苹果霉菌的分离与纯化.doc

从发霉的红薯上和酸败腐烂的苹果上挑取霉变物用沙堡琼脂培养基28培养2-3天，分离出几个真菌菌株。将分离株重新进行平板划线分离，挑取单菌落表面的少许孢子用马铃薯葡萄糖琼脂培养基进行载片小培养，经28培养23天于低倍镜下观察，通过菌丝和孢子对分离株进行鉴定。观察到簇生在分生孢子梗的顶端的呈帚状分枝的分生孢子和有隔菌丝，可鉴定为青霉类菌；观察到分生孢子梗上呈轮状着生、具有3个分隔、弯曲的孢子，可鉴定为弯孢霉类菌；观察到单细胞的芽殖孢子，并通过进一步的酵母菌生理生化测定，可鉴定为酵母菌。2 材料2.1 病料发了霉的红薯、酸败腐烂的苹果2.2 培养基2.2.1 沙堡琼脂培养基成分：蛋白胨10克、麦芽糖40克、琼脂20克、蒸馏水1000毫升2.2.2 马铃薯葡萄糖琼脂培养基成分：马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂20克、蒸馏水1000毫升2.2.3 保存琼脂培养基成分：蛋白胨10克、琼脂20克、蒸馏水1000毫升 2.3 器材无菌室、手提式高压蒸汽灭菌锅、电炉、天平、铁架台、灭菌培养皿、锥形瓶、漏斗、试管、烧杯、胶头滴管、石蕊试纸、接种环、酒精灯、量筒、玻璃棒、纱布、滤纸、试管塞、报纸、扎绳、标签、温箱、冰箱、盖玻片、载玻片、显微镜、杜氏管3 方法3.1 真菌的分离培养3.1.1 实验的准备 沙堡琼脂培养基的制备：用天平称取蛋白胨10克、麦芽糖40克、琼脂20克，用量筒量取蒸馏水1000毫升置烧杯中混匀，在电炉上加热熔化，加热过程中不断用玻璃棒搅拌，调整PH值至5.4，倒入锥形瓶中，115灭菌20分钟，倾注平板，冷却1。 无菌室、接种箱的清洁：用酒精棉球将接种箱的内部全部擦洗干净，放入试管架、酒精灯、标签、接种环、笔、火柴等实验用具放入接种箱内，密封接种箱。依次打开接种箱与无菌室的紫外灯，紫外线灭菌20分钟。3.1.2 划线分离培养：在酒精灯火焰下进行以下操作 （1）从发霉的红薯上和酸败腐烂的苹果上挑取霉变物用28培养2-3天，分离出几个真菌菌株。将分离株重新进行平板划线分离，挑取单菌落表面的少许孢子用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）进行载片小培养，经28培养2-3天于低倍镜下观察，通过菌丝和孢子对分离株进行鉴定。 （2）左手持皿，用左手的拇指、食指及中指将皿盖揭开20度左右的角度（角度越小越好，以免空气中的细菌进入皿中将培养基污染）。划线前先将接种环稍稍弯曲，这样易和平皿内琼脂面平行，不致划破培养基。 （3）右手持接种环，将上述霉变物分区划线接种于沙堡琼脂培养基平板中，划完前一个区域后将接种环在火焰上灼烧灭菌，冷却后与前一区域的最后一两条折线接触划出第二区域，依次类推，共划三到四个区域。划线中不宜过多的重复旧线，以免形成菌苔。 （4） 接种完毕，在皿底上作好日期，平皿倒扣，置28培养2-3天。 （5） 将分离培养得到的几个分离株用沙堡琼脂培养基重新进行平板划线分离，以得到纯的单一的菌落。 3.2 真菌的载片培养（小培养） 3.2.1 实验的准备马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）的制备：将新鲜的马铃薯洗净、去皮，（注意：发霉、变绿的不要使用。）切成薄片或蚕豆大小的方块，称取所需的重量，倒入锅内，加水1000mL煮沸半小时左右，至马铃薯酥而不烂为止，用四层纱布过滤，然后将事先称好的琼脂加到上述滤液中，用小火加热，使之慢慢融化，并用玻棒不断搅拌，以免烧焦锅底。再加入事先用温水溶化的糖溶液，用二层纱布过滤。测定pH值，用1mol/L的NaOH或HCl调至pH为5.56.5之间，最后加水补足至1000mL2。无菌室、接种箱的清洁：同2.1.1。无菌水的制备：取5-6mL蒸馏水装入10mL小试管中，塞上棉塞，用报纸包装好，115高压灭菌20分钟。3.2.2 实验的操作取直径7cm左右的圆形滤纸一张，铺放于一个直径9cm的平皿底部，上放一个U形玻棒，其上再平放一张干净的载玻片与一张盖玻片，盖好平皿盖，进行灭菌3。为防止培养过程中培养基干燥，特在滤纸上滴加无菌水3-4mL，挑取真菌孢子接入盛有灭菌水的试管中，震荡试管制成孢子悬液。用灭菌滴管吸取灭菌后熔化的固体培养基少许，滴于上述灭菌平皿内的载玻片中央，并用接种环将孢子悬液接种在培养基上，然后盖上盖玻片，用镊子轻轻压一下，最后盖上平皿盖,即成为载片小培养4。3.3 真菌的保存3.3.1 保存琼脂培养基的制备 取蛋白胨10克、琼脂20克、蒸馏水1000毫升至烧杯中混匀，在电炉上加热融化，调整PH值至5.4，分装试管，115灭菌20分钟，摆成斜面5。无菌室及接种箱的清洁：同2.1.13.3.2 实验操作将划线分离培养282-3天的平板从温箱取出，放入无菌室中进行以下的操作：在无菌室中靠近酒精火焰处，从平板培养基上选取可疑菌落，用接种环轻轻刮取其表面的少许孢子，拉出接种环立即伸入斜面培养基上，勿碰及斜面和管壁，直达斜面底部从斜面底部开始划曲线，向上至斜面顶端为止，管口通过火焰灭菌，将棉塞塞好。接种完毕，接种环通过火焰灭菌后放下接种棒，最后在斜面管壁上注明日期，置28温箱中培养2-3天，后置4冰箱中保存6。 3.4 酵母菌的鉴定生化试验3.4.1 糖发酵试验用12.5%豆芽汁配制成2%糖溶液（棉子糖为4%）分装杜氏管。测定发酵的容器以杜氏管为主，凡能发酵某种糖则在杜氏管内小管之顶部应能看到有一定量的CO2气泡7。具体操作：A.将豆芽汁分装杜氏小管，每管1.2ml，15磅灭菌15分钟。B.把各种糖用灭菌蒸馏水分别配成10%的糖溶液，煮沸15分钟，稍冷，用无菌吸管吸取一定糖液，分装于杜氏管，使糖浓度达到2%（棉子糖4%），即成为糖类发酵基础培养基。C.欲鉴定的新培养菌株，接种于发酵管，25-28培养，每天观察结果。一般观察2-3天即可，凡不发酵者或弱发酵者，可延长观察至10天，因半乳糖酶是适应酶，故观察发酵半乳糖可延长2周至1个月8。3.4.2 同化碳源试验A.菌液制备：将酵母菌制成菌悬液（1ml无菌生理盐水接入少许约一接种环的新培养的酵母菌制成悬液）。B.浇制平板：将此悬液全部倒入经溶化并冷却至45左右的20ml基础培养基中，倒入培养皿，使菌体在培养基中混和均匀，静止，凝固后在28把培养皿倒置几小时，使表面不致太湿。C.点样：然后在培养皿底部做上碳源名称的标记，分别用无菌不锈钢匙或无菌药匙，按标记加糖少许（约米粒大），如果结果不明显可于第二天再补加一次糖。D.观察：观察结果时以葡萄糖作对照，一般是25-28培养1-2天观察结果，凡能同化者在所加碳源的周围形成生长圈。凡生长缓慢的酵母或是在测半乳糖同化时，可适当采用液体培养法，即在含某种碳源的液体培养集中接入酵母，25-28培养1-2周，以含葡萄糖的液体培养基作对照，观察酵母生长情况，是否更加浑浊或形成环、岛等，必要时可延长观察查到三周9。 4 结果与分析4.1 真菌的培养性状观察4.1.1 真菌在固体培养基上的生长表现酵母菌在固体培养基上的生长表现：酵母菌在固体培养基上菌落呈油脂状或腊脂状，表面光滑、湿润、粘稠，有的表面呈粉粒状，粗糙或皱褶，菌落边缘整齐、缺损或带丝状。菌落颜色有乳白色、黄色和红色等。 霉菌在固体培养基上的生长表现：将不同霉菌在固体培养基上培养2-3天，可见霉菌菌落有绒毛状、絮状、绳索状等。菌落大小依种而异，有的能扩展到整个固体培养基，有的有一定局限性（直径1-2或更小），很多霉菌的孢子和菌丝能产生色素，致使菌落表面、背面甚至培养基呈现不同颜色，如黄色、绿色、黑色、橙色等。4.1.2 真菌的载片培养的形态观察酵母菌的载片小培养的形态观察：类似于细胞，多数为单细胞，一般为椭圆形、圆形或圆柱形。酵母细胞比细胞大，有些酵母与其子细胞连接形成链状，形成假菌丝。酵母菌以无丝分裂为主，主要为裂殖、芽殖。霉菌在小培养上的生长镜检表现：菌体由许多分枝或不分枝的菌丝构成，许多菌丝交织在一起组成菌丝体。菌丝在显微镜下呈管状，多数为有隔菌丝，菌丝被分隔成多个细胞，每个细胞含一个或多个细胞核，孢子为分生孢子。4.2 图片分析4.2.1 图1 产黄青霉的菌落 图2 产黄青霉的菌丝和孢子 28生长速较快，1-2天长出菌落，10-12天直径为3-5。初为白色，后变为蓝或灰绿色。菌落的质地呈致密绒状，菌落表面有明显的放射状沟纹，边缘为白色，菌落是成簇的菌丝体，无特殊气味，反面亮黄至暗黄色（结果见图1）。 显微镜下低倍观察：菌丝为有隔菌丝，菌丝被分隔成多个细胞，产生相当明确的分散的帚状枝分生孢子链，分生孢子为椭圆形（结果见图2）。 结合以上菌落形态及小培养的培养性状观察，可鉴定为产黄青霉。4.2.2 图3 新月弯孢霉的菌落 图4 新月弯孢霉的菌丝和孢子 28不如青霉类生长速度快，3天长出菌落，颜色为暗灰绿色，背面为蓝黑色。菌落质地为棉絮状，菌落为成簇的菌丝体，无特殊气味（结果见图3）。显微镜下低倍观察，菌丝分隔，多分枝，分生孢子梗直立。孢子在分生孢子梗上呈轮状着生，具3个分隔弯曲（结果见图4）。 结合以上菌落形态及小培养的培养性状观察，可鉴定为弯孢霉属的新月弯孢霉。4.2.3 图5 酵母菌的菌落 图6 酵母菌的细胞 28培养3天，菌落呈乳白色，有光泽，平坦，边缘整齐，表面湿润，粘稠。菌落外观与细菌菌落相似，比细菌菌落大、厚、圆，不透明，有酒精味，易被接种针挑起（结果见图5）。显微镜下低倍观察，生殖方式为芽殖，单细胞，呈圆形、卵圆形或腊肠形（结果见图6）。结合以上菌落形态及小培养的培养性状观察，可初步鉴定为酵母菌。4.3 酵母菌的生理生化测定 测定结果如下表所示： 萄糖 麦芽糖 半乳糖 乳糖 蔗糖 蜜二糖 D-木糖 D-阿拉伯糖 L-阿拉伯糖 发酵 同化 对于初步鉴定为啤酒酵母菌的菌落，进一步采用发酵和同化试验进行确定。由以上一系列的生理生化指标，可鉴定为啤酒酵母菌。5 讨论 根据本论文所做实验结合本人所查阅资料，现将真菌的基本培养条件及特征，霉菌、酵母菌的繁殖方式，真菌实验研究的意义等讨论如下： 本研究以沙保为分离培养基，明确了真菌的最佳培养条件，如培养基配方为葡萄糖20g/l,琼脂10g/l;而土豆培养基在小培养时更利于孢子的形成,所以得到了比较多的菌丝和孢子量;为防止菌落连成片，小培养也应在观察到孢子后及时拍照并放入冰箱待用;在沙氏培养基中培养的时间为2-3d,在沙保培养基中培养的时间为2-3d,在小培养中培养的时间为1-2d,培养温度为28+1,该研究成本低,操作简便,高效率,对于真菌的分离鉴定和菌种库的建立具有一定的指导意义.今后需要进一步研究不同的真菌在培养基的特征性表现,以便于真菌的快速鉴定。 真菌的培养条件：真菌对营养要求不高，比较容易培养，喜酸性，最适PH为5-10；多数为嗜温菌，最适温度为22-28，少数致病真菌在37生长良好，个别真菌在0生长；需在高湿条件下才能生长，多数在相对湿度95%-100%条件下生长良好；真菌生长速度比细菌慢，培养数日后才形成典型菌落。 真菌菌落特征：1）霉菌菌落：由菌丝体和孢子组成，菌落比细菌和放线菌大，有的甚至布满整个培养基表面，菌落较疏松成绒毛或絮状，因霉菌的基内菌丝在培养基内生长，故其菌落不易被接种针挑起；因霉菌孢子带有各种颜色，使其菌落表面也呈现黄、绿、青、橙、黑等颜色。2）酵母菌型菌落：由单细胞的酵母菌组成。其外观与细菌相似。呈圆形，表面湿润光滑不透明，易被接种环挑起；多数菌落呈乳白色，少数为红色；长时间培养的菌落表面呈皱缩状。3）类酵母型菌落：外观与酵母菌落相似，但此菌落可向下生长，这是因为芽生孢子与母细胞连接形成的假菌丝伸入培养基内造成的，如白色念珠菌的菌落。 酵母菌以芽殖、裂殖、掷孢子方式进行繁殖。霉菌以无性繁殖（芽孢子、节孢子、厚垣孢子、孢子囊孢子、分生孢子）和有性繁殖（卵孢子、接合孢子、子囊孢子）进行繁殖。 另外，研究真菌有重要的意义，真菌这类微生物与人类的生产和生活有着密切的关系：1）真菌的工业利用：几乎遍及人类生活的各种工业部门，如食品、纺织、制革、造纸、医药、洗涤、饲料以及石油发酵和三废利用等，但真菌也引起相应部门的产品如食品、纺织品、皮革制品、电工器材等的腐蚀霉变。2）真菌与农业生产：真菌侵入植物体引起的植物病害，往往使农作物遭受重大损失甚至颗粒无收，如小麦锈病等。真菌对植物也有其有益的作用，有些真菌与植物的根结合在一起形成菌根，结成共生和互利的复合体；同时真菌在其生长发育过程中还能分泌生长素促进植物的生长。3）真菌与医疗卫生：真菌药材历史悠久应用