FTC-3000 中文说明书-FL.doc

目 录目 录- 1 -注 解- 3 -硬件担保- 3 -安全须知- 4 -警告：此设备必须接地良好！- 4 -第1章 概述- 5 -第2章： FTC- 3000仪器概述- 6 -2.1 FTC- 3000仪器的说明- 6 -第3章 开箱与安装- 10 -3.1 装箱清单- 10 -3.2硬件安装- 10 -3.3 FTC-3000软件的安装- 11 -3.4 系统初始化- 11 -注意：- 11 -第4章 FTC-3000软件介绍- 12 -4.1软件概述- 12 -4.2 软件结构- 12 -4.3 FTC- 3000软件的快速浏览- 13 -第5章 参数设置- 16 -5.1热循环参数设置的关键词和术语- 16 -5.2 样本设置- 19 -第6章 运行模式- 25 -6.1 运行qPCR实验- 25 -6.2 检测静态荧光- 28 -6.3 运行熔解曲线- 29 -第7章数据分析和管理- 30 -7.1 实时荧光数据分析- 30 -7.2 熔解曲线- 37 -7.3 高分辨熔解曲线- 38 - 40 -注 解硬件担保枫岭保证您使用的FTC-3000 型实时荧光定量PCR（以下简称FTC-3000）仪器已通过了全面测试,并且达到说明书的使用要求。使用本仪器必须遵守本用户手册所给出的指导和安全警示，否则均不在担保范围内。自带软件：任何与此产品有关的软件作为一种服务免费提供给客户。该软件是运行仪器的一种必须工具。软件所有权：枫岭持有该软件的版权，授予客户使用该软件的权力。软件更改：为改善其操作性能及可靠性，枫岭保有在事先或随后未告知客户的情形下,对功能或设计等进行的修改的权力。枫岭享有修改后版本的所有知识产权。责任：本公司对不遵守使用说明书给出的使用规程或不正确使用FTC-3000仪器 所产生的直接或间接、附带的损失不负责任。枫岭的责任仅限于维修仪器、更换配件。枫岭对于实验结果的不负责解释及对结果应用所产生的后果不承担任何责任。使用FTC-3000 仪器前，务必认真阅读该使用手册并参加培训，以确保您能得出最理想的结果。安全须知FTC-3000 型实时荧光定量PCR仪具有使用简单，易于操作和控制的特点。FTC-3000 使用者必须是经过培训的专业人员，并熟悉本手册给出的指导和安全警示。请参阅本手册中的安装说明，然后再连接电源系统。使用本仪器之前，确保已配置适当和接地良好的电源供电系统。警告：此设备必须接地良好！FTC-3000 属于I级设备。为了减少触电危险，必须接地良好。更换保险丝必须是正确的额定电流，电压和类型。不要在易爆环境中操作该仪器。如果仪器已经损坏、液体或异物进入机器，不要继续操作本机。 断开主电源，并咨询您的枫岭技术代表。为了避免造成人身伤害，不要试图拆启该仪器。该仪器维护、服务等工作只有授权的专业人员可以操作。枫岭将继续为其所有产品提供全面的服务和技术支持。第1章 概述本手册提供了如何操作FTC-3000型定量基因扩增仪的一般信息和详细的操作指引。本章对硬件、软件和技术支持信息进行了概述性描述。操作原则、应用程序和功能的简单摘要:FTC-3000系列实时荧光定量基因扩增仪是为满足当今分子生物实验室的需求所设计。高品质的光学器件、可靠的温度控制系统及严格的生产工艺确保仪器可靠性、精度和准确度。仪器的主要功能包括多通道qPCR检测，熔解曲线及数据分析管理等。FTC- 3000可以使用96孔板、条形管或单个PCR管进行PCR反应。基于Windows的操作系统，所有的仪器设置和分析功能，均受控于一个直观的、易于使用的软件界面，可进行快速实验设置和数据分析。每个热循环后，所有样品的荧光强度与循环次数显示不断更新。实验结束后报告可以使用微软的 Word和Excel软件导出和分析。该仪器可以进行任何实时PCR检测，如病原体、突变、SNP的分析和快速筛选、细胞RNA水平的检测和量化等。封闭的反应体系，将污染降低到最小。该仪器能够对数据进行实时收集和分析，其高效的数据管理能力使用户迅速生成数据和进行重复实验。 FTC-3000 适用于所有基于能够在PCR产物生成过程中对产物进行标记荧光的反应，例如TaqMan,、分子信标、SYBR Green、MGB等荧光化学体系。仪器激发光的波长范围在400-700nm之间。激发光通过光纤直接照射样品，被激发后产生荧光发射信号通过光纤，滤光片和透镜抵达冷态CCD照相机。该机器可提供高达六通道的荧光检测硬件。也可按客户要求，提供其他特殊波长的检测通道。该仪器光路设计，能够保证覆盖目前市场上各种类型荧光染料的要求。该仪器还能确保应对当新的荧光染料出现时，无须更换硬件，只需更换软件版本即可应对。第2章： FTC- 3000仪器概述2.1 FTC- 3000仪器的说明FTC-3000 由三部分组成：第一部分温度控制系统，实质上是由标准的96孔加热/冷却系统和热盖组成。第二部分是由光学元件组成的荧光计，包括激发光源，光学过滤器，透镜和检测系统。第三部分是计算机，用于编程，实时检测，显示和数据管理等。图2.1 FTC-3000的外观图示2.1.1 主要特征：实时定量和终点法定量，传统 PCR激发光波长范围：400700nm在一个样品管里同时检测多个荧光报告基团熔解曲线检测和/或高分辨率熔解曲线（HRM）6个独立的温控模块，可同时进行六个不同复性温度实验12列的温度梯度的跨度范围在20C样品浓度高达9个数量级的线性动态范围快速的数据采集同时检测96个样品孔能够反复分析数据软件直观、界面友好，快速设置和数据显示结果图2.2样品的温度控制系统图2.3 样品板的顶视图2.1.2 温度控制系统温度控制系统是由加热模块和温度控制单元组成。加热块是由六个独立控制的TE模块组成，能够确保模块升降温迅速、均匀，使用温度控制单元确保温度易于精确控制。热循环仪相关参数：温度控制范围为 4C-99，升降温平均速率3C / 秒；温度精度控制在 0.2C；均匀性：0.3C 顶盖温度104C；温度监控模式。2.1.3 荧光检测系统FTC-3000的荧光检测系统由两个光学配件组成：激发光系统和检测系统。激发光系统由卤素灯和光学过滤器组成，通过光纤96孔可以同时激发。检测系统包括一套光纤、四个发射滤光片轮、一组镜片和冷却CCD相机。荧光信号通过光纤，发射滤波器和镜头，到达CCD相机。光学系统相关参数：光源：卤素灯；荧光检测范围：400到700nm；激发波长：提供多达6个通道数（450-700nm）；发射波长：多达6个发射波长（500-700nm）。图2.4 FTC-3000的光学系统2.1.4 计算机及软件嵌入式配套计算机。软件：FTC-3000 的应用软件在 Windows 操作系统下运行，通过配套计算机来显示、控制整个基因扩增过程。应用软件可快速简便地进行 PCR 程序设置、样本参数设置、文件存储扩增控制、实验数据采集、处理及管理。第3章 开箱与安装通常FTC-3000 实时荧光定量基因扩增仪由枫岭技术人员或指定销售商的技术人员为客户上门安装和调试。如果不是，请参照以下说明安装仪器。3.1 装箱清单1. FTC-3000 扩增仪2. 电源线3. 操作手册4. 保修卡和质量证明文件3.2硬件安装 1. 将FTC- 3000型热循环仪放在水平实验台上。 请勿立即将仪器连接到主电源。 FTC-3000 采用风扇冷却，因此安放仪器时应保证仪器后方15cm、左右8cm内无障碍物。请勿将该仪器安放在过度潮湿、高温或阳光直射等温度变化剧烈的区域，这可能会影响FTC- 3000的性能。请勿和其它大功率器件如离心机、空调等共用同一个电源插座以免电源电压波动影响系统运行。操作条件：环境温度：15至35C。湿度：必须保持在20至80的湿度环境，以防止结露。 储存条件：环境温度：-20C至60C。湿度：20到80。2. 务必使用配套的电源线连接该系统到合适的电源上。电源的电压和插座使用功率应符合仪器的使用要求：电压：22010V（50至60 Hz）。功率：1000W（最大）。3.3 FTC-3000软件的安装FTC-3000应用软件已安装在嵌入的计算机内，在Windows操作系统下运行，为实验设置、数据管理和其他功能提供了最大的便利。此外，保存的数据可以通过Microsoft Excel软件进行再分析。3.4 系统初始化当FTC- 3000系统是首次安装时，必须进行以下步骤来测试仪器：打开机器的右侧电源开关。开启FTC-3000软件。点击主菜单，再点击“Run Mode”。点击“Run Real Time qPCR”， 仪器将会进行自检。自检将会检查加热元件，光源，散热风扇，热盖，滤光轮，镜头和CCD相机，耗时大约一分钟。如果通过测试程序，一个新的界面将出现。选择“Testing”的文件名，单击“开始”按钮。系统将对机器进行一个完整的测试。如果检测到故障，可能会显示错误画面。该检测可能耗时几分钟。注意：只有当机器完全通过测试以后，才能进行qPCR实验。 因为在自检过程中模块会加热，枫岭建议用户在自检过程中盖上顶盖以免烫伤。FTC-3000操作简单。有关详细的操作步骤，请参阅下面的说明在本手册的其余部分。第4章 FTC-3000软件介绍4.1软件概述FTC-3000软件在Windows环境下运行，可用于设置实验、运行实验、实验数据收集、分析和管理。标准的PCR语言以及扩增过程中实时图形可以设置自动刻度等功能，可以使用户在实验后轻松地重新分析实验结果。4.2 软件结构该软件允许FTC-3000系统在qPCR运行期间和/或之后执行以下功能：设置模式（详见第5章）：* 创建一个热循环参数和样板设置文件* 修改熔解曲线的运行参数* 编辑或查看已经存在的文件运行模式（详见第6章）：* 操作热循环实验，并收集荧光信号* 运行熔解曲线实验* 显示收集的实时荧光数据和各种运行参数* 运行静态荧光（终点荧光检测）* 自动保存实验结果数据分析和管理（详见第7章）：* 显示和分析收集到的数据，包括：绝对定量、标准曲线、相对定量、基因分型、DD Ct法熔解曲线分析PCR效率计算和校正、SYBR Green 校正* 导出和/或打印数据4.3 FTC- 3000软件的快速浏览本节将提供该软件的快速浏览，以及如何完成qPCR，包括设置，采集数据和数据管理（图4.1 qPCR运行示意图）。4.3.1 运行FTC-3000之前确保FTC- 3000软件已正确安装在电脑上（见第3章说明）。设置热循环参数 样板设置数据管理运行qPCR 数据收集图4.1 qPCR运行示意图4.3.2 运行软件：1. 打开计算机。2. 通过点击桌面FTC-3000软件图标打开软件。3. 页面主菜单显示的有（见图4.2，FTC -3000主菜单）：Set Up, Run Mode, Data Reader, Administration, Exit and Help（设置，运行模式，数据读取，管理，退出和帮助）。图4.2 FTC -3000主菜单4.3.3 设置qPCR 参数qPCR参数设置包括两部分：热循环参数设置和样本设置。热循环参数的设置，包括变性、退火和延伸三步的温度和停留时间，在热循环参数中设定。荧光通道、曝光时间、样本类型等，在样板设置中设置。4.3.3.1 创建一个热循环参数文件夹（详见第5章）1. 在主菜单中点击Setup选择Thermal Cycling Protocol Design或者直接点击可以创建一个新的热循环参数或者编辑一个已存在的热循环参数。2. 参数设置，包括阶段，步，循环数，变性，退火和延伸温度，反应时间和采集信号阶段（Stage, Step, Cycles, denaturing, annealing and extension temperatures and Holding Time）。3. 保存热循环参数。4.3.3.2 创建一个样本文件夹在主菜单中点击Setup选择Plate Setup或者直接点击 设置样品参数。点击Create a new Plate Setup file 选择一个已经存在的热循环参数文件或者点击Edit an existing Plate Setup file 编辑一个已经存在的样品参数文件夹。点击Select an existing Thermal Cycling Protocol file选择一个已存在的热循环参数文并检查热循环参数设置。如果参数设置正确，点击 进入样本设置界面。样本参数中可以对通道选择、曝光时间、样品名称等进行设置。用户可以根据染料选择通道。注意：用户在样板设置中必须最少选择一个孔来进行实验，否则不对样品进行荧光信号采集。其他的样品名称可以在实验前、实验中或者实验后进行编辑。参数设置完成后，进行命名和保存。4.3.4 运行一个qPCR程序1. 点击Run Mode，选择Real Time qPCR或2选择已经设置好的样本参数文件3开始运行4. 当实验运行完毕，结果自动保存4.3.5 运行熔解曲线实验 点击Run Mode，选择Dissociation Curve，运行熔解曲线实验。4.3.6 数据分析4.3.6.1 实时qPCR数据分析1. 点击Data Reader选择qPCR Data Analysis 或者点击 ，选择所要分析的数据文件。2. 点击Standard Sample Curve建立一个标准的样本曲线，并获得绝对定量值。3. 点击Genotyping 对等位基因量的表达进行比较。4. 点击Relative Quantification 进行相对定量的分析。5. 点击Delta Delta Ct 计算Ct和目的基因的相对表达量。6. 点击Exit 退出数据分析。4.3.6.2 熔解曲线数据分析1.点击Data Reader选择Dissociation Curve Analysis，选择一个结果进行分析。第5章 参数设置5.1热循环参数设置的关键词和术语 Stage/step/cycles: stage 一次实验可由若干个stages构成 step 一个stage可由若干个steps构成 cycle 确定某个stage运行的循环数(cycles) 温度温度范围为4-99C。一个典型的热循环参数包含三个温度步骤：变性、退火和延伸。梯度升降温度 复性期温度可设梯度。时间(time) 每个step温度的持续时间。当持续时间设置为零，这一步将不执行，程序将自动进入下一步。持续时间应设置5秒。采集荧光信号 确定在PCR循环的哪个步骤采集荧光，软件默认在stage 2的step 2采集荧光，用户可以点击荧光信号采集时间表对采集时间进行编辑。模块加热模块能够分成6个独立的加热模块。图5.1 6个模块设置温度控制模式FTC-3000系统有两种温度控制模式：单一和多个温度模式。如果整个样板选用一个温度，则选择单一控制模式。如果想要一次运行多个温度，点击多温度控制模式，根据模块可以分为6个不同的温度。注意：当使用多个温度控制模式时，模块间会产生温度干扰。强烈建议，两个相邻模块之间的温度差异尽可能小，同时相邻模块之间的温度差异要小于5C，模块边缘的孔尽可能不使用。温度梯度在多温度控制模式下设置，12列的温度跨度可达24C。每一列孔的温度将显示在表中。5.1.2 创建一个热循环参数（单一温度控制模式）点击 Setup选择Thermal Cycling Protocol，或者点击创建热循环参数。点击Single Temp. Control Mode 或者 Multiple Temp. Control Mode 选择单个温度控制模式或者多个温度控制模式。通过点击/或者直接在方框中输入数字来设置stage, step, cycle number中的温度和持续时间，以及每个stage的循环数。点击Date Recording List 来设定荧光采集阶段，机器默认为第2 stage的第2 step。点击Save, 命名并保存热循环参数（图5.2）。点击Exit 关闭热循环参数界面。图5.2 热循环参数设置界面5.1.3 编辑和查看一个已经存在的热循环参数文件点击Load 按钮可以对已存在的热循环参数文件进行查看和编辑，选择想要打开的文件名称，屏幕会显示出所有已设置的热循环参数，可以修改里面的任一参数，然后进行保存，或重新命名和保存。5.1.4 荧光信号采集该软件允许在任何步骤(step)qPCR运行期间采集荧光信号。建议在较低温度下收集信号，如退火温度。1. 点击热循环参数设置中的Edit Data Recording List （图5.3）。2在数据记录列表中输入所需记录数据的步骤。点击保存返回热循环参数设置界面。5.1.5多个温度模式的热循环参数的设置1. 在热循环参数设置界面，点击Multiple Temp. Gradient 进行多个温度模式的热循环参数设置。2. 对6个模块的每个模块进行类似单个温度模块的热循环参数设置，点击保存，点击退出（图5.3）。注意：多个温度控制模式中，模块间的孔会产生温度干扰，强烈建议相邻模块间的温度差异越小越好，同时模块间的温度差异范围小于5C。模块相邻间的孔不要使用（D，E排，4，5，8，9列）。图5.3 多个温度控制模式图例5.1.6 温度梯度在多个温度控制模式中，该软件允许在整个模板上设置从低到高的温度梯度（图5.4），点击Gradient 进入多个温度控制模式，点击Gradient Set Up，进行温度梯度设置。图5.4 温度梯度设置界面在M1中输入起始温度，如45度，在M5中输入结束温度，如65度，温度梯度会显示在12列中，如图5.5。图5.5温度梯度表5.2 样本设置板本编辑屏幕允许用户对每个样本孔进行样品信息的编辑，如样品编号，引物的名称、样品类型和荧光基团等。重要提示：样本设置中必须至少选择一个孔进行编辑，例如，选择样板上任意孔，然后点击Add。否则运行的PCR反应只进行扩增而不记录任何荧光信号。5.2.1样板设置的定义和术语 Channel（通道）：FTC- 3000系统包含五个通道，允许同时检测五个荧光基团。每个通道对应的过滤器与一个特定的激发光源发射光信号。荧光宽泛的染料波长范围，可用作报告基团，最常用的染料名单表5.2。表5.1 通道激发和发射波的中心波长Channel#Excitation (nm)Emission (nm)1470105205252555705357056205462056705567057105表5.2 qPCR中最常用的报告基团Channel#Fluorophore1FAM/SYBR Green I/EvaGreen2VIC/JOE/HEX/TET3ROX/Texas Red4Cy55Cy5.5/Quasar705 样本类型：包括标准样品，未知样品，阴性对照等。曝光时间：该功能可让用户调整曝光时间，以便取得较好荧光信号的动态范围。建议信噪比超过3倍左右，同时曝光时间控制在0-5秒之内。5.2.2 创建一个新的样本文件夹点击Setup选择Plate Setup 点击Create a new Plate Setup file，或者点击Edit an existing Plate Setup file 对已存在的样板文件进行查看和设置。点击Select an existing Thermal Cycling Protocol file，如果没有想要的热循环参数文件存在，点击Create a new Thermal Cycling Protocol file 先创建热循环参数文件。样本设置界面（图5.6）允许对样本信息进行标记，如样品编号、引物、样品类型、样品名称和荧光基团等信息。图5.6 样本设置1. 孔的选择点击并拖动鼠标选择一个或多个连续的孔，选中孔的边框会由灰色变成蓝色。2. 信息编辑点击Info. Editor进入Information Editor界面（图5.7）。图5.7 信息编辑器可以对每个通道的曝光时间进行编辑，曝光时间的调整可以使用户将曝光时间调整到最佳的动态范围。理想的曝光时间取决于样本的背景值和荧光强度。因为不同的荧光基团有不同的量子效应，可以调整每个通道的曝光时间，机器第1通道的曝光时间默认为0.2秒，通过调整曝光时间可以优化基线和荧光强度的平台期。FTC- 3000仪器的荧光强度的动态范围在0和50,000之间，因此，最大的荧光强度（PCR平台期）必须低于50,000。每个通道曝光时间的默认值是不同的，建议设置在0.1-2之间。点击关闭保存修改。3. 通道和报告基团的选择机器默认的是通道1。点击数字选择需要的通道数，所在通道旁边会有标记，然后选择所用的荧光标记。如果同时做两个或两个以上的通道，需要对每个通道进行孔的添加才能实现荧光记录功能。例如选择了1、2、6通道，在右边分别被标记为蓝、绿、紫颜色（图5.8）。图5.8 通道选择4. 样本信息编辑通道选好后，可以编辑样本的其他信息，如子集编号，样品名称，基因，类型，对应于选定的通道。子集编号: 软件允许在一次PCR循环中设定7个不同的反应；样品名称：选择一个已编辑好的样品名称；基因：选择一个已编辑好的基因名称；样品类型：每一个样品可以被指定为不同种类型的样品，如未知样品，无模板对照，阴性对照，阳性对照，和标准样品等，用于qPCR的数据分析。对于标准样品，用户可以轻松地对样品类型下拉菜单中的模板数量进行设置，可以选择从101到1010的值。其他三种类型，野生，突变和杂合子，是专为高分辨熔解曲线的数据分析所提供。绝对定量：首先要定义标准样品和待测样品的孔位置。例如，在图5.9中B3，B4，B5和B6被定义为标准样品，C3到F8定义为待测样品，所有编辑的样本信息可以通过点击Sample info (图.5.10）进行查看。图5.9 绝对定量中样品名称编辑图5.10 样品信息列表a）S.S. Coe（标准品系数）: 该系数将取决于制备的标准样品浓度，例如标准品其中一支浓度为5*103，则系数为5，在sample type中选择SI*103。b）Add和Delete（增加和删除）：在编辑了以上信息后，点击Add确认编辑，或者点击Delete将不需要的信息删除。c）Load（导入）：点击Load查看一个已存在的样本设置文件。d）Setup Finished（设置完成）：点击Setup Finished保存所设置的。5.2.3 编辑熔解曲线程序点击 Setup选择Dissociation Curve 进入熔解曲线设置界面(图5.11)。图5.11 创建一个新的熔解曲线程序变性温度：默认设为94C，持续时间600秒。退火温度：通过点击/或者直接输入数值来升高或者降低起始温度。默认的起始温度是70C保持30秒。b）终止温度：通过点击/或者直接输入数值来升高或者降低终止温度。升温到96C结束。c）升温速率：通过点击/或者直接输入数值来升高或者降低升温速率。默认设置为0.12C/s。d）曝光时间：从0.1s到5s，将信噪比调整到最佳。e）熔解曲线的样本设置：如果在qPCR运行文件中没有编辑样本，可以点击按钮 Plate Setup for Dissociation Curve 进行设置。编辑完参数后，点击关闭自动保存编辑。第6章 运行模式 FTC-3000 实时荧光定量基因扩增仪能够快速的运行一个qPCR程序。点击主菜单中的RUN Mode，会出现三个选项。第一个Real Time qPCR可以运行常规PCR和qPCR。第二个选项Dissociation Curve 可以运行熔解曲线。第三个Static Fluorimeter检测静态荧光，做终点荧光检测。6.1 运行qPCR实验6.1.1 定义和术语Rn：相对荧光强度DRn：相对荧光强度的增量6.1.2 运行qPCR实验打开连接FTC-3000的计算机。打开FTC-3000的电源。点击FTC-3000图标初始化FTC-3000软件。点击Run Mode，选择Real Time qPCR，或点击图标系统会在一分钟之内完成检测和初始化（图6.1 系统初始化），如果系统检测失败，会出现图6.2的报错信息。图6.1 系统初始化图6.2 系统初始化失败报错图自检通过后，系统会提示选择一个 Plate Setup文件以运行qPCR。实时荧光定量循环界面（图6.3a，b，c）将会出现，这个界面可以查看热循环参数和记录的实时荧光信号。点击图6.3a中红色区域的箭头，可以检测热循环参数是否为想要的。b) 点击图6.3b中的区域选择RT tempreture能够对实验中的温度进行查看。c) 点击DRn curve能够看到实验过程中循环数和DRn的变化（图6.3c）当顶盖温度达到104C的时候PCR开始。点击Pause可以中断运行，点击该键以后，该键会变为Continue。点击Continue继续中断的实验。点击Exit可以退出当前的实验。点击YES结束当前实验，点击NO继续实验。实验结束或者点击YES后，会出现图6.8的对话框，提问是否需要保存数据，如果在1分钟之内不点击，数据会以实验结束的时间自动保存在数据文件夹中。图6.3a实验中热循环参数图6.3b 热循环参数状态 图6.3c DRn曲线6.1.3 运行界面功能说明Stage：当前运行Stage；Step：当前运行的Step；Cycles：当前运行的循环数，如2/40代表在运行40个循环中的第2个循环；Lid T（C）：当前顶盖温度，如104C；Recording：荧光信号记录的状态。荧光信号采集的时候图标由灰变绿；Add on：可以在实验中对当前Stage添加循环数。M1到M6的当前温度曲线（图6.4），点击下达键可查看其它模块的温度。Set up：为运行前设置的温度；M1：检测到M1（或M2，M3，M4，M5，M6）的温度；Elapsed：当前实验已运行的时间；图6.4Remaining：运行完实验还要多长时间；Rn/DRn Curve:：随着循环数荧光强度变化的实时曲线； Channels：根据荧光基团选择不同的通道，看对应通道的荧光信号；Auto Scale/Fixed Scale：选中该选项，Y轴会根据实验数据自动设置Y轴刻度；不选该项Y轴刻度为默认的2；Execute dissociation curve after running：选中该项，qPCR实验完成后自动运行熔解曲线；Plate Editor：实验过程中可以编辑样本名称；Data Library：实验过程中可以查看先前的qPCR实验结果；Zoom+：放大所选孔的样本信息；Reset：与Zoom+相对应，使样本信息返回原来的状态；6.2 检测静态荧光静态荧光检测可以检测实验前或实验后的荧光量。点击Run Mode选择 Static Fluorimeter或者直接点击 ，会出现如图6.5。每个方格代表相对应孔；Exposure time：曝光时间设置；选择需要的通道进行检测；点击Run开始荧光检测；点击Fluorescence开始每个孔的静态荧光检测；点击Background对每个孔的背景值检测；当静态荧光检测完毕，会显示每个孔的荧光值，并提示是否要保存所检测数据。点击Exit退出静态荧光检测界面。图6.5 静态荧光检测界面6.3 运行熔解曲线点击Run Mode选择Dissociation Curve，选择设置好的文件，或者不进行选择，进入熔解曲线界面。点击RT temperature curve显示温度曲线，点击右边的选择键选中Rn curve可以对熔解曲线进行实时监测。熔解曲线结束后会以结束时间为名自动保存结果。第7章数据分析和管理这一章主要介绍的是数据的分析： 包括qPCR 数据, 静态荧光和镕解曲线数据分析。 7.1 实时荧光数据分析7.1.1 数据结构qPCR实验结果的文件自动保存路径为：C （or D, E）:/FTC-3000/Protocol and qPCR Data/qPCR Data file/*。相对应的 Plate Setup file和Thermal Cycling Protocol file需要同时存在才能对数据上面的样本名称进行修改等操作，并且实验结束后不能对Plate Setup file和Thermal Cycling Protocol file的名称进行修改。7.1.2 读取qPCR数据点击Data Reader选择qPCR Data Analysis选择所要读取实验的名称，进入数据界面。7.1.3 qPCR数据分析界面主要功能 qPCR Data：这一界面显示的是qPCR实验中获得的荧光信号，包括随着循环数变化的荧光强度，Ct值，拷贝数，PCR效率等。Standard Sample Curve：此界面显示的是阈值（CT）与起始模板浓度的对数绘制的曲线。 Genotyping：该界面可以进行等位基因分型分析。Relative Quantification：该功能可以根据内部标准曲线计算未知浓度模板的起始浓度。Delta Delta Ct：计算基因表达差异。Quality Control：该功能可以检测一段较长时间内运行条件，试剂，仪器的变化是否会使得相同浓度模板保持不变的Ct值。SYBR Green Correction：当应用SYBR Green染料时，当目标片段扩增长度和内参基因扩增长度不同时予以矫正。7.1.4 qPCR数据分析定义和术语Fluorescence Intensity：报告基团的荧光强度 Rn：报告基团相对荧光强度，是该孔的荧光强度除以该孔的参考值。DRn（也叫Rn）：由Rn值减基线值。Baseline：为qPCR实验早期没有检测到荧光信号增加时，基线水平的荧光背景。Baseline S和Baseline一般设置为3和12。如果Ct值小于12，可以调整基线期到Ct值之前。 Threshold Line (阈值线)：用于确定Ct值，其值略高于阴性对照的一条直线。机器默认为0.05，点击Auto/Fixed可以手动改变阈值线,以调整对数早期DRn，或将阈值调到高于阴性对照样品的水平。当在一个qPCR实验中做多种探针时，每个通道的Baseline和Threshold Line为独立的。Threshold Cycle（Ct）：为DRn曲线与阈值线相交时，交点X轴相对应的数值（循环数）。Ct与模板浓度和扩增效率有关。Normalization：软件对每个孔的数据进行了归一化处理，以减少实验中由于硬件，环境波动如光源、灰尘、潮湿等导致的波动。同时也可以不选择归一处理，读其原始数据。归一的数学模型需要DRn曲线的4个阶段，故需要每个孔的实验要到达平台期。表7.1给出了较低浓度模板到达平台期所需的循环数。表7.1 起始模板浓度循环数100045100481052155PCR Efficency：在对数生长期的DRn值计算PCR效率，E=2时，扩增效率为100%。可以通过调节阈值，看不同时候的扩增效率。扩增效率是一个变量。Standard Sample Curve：是由标准品的起始浓度和所对应的Ct值所做的曲线，用于绝对定量。Allelic Discrimination：可用于分析两种模板核苷酸上的差异，可用于基因分型和单核苷酸多态性（SNP）分析。Relative Quantification：该功能可以根据内部标准曲线对一个未知浓度的样品定量。Ct：该方法广泛用于基因表达分析。前提条件是内参基因和目标基因的扩增效率相同，2-Ct算法假设两者的扩增效率为100%。Quality Control：该功能可以监测不同时期的相同实验，比较其Ct值，扩增效率等是否相同。SYBR Green Correction：该功能主要针对用SYBR Green的用户，当内参基因和目标基因扩增长度不同时可用于矫正。7.1.5 qPCR荧光数据分析点击Data Reader，选择qPCR Date Analysis 打开qPCR数据文件（如图7.1），图7.1 qPCR数据界面鼠标左击划过所要查看的孔，DRn值与循环数的曲线出现。曲线右边的列表中会显示所选孔的孔位，曲线颜色，名称，Ct值，拷贝数，扩增效率等。Graph：采集qPCR信号以两种类型的点表示：Intensity（荧光强度）和DRn。Intensity（多个通道）：选择Intensity（multiple channels），为一个空在多个通道的荧光强度。Intensity（多个孔）：选择Intensity（multiple wells），显示的为一个通道内多个孔的荧光强度。DRn（多个孔）：选择DRn（multiple wells）显示同一通道内多个孔的DRn值。DRn（多个通道）：选择DRn（multiple channels）显示一个孔多个通道内的DRn值。Channel：选择不同通道查看不同通道的数据。Auto Scale/Fixed Scale：可以更改曲线刻度，将细微变化放大观看。Log/Linear：DRn曲线为线性曲线和对数曲线两种形式，通过选择和不选来变换。Export Report：选中所要导出的数据孔位，点击Export Report，命名导出数据的文件名，软件自动生成文本，并保存在C: (or D:, or E:, etc.)/FTC-3000/Report Files/qPCR Report/report name.。点击Return返回数据界面。DRn Export：点击DRn Export导出DRn 数据，保存在C: (or D:, or E:, etc.)/FTC-3000/Report Files/ qPCR Data Report/report name。7.1.6 标准曲线通过标准曲线（图7.1）做绝对定量，应用标准曲线可以确定一个未知浓度的样本的浓度。图7.1 标准曲线Experimental：标准曲线是由qPCR实验得出。Combined：可以手动输入先前实验所做的标准曲线数据。Standard Curve 1：可以同时设置7条不同的标准曲线。Y-Intercept：模板起始浓度只有1个拷贝数时的Ct值。Slope (-1/logE)：标准曲线斜率。E为PCT扩增效率，因而斜率代表了整体的扩增效率。R：回归系数。Mse