 氢键（hydrogen bond）定义：负电性很强的原子（如氧或氮）和已与氧或氮共价结合的氢原子相互吸引，这种作用称为氢键氢键作用：n对于二级结构（主链构象）的稳定起主要作用n 对于维系蛋白质三、四级结构也起着一定的作用 非极性键/疏水键(hydrophobicinteraction)n 定义：指疏水基团在水溶液中常避开水而聚集在一起的那种力量，或指非极性基团受到水分子的排斥相互聚集在一起的作用力 对蛋白质三、四级结构的形成和稳定起主要作用离子键/盐键（electrostaticinteractionorsaltbridge）n 定义：指正负离子电荷间的静电引力n 盐键对蛋白质三、四级结构的形成和稳定起重要作用凡德华力（Vanderwaalsinteraction）n 定义：原子间在一定空间距离上的相互作用力（吸引力和排斥力的总称）（三）蛋白质的二级结构1、蛋白质的二级结构概述：n 定义：多肽链主链以肽平面为单位折叠形成局部肽段的空间排布方式。n 类型：-螺旋、-折叠、-转角和无规卷曲。n 肽键和肽键平面的特性肽键平面或酰胺平面要点：n 肽键具有双键性质,不能自由转动，与肽键相关的6个原子-C1-CO-NH-C2-约束于一个平面，称为肽平面(peptideplane)，此平面上的6个原子：称为肽单元(peptideunit)；n 肽平面是反式构形，即2个C在肽键的异侧n Ca与肽键的N、C原子是单键，可旋转,决定了相邻肽平面的相对空间位置。3、-螺旋(-helix)n 定义：蛋白质分子中局部肽链的肽平面通过碳原子旋转，使碳链主链沿中心轴盘曲成稳定的右手螺旋构象n 螺旋式重主要的二级结构形式，存在于大多数的蛋白质中，如角蛋白（皮肤、毛发、指甲、和角）全部是螺旋-螺旋的要点：n 一般为右手螺旋（j=-57o,y=-47o）；n 每个螺旋圈含3.6个氨基酸残基，螺距为0.54nm;又称133.6螺旋n 螺旋圈之间通过氢键（aa1的C=O和aa4的-NH之间）维持结构稳定;n R侧链位于螺旋外侧，其大小、形状及电荷等是影响此结构形成的主要因素。R侧链对螺旋的影响n 多肽链上连续出现带同种电荷基团的氨基酸残基,(如Lys，或Asp，或Glu)，不能形成稳定的螺旋。如多聚Lys、多聚Glu。n Gly在肽中连续存在时，不易形成螺旋。n R基大（如Ile）不易形成螺旋n Pro、脯氨酸中止螺旋。n R基较小，且不带电荷的氨基酸利于螺旋的形成。如多聚丙氨酸在pH7的水溶液中自发卷曲成螺旋。4、-片层(-pleatedsheet)定义：多肽链的局部肽段，以肽键平面为单位折叠成锯齿状的一种较伸展结构。-片层要点：n 多肽链较伸展,遇C发生折叠,R侧链交错位于锯齿状结构上下方；n 两条或多条肽链片段平行排列，靠链间氢键稳定构象；n 两条肽链的走向可以是顺向平行或反向平行或混合排列。5、 -转角 (-turn)n-转角：多肽链中的某局部出现180度回折处形成的特定构象。n一般由四个氨基酸组成，常见氨基酸：Pro,Gly,Asp,Asn,Trp。 以氢键维持稳定，第1个氨基酸残基的C=O与第4个残基的N-H之间形成氢键。n 赋予蛋白质较大的构象柔性，常位于三维结构的表面，有些具有特定功能。6、无规则卷曲(random coil) n不规则卷曲：没有明确规律性的那部分肽段的结构。但这些“无规则卷曲”也象其他二级结构那样是由明确而稳定的结构。n作用：赋予蛋白质较大的构象柔性，常构成蛋白质的特定功能部位。如许多钙结合蛋白中结合钙离子的EF手结构的中央环 （四）蛋白质的超二级结构：模体（motif）n 概念：多肽链中一些临近的二级结构单元，相互作用，形成有规则的二级结构组合。1973年RossmanMG首先提出的。n 作用：属于二级结构与三级结构之间的结构层次，是结构域和三级结构的“建筑模块(module)”；有些有特定功能。n 常见类型：aa、bb、bab(五)结构域（domain）n 定义：多肽链上二级结构单元和超二级结构模体以特定方式作用组合，在蛋白质分子中形成一个或多个可明显区分的局部空间结构区域，常具有特定的功能。有时也称功能域（functionaldomain）。n 一般说，功能域是蛋白质分子中独立存在的功能单位。功能域可以是一个结构域，也可以是由两个或两个以上结构域组成。结构域的特征：n 结构域50-350个氨基酸残基构成，与整个蛋白质分子是共价相连，蛋白质分子可以有多个相同或不同结构域的组合；n 多结构域蛋白质的结构域常有它对应的基因外显子编码；n 是多肽链的独立折叠单位，结构域之间常有一段柔性的肽链连接（铰链区，hinge），是结构域容易发生相对运动；n 结构域承担一定的生物学功能，几个结构域协同作用，可体现出蛋白质的总体功能。例如，脱氢酶类的多肽主链有两个结构域，一个为NAD+结合结构域，一个是起催化作用的结构域，两者组合成脱氢酶的脱氢功能区。n 结构域之间有一裂沟（cleft）或口袋状，常常是活性部位。（六）蛋白质的三级结构tertiarystructuren 定义：指整条多肽链所有原子（主链和侧链）三维空间排列，也即在二级结构基础上进一步盘曲或折叠所形成的立体结构。n 作用力：疏水键、离子键、氢键、凡德华力和二硫键等。n 意义：多肽链的三级结构与蛋白质功能和性质密切相关。球状蛋白三级结构特征：n 多层次模块化装配：多种二级结构元件超二级结构（模体）结构域三级结构；n 密度不均：大部分紧密球状或椭球状实体中有低密度松散区（b-转角、无规则卷曲、loop等），这是蛋白质构象易发生变化的部位；n 疏内亲外：大部分球状蛋白疏水侧链埋藏在分子内部，亲水侧链暴露在分子表面是最稳定结构（膜内蛋白例外），隐藏疏水残基避免与水接触是安排二级结构单元形成特定三级结构的主要动力；n 球状蛋白表面常有一个空穴（裂沟、凹槽或口袋），空穴周围分布着许多疏水侧链，为底物等发生化学反应营造一个疏水环境（低介电区）。空穴大小约能容纳12各小分子配体或大分子的一部分。（七）蛋白质的四级结构quaternarystructuren 定义：有两条或两条以上独立三级结构的多肽链彼此通过次级键结合而形成的空间结构。n 亚基（subunit）：四级结构蛋白中，具有独立三级结构的多肽链。故四级结构实际是亚基的立体排列和相互作用。n 作用力：疏水键、离子键、氢键四级缔合在结构和功能上的优越性（八）蛋白质的折叠问题n 一级结构蛋白质的空间结构基础，蛋白质趋向形成一种能量最低，结构最稳定的三级结构，这是蛋白质能折叠的动力；n 细胞内高稠密介质，以及狭窄空间使得伸展的和部分折叠的蛋白质在高浓度时倾向于聚集；无法自我迅速完成正确折叠n 两大类蛋白质参与蛋白质折叠：n 蛋白质二硫键异构酶（proteindisulfideisomerase,PDI）:加速蛋白质折叠过程中形成正确配对二硫键；n 分子伴侣（molecularchaperone）:为蛋白质折叠提供一个有利的折叠环境，与未折叠肽段的疏水部分可逆结合，防止聚集和错误折叠，诱导正确折叠。如热休克蛋白（heatshockprotein）等三、蛋白质的分类1、组成分类：n 单纯蛋白：清蛋白、球蛋白、组蛋白、精蛋白、硬蛋白和植物谷蛋白等。n 结合蛋白：单纯蛋白+非蛋白（辅基）核蛋白、糖蛋白、脂蛋白、磷蛋白、色蛋白和金属蛋白等2、溶解度分类：可溶性蛋白、醇溶蛋白和不溶性蛋白3、分子形状分类：球状蛋白和纤维蛋白第三节 蛋白质结构与功能的关系一、一级结构与功能关系（一）一级结构是空间结构的基础 上世纪60年代，C.Anfinsen对核糖核酸酶（RNase）空间构象拆分和复原实验：（二）一级结构与功能关系： 一级结构不同，功能不同；一级结构相似，空间构象和功能也相似（三）一级结构的种属差异与分子进化n 同源蛋白质：在不同的生物体内行使相同或相似功能的蛋白质。 如：血红蛋白在不同的脊椎动物中都具有输送氧气的功能，细胞色素在所有的生物中都是电子传递链的组分。n 通过比较同源蛋白质的氨基酸序列的差异可以研究不同物种间的亲源关系和进化。 亲源关系越远，同源蛋白的氨基酸顺序差异就越大；反之，就越小。1. 胰岛素（insulin）n 胰岛素51个氨基酸残基， AB链由二硫键相连，胰岛素由前体分子胰岛素原加工而来；n 有24个氨基酸残基位置始终不变：AB链上6个Cys 不变，其余18个氨基酸多数为非极性侧链，对稳定蛋白质的空间结构起重要作用。n 其它可变氨基酸对稳定蛋白质的空间结构作用不大，但对免疫反应起作用。n 猪与人接近，而狗则与人不同，因此可用猪的胰岛素治疗人的糖尿病。（四）蛋白质一级结构的突变-分子病n 基因突变引起的某个功能蛋白的某一个或几个氨基酸残基发生了遗传性替代从而导致整个分子的三维结构发生改变，功能部分或全部丧失。n 镰刀形红细胞贫血现是由于血红蛋白发生了遗传突变引起的b链第6位的aa线基由正常的Glu变成了疏水性的Val HbA H2N-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys-COOH HbS H2N-Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys-COOH二、蛋白质空间结构与功能的关系n 蛋白质空间结构决定蛋白质功能；n 蛋白质空间结构相似其功能也相似；n 蛋白质空间结构改变导致蛋白质功能改变，严重时导致疾病-蛋白质构象病：n 肌红蛋白(myoglobin，Mb) 153个氨基酸残基和一个血红素辅基; 8个螺旋结构: A、B、C、D、E、F、G、Hn 血红蛋白（homoglubin,Hb） 四个亚基构成（2a、2b）， a链含141个氨基酸残基、b146个氨基酸残基；亚基间通过8个离子键连接 （二）Mb和Hb的氧解离曲线：蛋白构象与氧合关系n Mb：矩形双曲线，表示易于氧结合；n Hb：S型曲线，表示在低氧分压时结合较难，亚基与O2结合呈现正协同效应（positive cooperativity），表明Hb的四个亚基与O2结合的亲和力不同，第一个结合较难，但一旦结合后，促进第二、第三亚基与O2结合，而后者又大大促进第四个亚基与O2结合。n氧分子（配体）与Hb亚基结合后引起亚基构象变化，称为变构效应（allosteric effect） （三）构象病n 构象病：蛋白质一级结构没有改变，而由蛋白质的构象发生改变而影响其功能，严重时导致疾病。如疯牛病、hentington 舞蹈病等n 疯牛病：由朊病毒蛋白（prion protein,PrP）引起的一组人和动物神经退行性疾病，具有传染性、遗传性和散发的特点。n 机理：一、蛋白质的理化性质（一）蛋白质的两性解离和等点电n 蛋白质的两性电离(amphipathic ionization)：电离基团、溶液pH值（二）蛋白质的胶体性1、胶体性：分子颗粒 1-100nm，布朗运动、光散射现象、不能透过半透膜等；2、亲水胶体的稳定因素：水化层、同性电荷3、亲水胶体的生理意义：细胞原生质体、细胞形状、弹性、粘度等（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固1、蛋白质的变性（denaturation）u 吴宪的蛋白质变性学说：天然蛋白质分子是由多肽链所组成，分子的规则性紧密结构是由分子中的次级键维持，它很容易被物理和化学力量所破坏。变性作用是天然蛋白质分子结构的松解，即由原来有规则、紧密结构变为开链的无规则、松散结构。这种变性学说可以解释有关蛋白质变性的事实，至今仍为人们所承认。 u 定义：某些物理或化学因素使蛋白质分子特定的空间构象改变或破坏，导致其生物活性丧失和理化性质改变（溶解度降低、粘度增加、易被降解）。u 类型：可逆变性和不可逆变性机理：破坏二硫键和次级键2、蛋白质的沉淀（preciptation）u 定义：在某些因素作用，蛋白质聚集并从溶液中析出的现象。u 蛋白质沉淀的条件：除去稳定蛋白质胶体的两个因素：水化膜和同种电荷。u 蛋白质沉淀方法：（1）盐析 salting outu 盐析：在蛋白质溶液中加入大量的中性盐（硫酸铵、硫酸钠）以破坏蛋白质胶体稳定性而使其析出。u 分段盐析：不同蛋白质溶解度不同，盐析时需要的盐溶度不同，故可用不断提高盐浓度的方法使不同的蛋白质从混合物溶液中分别沉淀出来。如： 半饱和硫酸铵-沉淀血清中的球蛋白 饱和硫酸铵-沉淀血清中的白蛋白 盐析沉淀的蛋白质通常不变性、 （2）有机溶剂沉淀蛋白质u 破坏蛋白质颗粒水化膜，等点电时蛋白沉淀u 常温下易变性（3）重金属沉淀蛋白质u pHpI时，生成重金属盐沉淀，常变性（4）生物碱试剂（单宁酸、苦味酸、钼酸、钨酸、磷钨酸、磷钼酸和三氯乙酸）沉淀蛋白质u pHpI时，生成不溶性盐沉淀；u 制备无蛋白滤液（5）加热凝固 变性 松散不规则 聚集凝块 少量盐可促进蛋白质加热凝固，如制豆腐。（四）蛋白质的呈色反应1、茚三酮反应：蛋白质与茚三酮加热可产生蓝紫色，多肽、氨基酸和伯胺类有同样反应。2、双缩脲反应：蛋白质在碱性溶液中与硫酸铜反应呈紫红色。是肽键反应。用于蛋白定量3、与酚试剂反应：碱性溶液中蛋白质的色氨酸和酪氨酸残基与酚试剂（磷钨酸-磷钼酸）反应呈兰色。灵敏度高，用于微量蛋白定量（五）蛋白质紫外吸收n 大部分蛋白质均含带苯核的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，苯核在紫外280nm显示最大光吸收。利用它可测定溶液中蛋白质含量。 二、 蛋白质的分离纯化（一）蛋白质分离纯化一般程序：n 前处理（pretreatment）：对生物材料的处理，把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态和生物活性。 剔除结缔组织和脂肪等、脱脂、破碎组织细胞n 粗分离(rough fractionation):获得蛋白提取液后，选用一套适当方法，将所要蛋白质与其他杂分子分离开来和浓缩体积。 选用方法要简便、处理量大，既能去除杂蛋白又能浓缩蛋白溶液。如盐析、有机溶剂分级分离等，体积过大可选用超滤、凝胶过滤、冷冻真空干燥等n 细分离（fine fractionation）:样品的进一步纯化。一般使用层析方法：凝胶过滤、离子交换层析吸附层细、亲和层析等，这些方法一般规模小，但分辨率高。（二） 蛋白质的分离纯化方法1、根据溶解度：u 等电点沉淀和pH控制 u 盐析u 有机溶剂沉淀2、根据分子大小：u 透析和超滤：u 离心法（超速离心和密度梯度离心）u 分子筛层析（凝胶过滤）3、根据电荷不同u 电泳 按支持物分：簿膜电泳、凝胶电泳； 按目的分：制备电泳、分析电泳u 离子交换层析 阴离子交换层析和阳离子交换层析4、根据吸附特性：吸附层析5、根据配体特异性亲和性：亲和层析 三、多肽链中氨基酸顺序分析u 氨基酸组成分析：完全水解、离子交换层析分离；u 肽链二个末端氨基酸分析（DNP法、丹酰氯法）；u 大片段分解成小片段：选择性酶解、离子交换层析分离u 小片段测序：Edman降解法u 完整的肽链氨基酸顺序： 根据肽段重叠部分将小肽段拼接出完整的序列第 二章 核酸的结构与功能Structure and Function of Nucleic Acid一 核酸的化学组成及一级结构核酸单核苷酸 （B-R-P）磷酸（P）核苷（B-R）戊糖（R）碱基（B）D-核糖D-2-脱氧核糖嘌呤(purine)嘧啶(pyrimidine) 腺嘌呤 (adenine, A)鸟嘌呤 (guanine, G)胞嘧啶 (cytosine, C)胸腺嘧啶(thymine,T) 尿嘧啶(uracil,U)*碱基的性质：n 酮式 烯醇式；氨基 亚氨基 共轭双键，260nm的紫外吸收较强二核酸RNADNA组成磷酸磷酸磷酸戊糖D-核糖D-2-脱氧核糖嘌呤碱腺（A） 鸟（G）腺（A） 鸟（G）嘧啶碱胞（C） 尿（U）胞（C） 胸腺（T）分布细胞质中细胞核中功能参与遗传信息的表达遗传信息的储存和携带者核苷（nucleoside）核苷酸(nucleotide)组成碱基 + 核糖核苷 + 磷酸连接方式糖苷键(glycosidic bond)嘌呤环上的N-9或嘧啶环上的N-1与糖的C-1 以糖苷键相连。磷酸酯键糖环上所有游离羟基（核糖的C-2、 C-3、C-5及脱氧核糖的C-3、C-5 ）均能与磷酸发生酯化结合。生物体内多数核苷酸是5-核苷酸，即糖环上的C-5 与磷酸酯化三DNA的空间结构与功能RNA的空间结构与功能mRNAtRNArRNA一级结构DNA分子中核苷酸的排列顺序及连接方式5帽子结构 5非翻译区 编码区 3非翻译区 3多聚A尾稀有碱基：DHU 、T、y、mG和 mA等二级结构双螺旋模型：反向平行、双链互补右手螺旋，并有大沟和小沟双螺旋结构稳定力：横向是碱基对氢键；纵向是碱基平面间的疏水堆积力三叶草形：DHU环、反密码环（有反密码子） 、Ty环和3端氨基酸臂三级结构超螺旋结构倒“L”型功能以基因的形式荷载遗传信息，并作为基因复制和转录的模板转录核内DNA遗传信息的碱基排列顺序，并携带至细胞质，指导蛋白质合成中的氨基酸排列顺序活化，搬运氨基酸到核糖体，参与蛋白质的翻译参与组成核蛋白体，作为蛋白质合成的场所四 核酸一般的理化性质n 核酸的高分子特性n 260 nm特征吸收峰n 核酸的两性性质及等电点: DNA的等电点为44.5，RNA的等电点为22.5*关于DNA1 DNA变性：在某些理化因素作用下，核酸分子互补双链之间氢键断裂，使双螺旋结构松散变成单链的过程影响因素：温度、酸碱、有机溶剂、尿素等。2 增色效应（hyperchromic effect）： 核酸在加热变性过程中260nm波长吸收值（A260）增加。它反映了核酸双链的解链程度。3 解链曲线（meilting curve）：T/A260关系曲线解链温度（melting temperature,Tm）:核酸加温变性过程中， A260达到最大值一半时的温度。在Tm时，核酸分子内50%的双链结构被解开。4 DNA的复性（renaturation）又称退火（annealing）:变性DNA在一定条件下如温度逐步恢复到生理范围内，两条互补链重新恢复天然的双螺旋构象。复性条件：温度：缓慢下降至比Tm值低25oC；瞬间降至零度称淬火（quenching）DNA浓度：浓度较高，复性较快DNA片段大小和复杂程度（最长的不重复序列的长度）溶液的离子强度、pH等5减色效应6分子杂交：不同来源的核酸经变性和复性的过程，其中一些不同的核苷酸单链由于存在局部碱基互补片段，而在复性时形成杂化双链（heteroduplex），此过程称分子杂交。五 核酸酶（Nucleases） 核酸水解酶核酸外切酶（exonuclese）核酸内切酶（endonuclease）DNA酶（DNase）5端核酸外切酶限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）RNA酶（RNase）3端核酸外切酶第三章酶酶的概念：酶是由生物细胞合成的以蛋白质为主要成分，对底物起高效催化作用的生物催化剂。还有一类具有催化作用的核酸-核酶（ribozyme）或脱氧核酶（deoxyribozyme）酶的重要性：第一节 酶的结构与功能1、单体酶(Monomeric enzyme):由一条或多条共价相连的肽链组成的酶分子。如:牛胰RNase 124a.a 单链鸡卵清溶菌酶 129a.a 单链胰凝乳蛋白酶 三条肽链2、寡聚酶(oligomeric enzyme):由多个相同亚基或不同亚基以非共价键连接组成的酶。如：苹果脱胱氢酶（鼠肝），2个相同的亚基琥珀酸脱氢酶（牛心），2个亚基3、多酶复合体(multienzyme system)由两个或两个以上的酶，靠非共价键结合而成，其中每一个酶催化一个反应，所有反应依次进行，构成一个代谢途径或代谢途径的一部分。如：大肠杆菌丙酮酸脱氢酶复合体由三种酶组成： 丙酮酸脱氢酶（二聚体），共12个酶 二氢硫辛酸转乙酰基酶（单体），共24个 二氢硫辛酸脱氢酶（二聚体），共6个酶总分子量：560万4、多功能酶(multifuctional enzyme)一条多肽链上含有两种或两种以上催化活性的酶，往往是进化过程中基因融合的产物。如:动物的中脂肪酸合成酶为一条250kD的多肽链，具有7种酶的活性：乙酰转移酶、转酰基酶、酮脂酰合成酶、酮脂酰还原酶、水化酶、烯脂酰还原酶、硫酯酶二、酶的分子组成(一) 金属离子为辅助因子的酶q 金属酶（metalloenzyme）：羧肽酶（Zn+2）和黄嘌呤氧化酶（Mo+6）；q 金属激活酶（metal activated enzyme）：各种激酶和核酸酶（Mg2+）；q 金属离子的作用：参与三元络合物起稳定酶蛋白构象和参与酶活性中心起多种催化作用。E-M-S: 丙酮酸激酶： E- Mg 2+-磷酸烯醇式丙酮酸E-S-M: 以ATP为底物的激酶： E-ATP-Mg 2+M-E-S：柠檬酸裂合酶2、小分子有机化合物的辅助因子q 辅基（ prothetic group ）: 与酶蛋白共价结合, 不容易被透析除去，如黄素（FAD和FMN）和生物素等辅基；q 辅酶（ coenzyme ）:与酶蛋白以非共价键疏松结合, 容易被透析除去，如TPP、NAD等；q 辅基或辅酶的作用: 传递电子、氢或基团。三、酶分子的结构：（一）酶的活性中心：1、活性中心概念：能结合并催化一定底物使之发生化学变化的位于酶分子上特定空间结构区域，该区域包含结合基团和催化基团，辅助因子参与酶的活性中心。2、酶活性的必需基团（essential group）（1）概念：间接或直接与酶催化活性相关的多肽链上某些氨基酸残基的功能基团。（2）类型： 酶活性中心必需基团： 结合基团(binding group),结合部位决定酶的专一性， 催化基团(catalytic group) 催化部位决定酶所催化反应的性质。 活性中心外必需基团：-S-S-一些酶活性中心的氨基酸残基酶 残基总数 活性中心残基牛胰核糖核酸酶 124 His12, His119, Lys41溶菌酶 129 Asp52, Glu35牛胰凝乳蛋白酶 245 His57, Asp102,Ser195牛胰蛋白酶 238 His46, Asp90, Ser183木瓜蛋白酶 212 Cys25, His159弹性蛋白酶 240 His45, Asp93, Ser188枯草杆菌蛋白酶 275 His46, Ser221碳酸酐酶 258 His93-Zn-His95His117（二）酶活性调控部位 （Regulatory site）q 概念：酶分子中存在着一些可以与其他分子或基团发生共价和非共价结合的部位，从而引起酶分子空间构象的变化，对酶起激活或抑制作用。q 特点：酶活性调节部位一般位于酶活性中心域外的区域，或位于独立的结构域，或亚基q 意义：对酶活性进行快速调节，以适应生命活动的需要第二节 酶促反应的特点与机制q 一般催化剂的特点酶催化作用的特点酶催化作用的机制一、一般催化剂的特点q 催化效率高反应前后质量不变催化热力学允许的反应加速可逆反应的进程，不改变反应的平衡点二、酶促反应的特点：q 酶的高度催化效率（本质）酶的催化具有高度特异性酶的催化受调控酶促反应无副反应q 酶促反应的条件温和（一）酶的高度催化效率1、酶与一般催化剂催化效率的比较要高 107-1013 倍2、酶高度催化效率的机理（1）反应过程：例如：过氧化氢分解反应2H2O2 2H2O +O2无催化剂 75312 J（18000 cal）胶态钯 48953 J （11700 cal ）过氧化氢酶 8368 J （2000 cal ）1、概念：q 活化能（activation energy）: 反应物分子从初态转变为过渡态（活化态）分子所需要的能量。q 活化分子: 含有较高能量并能起反应的那些分子。2、加快反应速度的方法：增加过渡态的分子数q 供给能量，如加温、光照等q 降低活化能（二）酶的特异性(specificity)：1、定义：酶只能催化一种或一类底物,或一种化学键，发生一定的化学变化, 生成一定的产物。2、类型：q 绝对特异性（absolute specificity）：作用于一种底物进行专一反应生成一种特定产物。如：q 相对特异性(relative specificity)：作用于一类化合物或一种化学键。如脂肪酶 、磷酸酯酶和蛋白水解酶等。q 立体异构特异性(sterospecificity)：只能催化一种立体异构体进行反应，或产物是一种立体异构体。如：L-乳酸脱氢酶：作用于L-乳酸（光学异构）延胡索酸酶：作用于反式丁烯二酸（几何异构）（三）酶的催化受调控1、酶活性的调节：变构调节、共价修饰和酶原激活2、代谢物对酶活性的抑制和激活3、酶含量的调节：诱导、阻遏和降解4、酶和代谢物的区域化分布5、多酶体系、多功能酶和同工酶等二、 酶促反应的机制（一）酶底物复合物（中间产物学说）1、中间产物学说：E+S ES E+P（三）酶催化作用的机制3、多元催化 (multielement catalysis) 多元催化：多个基元催化形式的协同作用。一般包括酸-碱催化，共价催化（亲核催化, 亲电子催化）等。如凝乳蛋白酶：Ser-195亲核催化， His-57碱催化等； 酸-碱催化：通过暂时提供（或接受）一个质子以稳定过渡态达到催化反应的目的；共价催化（亲核催化, 亲电子催化）：通过催化剂与底物的共价键结合，形成过渡态来加速反应。共价催化具有亲核、亲电过程。 亲核催化：分别带有多电子的原子如O、S和N，可以提供电子去攻击底物上相对带正电子的原子（如羰基碳），即所谓的亲核攻击。 亲电催化：是由亲电试剂(具有接受电子对的原子)引起的催化反应,是亲核催化的反过程第三节 酶促反应动力学概念： 酶促反应动力学：定量研究酶促反应速度及其影响因素。 反应速度：单位时间内底物减少或产物增加的速度，常用初速度来衡量。影响酶促反应速度的因素： 底物浓度S 酶浓度E 反应温度 pH 值 抑制剂 激活剂(二)米-曼氏方程（Michaelis-Menten equation）1、米-曼氏方程解释：当SKm时，v Vmax, 即S而v不变2、米-曼氏方程成立条件： 初速度为标准 单底物， S E 稳态（steady state）3、推导方程:游离酶浓度=E-ESES生成速度=k1（E-ES）SES分解速度=k2ES+ k3ES当稳态时： ES生成速度=ES分解速度k1（E-ES）S= k2ES+ k3ES（E-ES）S k2+ k3ES k1ES=因v=k3ES,当所有E被S饱和时，即达到最大速度，此时ES=E，Vmax=k3 E代入上式：（三） Km与 Vmax的意义1、Km值等于最大反应速度一半时的底物浓度；2、 k2k3 时Km可用来表示酶对底物的亲和力大小， Km与酶对底物亲和力大小成反比；3、 Km值是酶的特征性常数之一， Km值范围在10-6 10-2mol/L4、 Vmax是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度呈正比；5、 k3为酶的转换数(kcat,turnover number)：当酶被底物充分饱和时，单位时间内每个酶分子（或活性中心）催化底物转变为产物的分子数。110 4/s（四）Km值与 Vmax值测定1、双倒数作图法又称林-贝氏作图法(Lineweaver-Burk)（1934）1 = Km 1 + 1V Vmax S Vmax二、酶浓度对反应速度的影响 反应速度与酶浓度成正比：当SE,式中Km可以忽略不计。五、抑制剂对酶促反应速度的影响抑制作用: 直接或间接地影响酶的活性中心,使酶活性降低或丧失。抑制剂：凡能降低酶活性而不引起酶蛋白变性的物质。一、不可逆抑制（irreversible inhibition） 抑制剂与酶的必需基团以牢固的共价键结合, 使酶丧失活性, 不能用透析超滤等物理方法除去抑制剂使酶恢复活性.二、可逆抑制(reversible inhibition) 抑制剂与酶以非共价键疏松结合引起酶活性的降低活丧失, 结合是可逆的, 能够通过透析、超滤等物理方法使酶恢复活性。可逆抑制类型：竞争性抑制 (competitive inhibition)非竞争性抑制（non-competitive inhibition）反竞争性抑制（uncompetitive inhibition）(一)竞争性抑制(competitive inhibition) 概念 竞争性抑制剂的结构与底物结构相似，与底物竞争同一种酶的活性中心,从而影响E与S的结合。竞争性抑制的特点： I与S分子结构相似；Vmax 不变，表观Km增大； 抑制程度取决于I与E的亲和力 ，以及I和S的相对浓度比例。（二）非竞争性抑制 （non-competitive inhibition） 概念 抑制剂与酶分子活性中心以外的部位结合而抑制酶活性，I和S与酶结合不存在竞争关系。 非竞争性抑制作用过程： 非竞争性抑制的特点：1、I与S分子结构不同；2Vmax 减小，表观Km不变；3、抑制程度取决于I大小。三、反竞争性抑制（uncompetitive inhibition） 概念 抑制剂仅与酶和底物的中间复合物结合而抑制酶活性。 反竞争性抑制作用过程： 反竞争性抑制的特点1、I与S分子结构不同,I只与ES结合2Vmax 和表观Km都减小；3、抑制程度取决于I和ES二者的浓度六、激活剂对酶促反应速度的影响1、激活剂: 凡能使酶由无活性变为有活性或使酶活性增加的物质。如： 金属离子： Mg 2+ 、 K+、 Mn2+ 阴离子： Cl- 有机物： 胆汁酸盐2、分类： 必需激活剂 Mg 2+ 对己糖激酶 非必需激活剂 Cl- 对淀粉酶七、酶活性测定 酶活性：酶的催化能力，以酶促反应速度来衡量。 酶活性单位：指酶促反应在单位时间（s,min,h）内生成一定量（mg, g, mol）的产物或消耗一定量的底物所需的酶量。 一个国际单位（IU ,1976年）：在特定条件下, 1 min内使底物转变 1mol所需的酶量； 一个催量（kat）：在特定条件下,1 Sec内使底物转变 1mol所需的酶量1I.U.=16.6710 -9 kat=16.67 10 -3 mKat；1Kat =610 7 I.U. 酶比活(specific activity)：每毫克蛋白所含有的每活力单位数。第四节 酶的调节一、酶活性的调节二、酶量的调节三、同工酶一、酶活性的调节：1、共价调节：不可逆共价调节 酶原的激活可逆共价调节 酶的共价修饰2、非共价调节酶的变构调节（一）酶原与酶原激活 酶原（zymogen）: 指酶在细胞内合成或初分泌时无活性的酶的前体。 酶原激活:酶原在特定条件下，被水解一个或几个特定肽段致使酶分子构象发生重塑，从而形成或暴露酶的活性中心，表现出酶活性的过程。 酶原与酶原激活的生理意义：1、保护组织器官本身免受酶的水解破坏；2、保证酶在特定时空发挥催化作用；3、酶原可视作酶的储存形式。（二）酶的共价修饰 酶的共价修饰（covalent modification）或化学修饰（chemical modification）在其他酶的催化下，一些酶分子肽链上特定基团与某种化学基团发生可逆性共价结合，从而改变酶的活性。 共价修饰基团类型：磷酸化和去磷酸化、乙酰化和去乙酰化、甲基化和去甲基化、腺苷化和去腺苷化等。（三）变构酶与变构调节变构酶相关概念： 变构调节（allosteric regulation）:一些代谢物小分子可与某些酶的活性中心以外的某些部位可逆性非共价结合，使酶分子结构发生改变，从而影响酶的活性。 变构酶（allosteric enzyme）变构部位（allosteric site）变构效应剂（allosteric effector） 变构激活效应和变构抑制效应 协同效应（cooperativity）:正协同效应和负协同效应二、酶含量的调节（一）酶蛋白合成的诱导和阻遏-转录水平1、诱导作用（induction）和诱导剂（inducer）2、阻遏作用（repression）和辅阻遏剂（corepressor）（二）酶蛋白降解的调控1、无选择性蛋白降解：溶酶体2、选择性蛋白降解：ATP+泛肽+泛肽结合降解酶三、同工酶1、定义：是指同一种属中由不同基因或等位基因编码的多肽链所组成的单体、纯聚体或杂合体，其分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同而能催化相同反应的一组酶。2、同工酶的产生：3、同工酶的作用：人体心肝和骨骼肌LDH同工酶谱组织器官 LDH1 LDH2 LDH3 LDH4 LDH5（ 占总 LDH活性的百分比）心 3570 2845 216 06 05肝 08 210 333 627 308骨骼肌 110 418 838 936 4097正常血清 27.12.8 34.7 4.3 20.9 2.4 11.7 3.3 57 2.9第五节 酶的命名与分类一、酶的命名 习惯命名：由发现者命名，常以底物名、反应性质以及酶的来源命名； 系统命名（1961年国际酶学委员会确定