重金属胁迫下紫茎泽兰生理生化变化研究.doc

目录摘要- 1 -关键词- 2 -1 前言- 2 -2 实验材料和方法- 3 -2.1 材料- 3 -2.2 测定方法- 3 -2.2.1 叶绿素含量的测定- 3 -2.2.2蛋白质含量的测定- 4 -2.2.3细胞质膜电导率的测定- 5 -2.2.4丙二醛含量的测定- 5 -3 结果与分析- 6 -3.1 Pb、Cd对紫茎泽兰叶片叶绿素含量的影响- 6 -3.2 Pb、Cd对紫茎泽兰叶片蛋白质含量的影响- 6 -3.3 Pb、Cd对紫茎泽兰叶片细胞质膜透性影响- 7 -3.4 Pb、Cd对紫茎泽兰叶片丙二醛含量的影响- 8 -4 讨论- 8 -参考文献- 9 - 重金属胁迫下紫茎泽兰生理生化变化研究黄开心（云南民族大学化学与生物技术学院，中国 昆明，650031）摘要 紫茎泽兰作为一种世界性杂草，对环境具有较强的适应性和耐性。本研究采用盆栽试验研究了紫茎泽兰在重金属Pb、Cd不同浓度的胁迫下生长的生理生化变化。结果表明：(1)不论是低浓度还是高浓度的Pb和Cd胁迫下，紫茎泽兰的叶绿素含量、蛋白质含量都明显低于对照；（2）虽然在重金属胁迫下紫茎泽兰受到胁迫，抵抗力下降，但是分析细胞膜透性和MDA含量的变化可知，下降趋势并不明显；（3）Pb对紫茎泽兰抑制具有剂量效应，但Cd胁迫下紫茎泽兰在中浓度时却呈现一个峰值。由此可知，紫茎泽兰对重金属并不存在抗性，紫茎泽兰的入侵也具有一定的区域性。关键词 紫茎泽兰；重金属；抗性Physiological Change of the Crofton Weed in the Stress of Heavy MetalHuang kaixin(Chemical and bio-technology college of Yunnan university of nationalities, Kunming China,650031)Abstract Crofton Weed as a kind of weed in all world is stronger suitability and endurance for new environment. In this study we research physiological change of the Crofton Weed in the stress of heavy metal Pb and Cd with planting in the pot. The result showed that, (1) Regardless low and high concentration of Pb and Cd, chlorophyll and protein content of crofton weed are lower than control obviously; (2) Although crofton weed is drop its resistanc for stress of heavy metal, this trend is not strong as according to analysis of electric conductivity and MDA content; (3) Inhibition of crofton weed about Pb is dose effect, but there is a peak in the stress of middle concentration of Cd. So crofton weed is not resistance for heavy metal and its invade ability is limited in certain region.Key Words Crofton Weed; heavy metal; resistance characteristics1 前言随着工业的发展和农业现代化，土壤的污染日益严重。重金属是土壤的一类重要污染物，土壤重金属污染来源广泛，主要是由采矿、冶金、电镀等工业“三废”的不合理排放造成的，此外污水灌溉、污泥农用1及农药化肥的不合理施用也可引起重金属污染。铅是一种重要的重金属，被列为五大毒物之一2。它不仅是一种重要的重金属环境激素，而且是一种积累性剧毒元素，能导致包括人类在内的各种生物的生殖功能下降，机体免疫力下降，从而引起各种生理异常，尤其对儿童智力发育造成严重障碍。铅易通过食物链进入人体造成毒害，其中谷物和饮用水吸取的Pb约占吸取总量的30%，因此对Pb的环境行为污染防治等方面的研究一直受到关注。联合国粮农组织和世界卫生组织(FAO/WHO)对食物中Pb的摄入量有严格限定，确定人每周最高摄入Pb量为2.94mg。镉(Cd)会导致人体神经和肾功能异常，骨骼病变，其毒性仅次于汞。不同于有机毒害物，许多金属在环境中没有半衰期，它会长期存在于生物链中，因此，要特别注意和有效防止其在环境中的积累。紫茎泽兰为多年生草本或成半灌木状，茎直立,高30-200 cm,分枝对生、斜上，花呈白色管状、两性，长约3.5mm；子实为瘦果，黑褐色，年产子实1万粒/株左右，藉冠毛随风传播；主要以种子繁殖，当地上部分被割除时，茎秆下部能产生气生根从而形成新植株，地上部分在根上也能产生不定芽进而形成新的地上部分。紫茎泽兰是一种阳性偏阴的C3植物，对光照适宜范围宽，光补偿点低，光合速率高。其种子的萌发严格需光，幼苗又耐阴，有利于其侵入其他植物群落3。本研究选取“三废”中广泛存在的铅、镉两种重金属作为污染源，利用紫茎泽兰生存力极强和耐受力的特性研究紫茎泽兰在不同重金属浓度梯度下对重金属的抗性及生理生化的变化，以期能探明紫茎泽兰对重金属的抗性能力强弱，从而为是否可以从紫茎泽兰中克隆重金属抗性基因奠定基础。2 实验材料和方法2.1 材料依据紫茎泽兰（Eupatorium adenophorum spreng）生命力极强，耐干旱、贫瘠等特点。从野外植株中剪取中嫩茎段，长5cm左右留一节叶子，其中叶子剪去三分之二面积，作为实验苗。结合我国土壤背景值中铅和镉含量，向土壤中分别按加入试剂CdCl2.2.5H2O、PbCl2(均为分析纯)，使处理后土壤中的Pb浓度依次为500、1000、2000mg/kg，Cd浓度依次为10、50、100 mg/kg。盛土容器为塑料盆，口径23cm，高20cm，每盆装土7kg，每一处理重复5次。野外采取紫茎泽兰苗，于8月初栽植，于11中旬采样进行实验分析。生长期内对各处理材料浇水、除草、松土等管理措施力求一致。2.2 测定方法2.2.1 叶绿素含量的测定4 (1) 取新鲜紫茎泽兰叶片，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。（2）称取剪碎的新鲜样品0.2g，放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2-3ml95乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白。静置3-5min。（3）过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。（4）用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml，摇匀。（5）把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。以95乙醇为空白，在波长665nm、649nm下测定吸光度。（6）将测定得到的吸光值代入下面的式子：Ca=13.95A6656.88A649；Cb=24.96A6497.32A665。据此即可得到叶绿素a和叶绿素b的浓度（Ca、Cb：mg/L），二者之和为总叶绿素的浓度。最后根据下式可进一步求出植物组织中叶绿素的含量：叶绿素的含量（mg/g）= （叶绿素的浓度提取液体积稀释倍数）/样品鲜重2.2.2蛋白质含量的测定5 （1）取6支试管，编号，按下表配制每管含量为0-100g的牛血清蛋白标准液。表1 蛋白质标准曲线的制作试 剂管 号012345100gml1牛血清蛋白标准液（ml）00.20.40.60.81.0Tris缓冲液（ml）10.80.60.40.20考马斯亮蓝溶液（ml）555555每管牛血清蛋白含量（g）020406080100加入表中试剂后，摇匀，以0号管为空白对照，在595nm波长处测定其吸光度（A）值。以牛血清蛋白含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。（2）蛋白质的提取称取叶片0.3-0.5g，剪碎于冷冻过的研钵中加提取液3ml，加少量石英砂，在冰浴中快速研磨成匀浆，匀浆倒入离心管中，再用5ml提取液（分两次）将研钵中匀浆洗入离心管，然后在10000 r/ min，4条件下离心20min，上清液即为可溶性蛋白质提取液。将离心所得的沉淀加3ml 1molL1NaOH溶液，在90恒温水浴中加热20min后，在4000 r/min，4条件下离心10min，上清液即为非可溶性蛋白质提取液。（3）测定上述两种上清液各取0.1ml分别放入2支试管中，每管再加Tris缓冲液0.9ml，空白对照管加Tris缓冲液1ml，然后各管分别再加入考马斯亮蓝染色液5ml，摇匀，在595nm波长处测定吸光度（A）值。（4）根据所测得的样品液吸光度值，从标准曲线查出蛋白质含量，按下公式计算可溶性蛋白质和非可溶性蛋白质含量。可溶性蛋白质的含量（mg/g）标准曲线上查得蛋白质含量（g） 提取液量（ml）/样品鲜重（g） 测定时提取液用量（ml） 1000非可溶性蛋白质含量（mg/g）=标准曲线上查得蛋白质含量（g） 提取液量（ml）/样品鲜重（g） 测定时提取液用量（ml） 10002.2.3细胞质膜电导率的测定6称取新鲜样品1 g左右，放人具塞的试管中，加去离子水20ml，室温浸提30分钟，振荡摇匀，用DDS一11C型直读电导仪测定电导率(C1)，再将样品在沸水浴中浸提10分钟，冷却后，再测量电导率(C2)。叶片质膜透性用相对电导率表示：相对电导率（%）=C1/C2x100。2.2.4丙二醛含量的测定（1）丙二醛的提取：取0.5g样品，加入2ml预冷的0.05mol/L pH7.8的磷酸缓冲液，加入少量石英砂，在经过冰浴的研钵内研磨成匀浆，转移到5ml刻度离心试管，将研钵用缓冲液洗净，清洗液移入离心管中，最后用缓冲液定容至5ml。在4500转/min离心10min。上清液即为丙二醛提取液。（2）丙二醛含量测定：吸取2 ml的提取液于刻度试管中，加入0.5硫代巴比妥酸的5%三氯乙酸溶液3ml，于沸水浴上加热10min，迅速冷却。于4500转/min离心10min。取上清液于532、600nm波长下，以蒸馏水为空白调透光率100%，测定吸光度。（3）结果计算：丙二醛含量（nmol/g）=(A532A600) V1V/1.5510-1WV2式中：A为吸光度；V1为反应液总量(5m1)；V为提取液总量(5ml)；V2为反应液中的提取液数量(2ml)；W为植物样品重量(0.5g)；1.5510-1为丙二醛的微摩尔吸光系数（在1升溶液中含有1mol丙二醛时的吸光度）。3 结果与分析3.1 Pb、Cd对紫茎泽兰叶片叶绿素含量的影响 光合作用是植物生长和产量的生理基础，任何影响生长的因素必然影响光合作用。叶绿素是植物光合作用的主要色素，其含量高低直接影响植物正常的光合作用，甚至影响植物正常的新陈代谢。叶绿素含量的变化，既可反映植物叶片光合功能的强弱，也可用以表征逆境胁迫下植物组织、器官的衰老状况。本文测定了不同重金属处理下，紫茎泽兰叶片叶绿素含量的变化，结果测定如下。 图1 不同重金属处理下紫茎泽兰的叶绿素含量变化由上图可以看出，不同树种叶片叶绿素的含量变化存在着一定的规律：（l）对照叶绿素a、b含量和叶绿素总量明显高于其他处理，并且随着处理浓度的增加而呈现下降的趋势；(2)处理Pb随着处理浓度的增加叶绿素a、b含量呈下降趋势； (3)处理Cd（10）叶绿素a、b及总叶绿素含量明显低于处理Cd（50）、Cd（100）的含量；（4）处理Cd叶绿素a/b的值随着处理浓度的增加呈下降趋势，说明Cd对叶绿素a的作用比对叶绿素b的作用大。3.2 Pb、Cd对紫茎泽兰叶片蛋白质含量的影响植物在自然环境下生长良好与否，它可以在植物的细胞、器官和整体等不同水平上表现出来。植物对环境的适应性，可以通过叶绿素含量变化，叶色变化，蛋白质含量变化表现出来。本文测定了不同重金属处理下，紫茎泽兰叶片可溶性蛋白含量和非可溶性的变化，结果如下。图2 不同重金属处理下紫茎泽兰的蛋白含量变化 由上图可以看出：（1）对照的可溶性蛋白、非可溶性蛋白都比其它处理的含量高；（2）Pb处理可溶性蛋白、非可溶蛋白的含量都随着处理浓度的增加而呈下降趋势；(3)Cd处理可溶性蛋白、非可溶性蛋白含量随着处理的浓度增加而呈上升趋势。3.3 Pb、Cd对紫茎泽兰叶片细胞质膜透性影响 研究表明，植物遭受胁迫时，由于植物体内自由基大量产生和累积，引发膜脂过氧化和脱醋化作用，造成膜脂和膜蛋白的损伤，从而破坏膜结构和功能7使膜透性增大，离子漏失，严重时导致植物代谢失调或死亡。植物细胞膜受损情况与组织的导电能力紧密相关，植物水分含量越高，组织导电能力越高，但各种环境胁迫造成植物细胞膜损坏，使细胞膜透性增加，对水和离子交换的能力下降，直至丧失，K+等自由外渗从而增加外渗液的导电能力，电导率增加。相对电导率是逆境下组织细胞伤害的一个重要指标，它可以反映出植物细胞膜在各种逆境条件下透性变化和组织受损程度。因此，利用电导法，通过测定电导率来表示细胞透性，并由此反映逆境对植物组织的伤害程度是目前日益受到重视的方法之一。本文测定了不同重金属处理下，紫茎泽兰叶片质膜透性的变化，结果测定如下图。图3 不同重金属处理下紫茎泽兰的电导率变化从图中可看出：对照组的电导率相对值都高于其他处理，Pb处理随着浓度的增加呈明显的下降趋势，Cd处理Cd3（100）明显低于前两个浓度处理。 3.4 Pb、Cd对紫茎泽兰叶片丙二醛含量的影响近来大量研究表明，植物在逆境胁迫或衰老过程中，细胞内活性氧代谢的平衡被破坏而有利于活性氧的积累。活性氧积累的危害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。丙二醛(MDA)是细胞膜脂过氧化作用的产物之一，它的产生还能加剧膜的损伤。因此，丙二醛产生数量的多少能够代表膜脂过氧化的程度，也可间接反映植物组织的抗氧化能力的强弱。所以在植物衰老生理和抗性生理研究中，丙二醛含量是一个常用指标。本文测定了不同重金属处理下，紫茎泽兰叶片叶绿素含量的变化，结果测定如下。图4 不同重金属处理下紫茎泽兰的MDA含量变化由图中可看出：（1）重金属Pb处理，MDA的含量明显低于对照而且随着重金属浓度的增加呈下降趋势；（2）重金属Cd1（10）处理紫茎泽兰叶片MDA的含量明显低于后两项，而Cd2（50）、Cd3（100）处理MDA的含量与对照含量相近。说明低浓度Cd对紫茎泽兰的生长有阻碍作用，而当浓度大于某一值时影响较小。4 讨论紫茎泽兰作为一种世界性的入侵杂草早已引起了全世界范围内多个