结核性胸液T细胞组成和细胞因子表达的探讨[1].pdf

本文为国家自然科学基金资助项目 30872300 中山大学中山医学院免疫学教研室 热带病防治研究教育部重点 实验室 广州 510080 作者简介 劳穗华 1970 年 男 副主任医师 主要从事结核内科 的临床诊疗工作 通讯作者及指导教师 吴长有 1955 年 男 博士 教授 博士生导 师 主要从事疫苗和免疫记忆方面的研究 E 2mail Changyou wu yahoo com doi 10 3969 j issn 1000 2484X 2010 09 018 实用临床免疫学 结核性胸液 T 细胞组成和细胞因子表达的探讨 劳穗华 李 丽 李 琴 张贤兰 乔 丹 付笑迎 吴长有 广州市胸科医院 广州 510095 中国图书分类号 R392 文献标识码 A 文章编号 1000 2484X 2010 0920839 203 摘 要 目的 探讨结核性胸液中 CD3 T CD3 CD4 T CD3 CD8 T细胞和 CD4 CD8 比值及细胞因子表达 方法 分离外周血单个核细胞和胸液细胞 流式细胞仪检测 CD3 CD3 CD4 CD3 CD8 和 CD4 CD8 比值 ELISA法检测胸液上清 中 IFN2C IL 22和 TNF 2A的水平 流式细胞仪检测 CD3 CD4 和 CD3 CD8 T 细胞 Th1 细胞因子 IL 22 TNF 2A IFN 2C 的产生 结 果 与外周血相比 胸液细胞 CD3 CD4 T和 CD3 T 细胞比例显著增加 ELIS A 结果表明 胸液上清中存在大量 Th1 型细胞因 子 流式细胞仪分析结果表明 IL 22 TNF 2A和 IFN 2C 主要由 CD3 CD4 T 细胞产生 而 CD3 CD8 T细胞较少或不分泌细胞因 子 结论 结核病人胸液中 CD3 和 CD3 CD4 T 细胞比例增加 胸液中存在大量Th1细胞因子 且主要来源于 CD3 CD4 T 细 胞亚群 可能在抗结核免疫中发挥重要作用 关键词 结核性胸膜炎 细胞因子 T 细胞 Phenotypic and functional characteristics of T cells in tuberculosis pleurisy L AO Sui2 Hua LI Li LI Qin Z HANG Xian2 Lan QIAO Dan FU Xiao2Y ing WU Chang2Y ou Chest Hospital o f Guangzhou Guangzhou 510095 China Abstract Objective To elucidate the phenotypic and functional characteristics of CD3 CD4 and CD3 CD8 T in pleural fluid of patientswith tuberculous pleurisy Methods PB MCs and PFCs were isolated The frequency of CD3 CD3 CD4 CD3 CD8 T cells and the ratio of CD4 CD8 in PFCs were analyzed by FACS The concentration of IFN2C IL 22 and TNF 2A in the pleural fluid were analyzed by ELIS A Production of IFN 2C IL 22 and TNF 2Aby CD3 CD4 and CD3 CD8 T cells was detected byFACS following stimulation with BCG Results Higher frequencies of CD3 CD4 T cells and CD4 T CD8 T ratiowere demonstrated inPFCs when comparedwith PB MCs from nor2 mal donors andTB patients ELISA analysis demonstrated that significantly high levels of IFN 2C and TNF 2Awere detected in pleural fluid Fur2 ther analysis byFAC S indicated that IL 22 TNF 2A and IFN 2C were predominantly secreted by CD3 CD4 T cells but not by CD3 CD8 T cells Conclusion The frequencies of CD3 and CD3 CD4 T cells are increased in PFCs Large amounts of Th1 cytokines are detected which are produced by CD3 CD4 T cells and might play important roles against TB infection Key words Tuberculous pleurisy Cytokines T lymphocytes 据报道 目前受结核杆菌感染的人口占世界人 口的三分之一 其中 5 10 的感染者将成为结 核病患者 1 由于多重耐药结核菌株的出现 HIV 感染及卡介苗预防效果的不佳导致结核病疫情下降 缓慢 2 结核性胸液是由结核分枝杆菌引起的迟发 型超敏反应 多数病人能够自愈 此外 胸腔穿刺抽 液是治疗渗出性结核性胸膜炎的常规手段 因此结 核病人胸液是研究结核病人局部免疫应答状态的良 好模型 但目前有关结核发病局部抗原特异性细胞 免疫功能仍不十分清楚 以往的研究表明 细胞免 疫包括 CD4 CD8 和 C DT 细胞等在结核防御保护效 应中发挥着十分重要的作用 3 4 为此 本研究从 感染局部获取炎症反应细胞及胸液上清 检测其胸 液中 T 淋巴细胞细胞的组成特征和细胞因子的水 平 以期为深入了解结核局部免疫应答状态 全身性 结核的诊断和免疫干预治疗提供理论指导 1 材料与方法 1 1 主要试剂和仪器 1 1 1 主 要试剂 Pecy7 标记的抗 CD8 抗体 839 劳穗华等 结核性胸液 T细胞组成和细胞因子表达的探讨 第9 期 Pecy72CD8 APC2CD3 APC2IL 22 PerCP2CD4 FITC2 CD8 FITC2IFN2C PE2TNF2A以及相匹配的对照抗体 IL22 TNF2A和 IFN2CELISA 检测试剂盒均购自 BD Pharmingen 公司 Becton Dickinson Pharmingen USA 卡介苗 BCG 购自成都生物制品研究所 RPMI1640 培养液 谷氨酰胺 二巯基乙醇和 Hank s 液购自 Gibco公司 USA Brefeldin 2A BFA 布雷菲德霉素 A 为 Sigma 公司产品 胎牛血清购自杭州四季青公 司 聚糖泛影葡胺 Ficoll2Hypaque 购自上海华精生 物科技公司 1 1 2 主要仪器 流式细胞仪 FACS Calibur 购 于美国 BD 公司 酶联免疫检测仪 Elx800 Univer2 salMicrop late Reader Bio2TEK instrument 1NC 离心 机Centrifuge 5810R Effendorf Germany 1 2 正常人和结核病人外周血单个核细胞 PBM2 Cs 及结核性渗出性胸膜炎病人胸液细胞 PFCs 的 分离 抽取 21 例正常人和 24 例结核病人外周血 肝素抗凝 Hank s 液等体积稀释 用 Ficoll 进行密度 梯度离心 获取外周血单个核细胞并充分洗涤 RP2 MI 1640完全培养基调整细胞浓度为 2 106ml 1 19 例结核性胸膜炎病人诊断符合文献标准 5 所有 患者病史不超过 3 个月 均有肺结核临床表现 如发 热 盗汗 乏力 咳嗽等 B 超提示有中量以上的胸腔 积液 胸液引流后 经病原学或病理学诊断明确 收集病人胸液 离心后留取胸液上清冻存至250e ELISA 检测上清中细胞因子的水平 细胞沉淀加入 红细胞裂解液作用 5 分钟 Hank s 液洗 2 遍获取胸 液细胞 1 3 ELISA 检测法 操作步骤参照试剂盒说明书 IL22和 TNF2A试剂盒检测灵敏度为 7 8 pg ml IFN2 C试剂盒检测灵敏度为 9 4 pg ml 1 4 细胞染色 细胞染色按照常规染色方法进行 操作 细胞内细胞因子的染色 细胞培养结束后 PBS 洗 2遍 加入 4 多聚甲醛室温固定 8 分钟 PBS 再次洗 2 遍 之后加入 200 Ll 含有通 透剂皂 碱 Saponin 的缓冲液作用 2 小时 再加入特异性胞内 标记单抗 4e 避光反应 30 分钟 洗 2 遍后重悬细 胞 应用流式细胞仪 BD FACSCalibur 检测 并用 FlowJo 软件分析 1 5 统计学分析 本文数据用 x s 表示 进行单 因素 t 检验分析 显著性检验标准为 P 0 05 2 结果 2 1 结核病人外周血和结核性胸膜炎病人胸液中 淋巴细胞亚群的检测 分离正常人和结核病人外周 血单个核细胞及胸液细胞 直接进行表面分子染色 由图 1A 可以看出 正常人和病人外周血单个核细 胞中 CD3 CD4 T 细胞亚群的比率没有差别 胸液 细胞中 CD3 CD4 T 细胞亚群的百分率显著增加 P 0 001 结核病人外周血中 CD3 CD8 T 细胞 亚群较正常人降低 图 1B 经 T 淋巴细胞百分率 及 CD4 CD8 T 细胞的比值的分析 图 1C 和 D 表明胸液细胞中 CD3 T 淋巴细胞较外周血明显增 加 P 0 001 正常人和病人外周血中 CD3 T 淋巴 细胞比率没有差别 病人的外周血中 CD4 CD8 T 比值较正常人外周血增加 P 0 01 胸液细胞中 CD4 CD8 比值较正常人增加显著 P 0 001 2 2 结核性胸膜炎病人胸液中 Th1 细胞因子水平 ELISA法检测19 21位结核性胸膜炎病人胸液上 图 1 胸液细胞和外周血 T 淋巴细胞亚群的比较 Fig 1 Comparison of T lymphocyte subpopulation from PBM2 Cs and PFCs frequency of CD3 CD4 T cells Note A Frequency ofCD3 CD8 T cells B Frequency of CD3 T cells C Ratio of CD4 CD8 cells D In PBMCs from normal donors TB patients and PFCs from patients with tuberculosis pleurisy 图 2 结核性胸膜炎病人胸液上清液中 IFN 2C IL22 和 TNF 2 A的水平 Fig 2 Concentration of IFN 2C IL22 and TNF 2A in pleural fluid from patients with tuberculosis pleurisy 840 中国免疫学杂志 2010年第 26卷 图3 BCG 诱导结核性胸膜炎病人胸液中 CD3 CD4 和 CD3 CD8 细胞分泌 Th1 细胞因子水平 Fig 3 Production of Th1 cytokines by CD3 CD4 and CD3 CD8 T cells in pleural fluid cells from patients with tuberculosis pleurisy after stimulation with BCG 清中Th1 型细胞因子 结果表明 图 2 胸液上清中 IFN2C约为 1 000 pg ml IL 22 水平几乎低于检测下 限 TNF2A的均值约 100 pg ml 2 3 结核性胸膜炎病人胸液中细胞因子来源 进 一步利用胞内因子染色法分析细胞因子来源 分离 胸液细胞 加入 BCG和共刺激分子 培养 8 小时后 染色 CD3 CD4 CD8 以及胞内细胞因子 结果表明 图 3 IFN2C TNF2A和 IL 22 主要是由 CD3 CD4 T 细胞产生 而 CD3 CD8 T 细胞较少或无细胞因子 的表达 3 讨论 以往研究表明 结核保护性免疫应答主要由 CD4 T 细胞介导 6 我们利用结核性胸膜炎胸液 的模型 从淋巴细胞亚群的组成和细胞因子的水平 进行了探讨 有助于进一步了解结核病人的局部免 疫应答状态 我们首先比较了正常人 结核病人外 周血单个核细胞和胸液细胞的 T 淋巴细胞亚群 发 现胸液细胞中 CD3 T 的比例较外周血增高 其中 CD3 CD4 T 细胞亚群比例显著增加 CD4 CD8 比值在结核病人的外周血和胸液细胞中都高于正常 人 结核性胸液中高水平的 CD3 CD4 T 细胞比例 和CD4 CD8 比值 提示在结核分枝杆菌感染引起 的细胞免疫应答中 CD4 T 细胞发挥重要作用 为了进一步了解感染局部的免疫状态 我们还 检测了胸液上清中的细胞因子水平 我们发现结核 性胸液中 IFN2C和 TNF2A水平较高 而基本检测不 到 IL22 以往也有研究表明 IFN2C在结核性胸液中 的含量明显高于非结核性胸液 因此 它可以作为诊 断结核性胸液特异性指标 7 通常反映 T 细胞应 答的最基本特征就是其强度 即抗原特异性细胞或 效应性细胞的频率 例如 IFN2C产生细胞 及细胞因 子分泌水平 8 为此 为了阐明细胞因子的来源 我 们利用流式细胞术检测了 BCG 刺激后 胸液细胞中 CD3 CD4 和 CD3 CD8 T 细胞亚群细胞因子的产 生情况 发现 IFN2C TNF2A 和 IL22 主要由 CD3 CD4 T 产生 而 CD3 CD8 T 细胞基本不产生细胞 因子 综上所述 我们的研究表明了结核性胸液局部 CD3 和 CD3 CD4 T 细胞比例增加 结核性胸液中 存在大量 IFN2C和TNF2A 且主要来源于 CD3 CD4 T 细胞 提示效应 记忆性 CD3 CD4 T 细胞在局部 结核免疫应答中发挥的重要保护作用 结核性胸液 局部高水平的 CD3 CD4 T 细胞频率和 Th1 细胞因 子分泌水平 可能是结核性胸膜炎病人自愈的重要 原因 进一步了解结核性胸液局部不同细胞亚群的 表型和功能 将为全身性结核的诊断 治疗 预后判 断及新型疫苗的研发提供理论指导 4 参考文献 1 WHO Report Anon Global tuberculosis control M Switzerland World health organ uation genera 2001 181 2183 2 范艳莹 杨利桃 李 丽 人外周血卡介苗 BCG 特异性中央型和 效应型记忆 CD4 T 细胞的特征 J 中国免疫学杂志 2006 22 5 403 2406 3 Kaufmann S H Cole ST Mizrahi V et al Mycobacterium tuberculosis and the host response J J Exp Med 2