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血清学实验 临床微生物学检验 实验 医学检验技术教研室 1 血清学诊断 是指用已知细菌的特异性抗原检测患者血清中相应抗体的方法 以诊断感染性疾病 用已知抗原检测血清中的特异性抗体 血清学鉴定 即采用含有已知特异性抗体的免疫血清 诊断血清 与分离培养出的未知纯种细菌或标本中的抗原进行血清学反应 以确定病原菌的种或型 用已知抗体鉴定未知的细菌或标本中的抗原 2 微生物抗原成分 细菌抗原成分 菌体抗原 革兰氏阴性菌的菌体抗原称O抗原 脂多糖蛋白质的复合物 鞭毛抗原称为H抗原 表面抗原 不同细菌的表抗原名称不同 大肠杆菌的表面抗原称为封套抗原或K抗原 肺炎双球菌的叫荚膜抗原 伤寒沙门氏菌的表面抗原称为Vi抗原 3 细菌抗原 细菌的各种抗原 4 抗原抗体反应 抗原抗体反应 antigen antibodyreaction 是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应 可发生于体内 invivo 也可发生于体外 invitro 体内反应可介导吞噬 溶菌 杀菌 中和毒素等作用 体外反应则根据抗原的物理性状 抗体的类型及参与反应的介质 例如电解质 补体 固相载体等 不同 可出现凝集反应 沉淀反应 补体参与的反应及中和反应等各种不同的反应类型 因抗体主要存在于血清中 在抗原或抗体的检测中多采用血清作试验 所以体外抗原抗体反应亦称为血清反应 erologicreaction 5 抗原抗体反应条件 抗原抗体 3 环境因素 1 电介质 0 85 NaCI 2 温度 37或56 3 pH值 7 0 4 振荡 适当的机械振 5 反应时间 6 抗原抗体反应的特点 特异性和交叉性若两种抗原之间含有部分共同抗原时 则发生交叉反应 亲缘关系越近 交叉反应的程度也越高 反应的可逆性抗原与抗体的结合为分子表面的结合 结合的适宜温度为0 40 pH在4 0 9 0范围内 如温度超过60 或pH降到3 0以下 或加入解离剂台硫氰化钾 尿素等 则抗原抗体复合物又可重新解离 解离后的抗原或抗体性质不改变 7 抗原抗体反应特点 最适比和带现象只有抗原与抗体呈适当比例时 才可出现可见的结合反应 当抗原过多或抗体过多 则抗原抗体的结合不能形成大的复合物 因而抑制可见反应的出现 这一现象称为带现象 抗体过多出现的抑制现象称前带现象 而抗原过多出现的抑制现象称后带现象 为了克服带现象 在进行血清学试验时 需将抗原或抗体作适当稀释 8 抗原抗体反应特点 反应的二阶段性结合阶段 反应发生快 几秒钟至几分钟 反应阶段 较慢 需几分钟 几十分钟或更长时间 9 凝集反应 颗粒性抗原 如细菌 红血球等 或吸附在乳胶 白陶土 离子交换树脂和红细胞的抗原与其特异性抗体结合后 在有电介质存在时 凝聚成肉眼可见的凝集小块 凝集原 凝集素 抗原抗体反应类型 凝集反应 10 血清学鉴定 掌握细菌的血清学鉴定法 实验目的 11 实验原理 根据抗原抗体反应具有高度特异性的特点 用已知抗体来检测未知抗原 细菌 12 实验材料 1 菌种待检细菌2 试剂多价沙门菌O A F 诊断血清3 其他载玻片 13 沙门氏菌诊断血清 11种 14 O抗原 H抗原和Vi抗原 O抗原 是一种沙门氏菌细胞壁表面的耐热多糖抗原 100 2 5h不被破坏 它的特异性依赖于细胞壁脂多糖侧链多糖的组成 H抗原 是一种蛋白质性鞭毛抗原 共有63种 60 加热30 60min及酒精作用均可破坏其抗原性 但能抵抗甲醛 Vi抗原 是一种N 乙酰 D 半乳糖胺糖醛酸聚合物 60 加热1h即破坏其凝集性和免疫原性 15 沙门氏菌的主要抗原组成 O抗原 至少58种 含相同抗原组分归为一组 引起人类疾病的沙门菌大多数在A F组 H抗原 分为 相 相以a b c等表示 相以1 2 3等表示 Vi抗原 抗原性弱 不稳定 可阻止O抗原与其相应抗体的凝集反应 16 沙门氏菌菌型的表示方法 血清型以数字和字母表示 例如 查考夫曼 怀特沙门氏菌属抗原表 鼠伤寒沙门氏菌 O抗 1 4 5 12 第 相H抗原 i 第 相H抗原 1 2 它的血清型应表示为 鼠伤寒沙门氏菌 1 4 5 12 i 1 2 内的O抗原可能存在或不存在 内的H抗原可能是罕见的 正常情况下一般不存在 17 沙门氏菌的血清鉴定的方法 用O H和Vi因子血清与待检的菌株作玻片凝聚试验 1 先用O因子血清确定菌株所属的O群及O抗原的各种成分 2 再用H因子血清检查其第1相和第2相的H抗原以确定血清型 3 必要时还要用Vi血清检查 目前有3种 18 1 先用A F多价O血清检查 确定菌株是否在A F六个O群的范围内 2 再用代表六个O群的O因子血清检查 即O2 A O4 B O7 C1 O8 C2 O9 D O3 10 E O11 F 3 确定O群之后 分别用HA a b c d i z10 z29 HB HC HD四种多价H血清检查 4 用3 所确定的多价H血清所包括的所有H因子血清逐一检查定为第1相或第2相H抗原 5 检出第1相H抗原而未检出第2相H抗原 或检出第2相H抗原而未检出第1相H抗原的 要用位相变异的方法再检查其另一个相 单相菌不必作位相变异检查 6 综合O和H因子血清以及Vi因子血清的检查结果 按照考夫曼 怀特沙门氏菌属抗原表解判定沙门氏菌的菌型 沙门氏菌的血清型鉴定步骤 19 实验方法 20 先用A F和Vi血清检测 根据结果再进行其他鉴定 注意 21 结果判断 22 沙门氏菌属国内常见菌型诊断抗原表 23 注意事项 1 生理盐水端应不出现凝集颗粒 2 沙门菌Vi抗原存在时可阻止O抗原与相应抗体发生凝集 故在做玻片凝集时应加注意 需事先加热破坏Vi抗原 O抗原才得以与相应的O诊断血清发生凝集 24 血清学实验进程 先鉴定A F和Vi 根据结果再进行其他鉴定 25 沙门氏菌属常见菌型诊断抗原表 26 位相变异的解释 将一个双相沙门氏菌的菌株在琼脂平板上划线分离 所得的菌落中 有的有第1相H抗原 有的则有第2相H抗原 若任意挑取一个菌落在培养基上多次传代 其后代又可出现部分是第1相而另一部分是第2相的菌落 这种两个相的H抗原可以交相产生的现象称为位相变异 双相菌初次分离时 单个菌落的纯培养往往只有一个相H抗原 鉴别时常只能检出一个相 而测不出另一相 此时 可用已知相血清诱导的位相变异试验来获得未知的另一个相H抗原 27 位相变异试验的方法 简易平板法1 配制0 7 0 8 的半固体琼脂培养基 然后倾注平板烘干表面水分 2 在平板内滴上一滴已知的第1相或第2相血清因子 并作好标记 3 待血清吸收到琼脂内 在标记部位的中间点种已知第1相或第2相的新鲜待检菌株 4 培养后 其已知相细菌的动力受到抑制 解离出另一相的细菌 并向周围蔓延生长 形成一个大的菌落 5 检查其菌落的边缘