红法夫酵母发酵生产虾青素过程关键技术的研究-博士论文

分类号 学号 D200777399 学校代码 10487 密级 博士学位论文 红法夫酵母发酵生产虾青素过程 红法夫酵母发酵生产虾青素过程 关键技术的研究 关键技术的研究 学 位 申 请 人 吴 伟 学 科 专 业 生物制药工程 指 导 教 师 余龙江 教授 鲁明波 副教授 答 辩 日 期 2011 年 6 月 1 2 A Dissertation Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Doctor of Philosophy in Engineering The Study on the Key Techniques for the Production of Astaxanthin by Fermentation in Xanthophyllomyces Dendrorhous Ph D Candidate Wu Wei Major Biopharmaceutical engineering Supervisor Prof Yu Longjiang Assoc Prof Lu Mingbo Huazhong University of Science and Technology Wuhan Hubei 430074 P R China June 2011 3 4 独创性声明独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果 尽我所知 除文中已经标明引用的内容外 本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果 对本文的研究做出贡献的个人和集体 均已在 文中以明确方式标明 本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担 学位论文作者签名 日期 年 月 日 学位论文版权使用授权书学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留 使用学位论文的规定 即 学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版 允许论文被查阅和借阅 本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索 可以采用影印 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文 保密 在 年解密后适用本授权书 本论文属于 不保密 请在以上方框内打 学位论文作者签名 指导教师签名 日期 年 月 日 日期 年 月 日 5 6 华华 中中 科科 技技 大大 学学 博博 士士 学学 位位 论论 文文 摘摘 要要 虾青素 3 3 二羟基 胡萝卜素 4 4 二酮 是从河螯虾外壳 牡蛎和鲑鱼中 发现的一种红色类胡萝卜素 它具有抗氧化 抗衰老 抗肿瘤 预防心脑血管疾病 作用 随着对虾青素需求量逐年加大 而化学方法合成的虾青素存在一定的安全性 问题 所以从微生物 如红法夫酵母 雨生红球藻等 中提取天然虾青素是现今该 领域的的热点研究问题 法夫酵母在发酵过程中需要消耗大量氧气用以维持细胞的 正常代谢和虾青素的合成 如果要大幅提高法夫酵母发酵过程中的虾青素产量 需 要重点解决发酵过程中酵母细胞对氧的摄取率问题 透明颤菌血红蛋白 VHb 是 一种产自原核生物的氧结合蛋白 本研究尝试将透明颤菌血红蛋白基因 vgb 转入 法夫酵母进行表达 试图借此提高酵母细胞对氧气的利用能力 进而达到促进菌体 生长和提高产物合成的目的 而生产过程中降低搅拌速度和减少通气则降低了生产 能耗 使得生产成本进一步降低 本研究还尝试在提取过程中添加适量的天然抗氧 化剂 如生育酚 来提高虾青素的萃取得率 此外 在虾青素的提取过程中首次引 入环境友好试剂如乳酸和乳酸乙酯 1 本研究利用 RT PCR 技术分析了不同碳源对法夫酵母中虾青素合成途径 中的关键酶的影响 发现不同碳源对细胞中虾青素合成途径的各关键酶的诱导作用 不同 从而在分子水平上优化出了最佳碳源组合 最适碳源条件下 分析了不同溶 氧对法夫酵母中关键酶表达的影响 发现 25 溶氧最适合虾青素的合成 同时 这 些现象也在分子层面上解释了细胞产色素能力和碳源 溶氧等培养条件之间的相互 联系 2 本研究构建了包含 cpc 1 启动子 vgb 基因和 nos 终止子的整合型表达载 体 pBC Pcpc vgb Tnos 利用该载体 将 vgb 基因整合到法夫酵母的染色体上 摇 瓶发酵实验结果显示 在含 vgb 基因的转化子中 其各项指标与对照菌株相比 以 色素产量最高的一株 B1 为例 生物量 虾青素产量和虾青素含量分别提高了 21 37 和 13 将获得的色素高产菌株 B1 和 C2 通过斜面连续传五代后 发现两株菌 I 华华 中中 科科 技技 大大 学学 博博 士士 学学 位位 论论 文文 产色素能力变化不大 最大降幅只有 3 2 说明该菌株生产性能比较稳定 此外 将高产菌株 B1 和 C2 在不含潮霉素的斜面上连续传五代后提取基因组 DNA 通过 PCR 扩增 vbg 基因进行验证 B1 和 C2 的传代菌株都能扩增出大约 570 bp 大小的 vgb 片段 说明该质粒已经稳定的整合到法夫酵母的基因组 DNA 上 转化菌株的 稳定性良好 3 本研究在酵母细胞破壁和虾青素萃取过程中加入适量的天然抗氧化剂 抗 坏血酸和生育酚 发现随着温度的升高和时间的延长 色素得率比对照组有明显的 提高 而环境友好试剂乳酸和乳酸乙酯分别进行破壁和提取实验后 结果显示破壁 效率和萃取效率均高于传统试剂 而且安全无毒 通过设计正交试验对虾青素提取 过程进行优化 在最佳条件下 提取时间 30 min 破壁温度 65 破壁时间 60 min 提取试剂为乙酸乙酯 乙醇 1 1 色素得率达到 1493 80 45 31 g g 1 关键词 关键词 法夫酵母 虾青素 透明颤菌血红蛋白 基因工程 环境友好试剂 抗氧化剂 II 华华 中中 科科 技技 大大 学学 博博 士士 学学 位位 论论 文文 Abstract The red yeast Xanthophyllomyces dendrorhous formerly known as Phaffia rhodozyma is one of the most promising microorganisms for biotechnological production of dietary astaxanthin In the process of X dendrorhous fermentation large amount of oxygen was consumed to maintain cell metabolic level Vitreosilla Hemoglobin VHb is a kind of oxygen binding protein of prokaryotic origin The aim of this study is to express vgb gene in X dendrorhous and to improve cell growth and astaxanthin production by enhancing the oxygen usage ability of cell In this study we also reported that the application of lactic acid and ethyl lactate to astaxanthin extraction from X dendrorhous and efficacy of antioxidants addition in protecting against oxidative degradation during the extraction process 1 This report gives an insight into the specifi c changes in the transcription of four key carotenogenic genes encoding geranylgeranyl diphosphate synthase crtE phytoene desaturase crtI phytoene synthase lycopene cyclase crtYB and astaxanthin synthase ast respectively in X dendrorhous cultures with regard to various dissolved oxygen DO contents and carbon sources Our results suggested that a correlation between biomass astaxanthin production and the transcripts of carotenogenic genes was evident in the cells cultured with various substrates and DO concentration 2 The recombinant vector pBC Pcpc vgb Tnos contain vgb gene which was promoted by the promoter of cpc 1 was constructed and the Recombinant vector was integrated in the chromosome of X dendrorhous by electroporation We confirmed recombinants by Hygromycin B selection and PCR and screened out two astaxanthin overproducing strains from the recombinants The biomass astaxanthin yield and astaxanthin content of engineering strains were increased by 21 37 and 13 respectively than the original strain PCR analysis indicated vgb had been integrated in to the chromosome of X dendrorhous and CO binding difference speetrum analysis of recombinant strain showed that active VHb protein has been expressed in X dendrorhous At the same time the recombinant strain was stable at the generation and yield and suitable for industrial application III 华华 中中 科科 技技 大大 学学 博博 士士 学学 位位 论论 文文 3 The optimum extraction conditions were as follows the yeast cell wall was disrupted by lactic acid at 65 oC for 1 h and then extracted with ethyl lactate ethanol 1 1 v v for 0 5 h The results showed that lactic acid and ethyl lactate has an obvious predominance for the extraction of food grade astaxanthin and TOC was proved to be a high efficient natural antioxidant in our tests Key words Xanthophyllomyces dendrorhous Astaxanthin Vitreosilla Hemoglobin Genetic engeering Environment friendly reagent Antioxidant IV 华华 中中 科科 技技 大大 学学 博博 士士 学学 位位 论论 文文 目目 录录 摘摘 要要 I Abstract III 1 绪论绪论 1 1 虾青素及其产生菌的研究进展 1 1 2 透明颤菌血红蛋白及其研究进展 14 1 3 虾青素分离提取技术及应用研究进展 23 1 4 本课题的立题意义和研究内容 24 2 溶氧对法夫酵母中虾青素合成酶基因诱导作用的影响及其优化溶氧对法夫酵母中虾青素合成酶基因诱导作用的影响及其优化 2 1 实验材料 25 2 2 实验方法 27 2 3 结果与分析 31 2 4 讨论 36 3 转血红蛋白法夫酵母基因工程菌的构建及其发酵性能评价转血红蛋白法夫酵母基因工程菌的构建及其发酵性能评价 3 1 实验材料 38 3 2 实验方法 41 3 3 结果与分析 50 3 4 讨论 63 4 法夫酵母中虾青素分离提取过程中的稳定性研究法夫酵母中虾青素分离提取过程中的稳定性研究 4 1 实验材料 64 4 2 实验方法 65 4 3 结果与分析 66 4 4 讨论 74 V 华华 中中 科科 技技 大大 学学 博博 士士 学学 位位 论论 文文 5 总结与展望总结与展望 5 1 总结 75 5 2 本论文创新之处 76 5 3 展望 76 致致 谢谢 78 参考文献参考文献 79 附录附录 1 攻读博士期间发表学术论文目录攻读博士期间发表学术论文目录 96 VI 华华 中中 科科 技技 大大 学学 博博 士士 学学 位位 论论 文文 1 绪论绪论 1 1 虾青素及其产生菌的研究进展虾青素及其产生菌的研究进展 虾青素作为一种天然的着色剂 广泛的存在于鲑鱼 1 甲壳类和鸟类 虾青素属 于类胡萝卜素家族 该家族包括黄色到桔红色这一系列的萜类色素 而这些色素主 要由光合细菌和其他一些细菌 真菌自身合成 2 它们可作为天然的着色剂 饲料添 加剂和保健营养品 可广泛应用于食品 医药和化妆品行业 3 类胡萝卜素有很强的 抗氧化活性 它可以保护微生物机体免受氧化损伤 4 5 美国FDA于 2009 年 4 月已经 批准虾青素作为色素类添加剂可以用于动物和鱼类的饲养 而欧洲委员会也批准虾 青素作为食品染色剂可用于食品工业 利用微生物进行工业化生产天然虾青素 相对传统的化学合成工艺 是一种环 境友好的生产方式 现在又重新成为科研工作者的研究热点 6 雨生红球藻和法夫酵 母作为两种最具有产业化前景的微生物 可以用来大规模发酵生产天然虾青素 7 10 当前工业化生产天然虾青素主要采取两种途径 第一种途径是从红法夫酵母 粘红 酵母等酵母菌中直接提取 美国的Red Star公司及Igene生物公司都是采用该方法生产 虾青素 11 第二种途径是利用藻类生产虾青素 商业化比较成功的企业主要有中国 荆州市天然虾青素有限公司 日本YAMAHA集团 美国Cyanotech公司等 国外优质 雨生红球藻细胞的总类胡萝卜素中虾青素含量高达 90 以上 12 国内关于上述两种 途径生产虾青素的研究报道很多 也已有规模化生产 国内也有一些的科研单位这 方面的研究开展的比较早 也取得了一些成果 如浙江大学等 13 16 1 1 1 虾青素的理化性质和结构特点虾青素的理化性质和结构特点 虾青素英文名 astaxanthin 化学名称 3 3 二羟基 4 4 二酮 胡萝卜素 CAS No 472 61 7 分子式 C40H52O4 分子量 596 86 化学结构式如图 1 1 因 两端羟基旋光性差异有 3 种异构体 而且分子结构中存在一个共轭多烯结构 环的 两端各含有一个氧功能团 故将其归类为叶黄素族 1 华华 中中 科科 技技 大大 学学 博博 士士 学学 位位 论论 文文 图 1 1 虾青素的结构式 Fig 1 1 Structures of astaxanthin 虾青素为深紫红色粉末 熔点为 215 216 分子结构中的共轭多烯结构易被氧 化 导致其稳定性较差 虾青素几乎不溶于水 易溶于大部分有机溶剂 室温下在 二氯甲烷 三氯甲烷 二甲亚砜 丙酮和其他非极性溶剂的溶解性较好 在丙酮中 的最大吸收波长为 480 nm 乙醇中为 478 nm 三氯甲烷中为 489 nm 二甲亚砜中为 492 nm 石油醚中为 474 nm 天然的虾青素在自然界中主要以 3S 3 S 或 3R 3 R 的构象存在 而化学合 成的虾青素主要存在 3R 3 R 3R 3 S 和 3S 3 S 三种异构体形式 并以 1 2 1 的比例存在 17 天然的虾青素可以在两种构象之间自由转换 雨生红球藻中的虾青 素主要是以 3S 3 S 的形式存在 18 而法夫酵母中的虾青素则是以 3R 3 R 的构 象存在 19 科研工作者发现鱼体内的虾青素的构象与摄入饲料中的保持一致 20 实 验证明 通过鉴定鱼体内的虾青素异构体构象可将人工养殖鲑鱼和野生鲑鱼区分开 来 21 野生鲑鱼中的虾青素和雨生红球藻中的一样 主要是以 3S 3 S 的构象存在 研究显示 比较有益于人体健康的虾青素是 3S 3 S 异构体 22 其他的异构体对人 体无害 但也没有发现其明显的生物活性 化学合成的虾青素主要是羟基虾青素 而藻类和鱼类中的天然虾青素是以脂肪 酸的单酯和双酯的形式存在 保健品中添加的天然虾青素酯由于稳定性更好 不易 被氧化 所以保质期更长 一些研究表明虾青素酯混合脂质体做成的剂型 其口服 生物利用度较好 23 但是对于鲑鱼来说 由于酯类物质的水解较困难因而降低了虾 青素的生物利用度 24 如今 用于水产业的虾青素主要通过石油资源为原料化学合 成的 每年产值达到 2 亿美元 市场上每公斤的虾青素纯品售价价格是 2500 美元 25 2 华华 中中 科科 技技 大大 学学 博博 士士 学学 位位 论论 文文 而天然虾青素的售价则更高 1 1 2 虾青素的生理功能与应用虾青素的生理功能与应用 1 抗氧化作用 研究表明 类胡萝卜素的分子式中由于含有 9 个或更多共轭双键 所以它们可 以使某些活性氧有效的灭活 从而防止蛋白质等大分子的损伤及脂质的过氧化 起 到保护机体的作用 前人的研究证明 虾青素淬灭活性氧自由基的能力比 胡萝卜素 强 2 10 倍 比维生素E强 80 550 倍 所以说其具有极强的抗氧化性 26 28 因为虾青 素分子中不仅存在长的共轭双键 而且在两端的环上还各有一个 羟基酮结构 研究 发现该结构具有极强的电子效应 通过向氧自由基提供电子与自由基发生反应 有 效的将自由基清除掉 从而产生抗氧化效果 虾青素通过自身的分子被氧化降解来 保护其它分子或组织免受损伤 例如虾青素可以保护生物膜上的磷脂和其它脂类分 子不被氧化 其保护效果远比 胡萝卜素和叶黄素好 所以说虾青素的这种抗氧化性 能可以在很多疾病的防治过程中能起关键作用 29 Camera等 30 的研究表明 虾青素 对保护人体免受长波紫外线 UVA 损害效果显著的高于叶黄素和 胡萝卜素 2 抗癌与预防动脉硬化 科研工作者通过药理实验证明 虾青素能有效抑制与前列腺生长有关的 5 还原 酶的活性 利用虾青素这一特性可以用来预防和治疗前列腺增生和前列腺癌 31 还 有研究发现 小自鼠进食了添加了虾青素的的饲料后 其体内的能杀死肿瘤细胞的 有益细胞明显不受环境压力的干扰 32 Beom等 33 的研究表明虾青素能够通过调节胞 外信号调节激酶 ERK 及细胞周期相关蛋白的表达 诱导胃癌细胞停留在G0 G1 期外 从而达到减少正常细胞癌变的效果 这可能是虾青素能够抗胃癌的原因 临床研究表明人体内低密度脂蛋白 LDL 的氧化是导致动脉硬化的重要病因 之一 虾青素在体内可使血液中高密度脂蛋白 HDL 显著升高而 LDL 降低 而 胡萝卜素和角黄素则无此功能 究其原因可能是虾青素能有效体内减轻载脂蛋白的 氧化 故虾青素可用来预防冠心病 动脉硬化和缺血性脑损伤等心血管疾病 3 着色功能 虾青素呈鲜红色 而且是微生物细胞中类胡萝卜素代谢途径的终点产物 在进 3 华华 中中 科科 技技 大大 学学 博博 士士 学学 位位 论论 文文 入生物体内后 其结构不发生任何变化而直接贮存 沉积在组织中 研究表明虾青 素的着色效果要强于 胡萝卜素 被认为是最有效的着色剂 34 鲑鱼 红鳟鱼等观 赏鱼类之所以鱼肉显粉红色 正是由于摄入鱼食中的虾青素与体内肌动蛋白非特异 结合而沉积下来 此外 虾青素还具有激素的功能 当鱼食用了含虾青素的饲料后 鱼卵受精率大大提高 而且胚胎的死亡率也呈现降低的趋势 鱼体生长加快 繁殖 能力明显得到提高 35 天然虾青素还能有效改善家禽蛋的色泽 实验表明 添加 5 ppm 浓度的虾青素到饲料中能使蛋黄显深红色 36 实验结果还显示不仅蛋黄颜色 而且 家禽的皮肤 足 喙等处颜色都和虾青素的含量成正相关 通过在饲料中添加虾青 素 可以明显提高了禽蛋 肉的营养及商品价值 也有利于人体健康 1 1 3 法夫酵母中虾青素的生物合成途径法夫酵母中虾青素的生物合成途径 关于法夫酵母中虾青素的生物代谢途径的研究报道 37 40 已经很多了 其具体路 线图可归纳为如图 1 2 所示 图 1 2 法夫酵母中虾青素的合成途径 41 4 华华 中中 科科 技技 大大 学学 博博 士士 学学 位位 论论 文文 Fig 1 2 Biosynthetic pathway leading to astaxanthin in Xanthophyllomyces dendrorhous Idi基因编码IPP异构酶 能催化烯焦磷酸 IPP 异构化为二甲基烯丙基焦磷酸 酯 DMAPP 42 而从类异戊二烯前体物质到 胡萝卜素的过程分别需要以下四种 酶的参与 1 四异戊二烯焦磷酸 GGPP 合成酶 由crtE基因编码 它主要参与 催化 3 分子IPP与DMAPP缩合成C20 前提物质GGPP 43 2 八氢番茄红素合成酶 由 crtYB基因编码 它的功能是催化两分子GGPP缩合形成番茄红素 44 3 八氢番茄 红素脱氢酶 由crtI基因编码 它主要催化八氢番茄红素通过一系列脱氢反应生成 为番茄红素 45 4 番茄红素环化酶 由crtYB基因编码 它催化番茄红素分子两 端发生两次环化 依次生成 胡萝卜素和 胡萝卜素 44 最后还要经过两步酶促反应 胡萝卜素才能最终生成虾青素 其中酮化酶催化 胡萝卜素分子上引入 2 个 4 位的 酮基基团 羟化酶则催化引入 2 个 3 位的羟基基团 在法夫酵母细胞中 这两步反 应可以只通过一个酶 即由crtS基因编码的虾青素合成酶来实现 它先对 胡萝卜素 进行 4 位的酮化 然后在进行 3 位的羟化 46 但是有研究表明 将crtS基因在生产 胡萝卜素的毛霉菌进行表达后 产物中并没有检测到虾青素和酮基化的中间产物 47 48 此外 Alca no等发现 由crtR基因编码的一种细胞色素P450 还原酶对法夫酵 母中的CrtS起到一个辅助的作用 即为底物的氧化提供电子 49 Ukibe等提出在产 胡萝卜素的酿酒酵母中单独表达crtR基因并没有发现有虾青素生成 而协同表达crtS 和crtR基因时产物中发现了有少量的虾青素累积 50 除了上述的合成虾青素的双环途 径 An等 51 提出在法夫酵母中还存在单环途径 即由 胡萝卜素依次生成torulene HDCO和终产物DCD 提高法夫酵母中虾青素含量通常采用的方法首先是培养条件的优化 然后是通 过传统诱变来筛选虾青素高产菌株 除此以外 还有人研究了一些类胡萝卜素相关 合成酶基因的克隆和有效的转化系统 希望能够对虾青素的合成途径进行定向的基 因改造 由于对类胡萝卜素相关合成酶基因的了解比较有限 目前的研究也仅限于 和其他一些真菌的类胡萝卜素相关合成酶基因进行类比 1 1 4 法夫酵母生产虾青素的研究进展法夫酵母生产虾青素的研究进展 早在上世纪 60 年代 科学家Herman Phaff在北半球的高海拔和高纬度地区进行 5 华华 中中 科科 技技 大大 学学 博博 士士 学学 位位 论论 文文 酵母生态学的野外考察时 从阔叶树的浸出液中成功分离得到红法夫酵母 Phaffia rhodozyma 也称Xanthophyllomyces dendrorhous 7 9 后来又有人陆续在俄罗斯 芬 兰和美国发现了法夫酵母 52 最近 在南半球区域也发现了法夫酵母的存在 53 54 这种担子菌酵母的生物多样性至少包括两类 无性型的P rhodozyma和有性型的X dendrorhous 9 Kucsera等 55 在培养X dendrorhous时发现培养基中氮源的消耗诱导了 明显的有性活动 包括核配 减数分裂 甚至重组 1 非基因改造手段获得高产菌株 法夫酵母虾青素高产菌株可以通过传统诱变方法筛选得到 而通过各种不同的 非基因改造策略筛选得到的高产菌株归纳如下 通过抗霉素A平板筛选得到的法夫酵母突变株中虾青素的含量是对照菌株的 2 5 倍 抗霉素对呼吸链中的细胞色素b特异性较强 它破坏了线粒体中参与氧化还 原的细胞色素b或细胞色素P450 从而导致了虾青素产量的提高 56 紫罗酮作为 胡萝卜素环状结构类似物 可以诱导毛霉菌中 胡萝卜素的生物合成 然而 紫罗 酮似乎在法夫酵母中 胡萝卜素这个节点阻断了虾青素的合成 导致虾青素产量下降 57 58 法夫酵母虾青素高产突变株还可以通过定量流式细胞仪和细胞分类技术筛选 得到 59 该方法的原理是建立色素含量和荧光强度之间的相关性 通过从大量的突 变菌群中富集色素高产突变株 从而降低筛选的难度 在荧光激光共聚焦显微镜中 观察野生株和突变株时发现 突变株的荧光强度要明显高于野生株 Ukibe等 60 建立 了利用流式细胞仪筛选法夫酵母虾青素高产突变株的方法 通过低剂量 射线诱变筛选的法夫酵母色素高产菌 其细胞内色素含量高达 3 3 mg g 是对照组的 1 5 倍 这说明突变株能自主清除低剂量 射线产生的氧自由基 61 Liu等 62 也通过注射低能量粒子束筛选到一株遗传性能比较稳定的虾青素高产株 细 胞内色素含量高达 2 5 mg g 是对照组的 2 25 倍 2 法夫酵母代谢工程研究 通过克隆和鉴定法夫酵母中参与虾青素合成途径中的一些基因 可以尝试对其 代谢途径进行调控 从而获得高产的基因工程菌 Lodato等 63 利用RT PCR技术对比了两株虾青素高产菌株和野生株中参与虾青素 6 华华 中中 科科 技技 大大 学学 博博 士士 学学 位位 论论 文文 合成的idi crtE crtYB和crtI基因的表达情况 发现色素的合成和相关基因的转录水 平并不是一个线性关系 crtYB crtI和crtS 甚至增长较慢的idi基因的mRNA转录水 平在细胞指数增长末期呈下降趋势 而crtE基因则在整个细胞的生长周期中都保持一 个较高的水平 在早期阶段 高产菌株中的mRNA转录水平是野生株的 3 倍 64 构建基因工程菌的关键是要建立一个有效的转化系统 Wery等 65 发现了一种有 效的转化质粒 含有G418 抗性筛选标记和一个能促进高效整合的 18S rDNA区域 最终有超过 50 个质粒能随机整合到含有rDNA位点的染色体中 得到稳定的转化子 Verdoes等 45 发现在法夫酵母中增加crtI基因 编码八氢番茄红素脱氢酶 的拷贝 数后 单环类的色素 如torulene 和HDCO积累的量上升 而双环类的色素如海胆酮 胡萝卜素和虾青素的含量则下降 但是 如果增加crtYB基因 编码八氢番茄红素 合成酶和番茄红素环化酶 的表达量 则法夫酵母中总色素量上升 主要表现为海 胆酮和 胡萝卜素的含量上升 而虾青素的含量变化不大或者略微下降 这就表明在 重组菌中羟化反应是合成虾青素的限速步骤 番茄红素是虾青素合成途径中的一个 重要节点 它控制着从 胡萝卜素或从HDCO到终产物虾青素的代谢流向 所以说在 番茄红素合成酶和番茄红色环化酶之间存在着竞争 39 40 这说明虾青素合成酶系中 任何比例的改变都可能影响色素的合成 Verdoes等 45 从欧文氏菌中克隆了crtE crtYB和crtI基因 并在大肠杆菌中进行 异源表达 发现转化子中有番茄红素生成 将crtS基因在主要累积 胡萝卜素和角 黄素的不产虾青素的法夫酵母突变株中表达 得到的转化子发现有虾青素累积 没有角黄素生成 47 而将crtS基因在毛霉中表达后发现产物中含有 胡萝卜素羟化 后的产物 隐黄素和玉米黄质 而没有虾青素和酮化的中间产物 47 48 在产 胡萝 卜素的酿酒酵母中协同表达crtS和crtR后 发现产物中有少量的虾青素累积 50 将法夫酵母中crtR基因敲除后得到的两个转化子中的色素组成都发生了改变 一 个菌落由于不成合成虾青素 只有 胡萝卜素的累积而呈黄色 另外一个菌落由于虾 青素含量低而 胡萝卜素含量高呈现较浅的颜色 49 3 利用廉价培养基发酵生产虾青素 表 1 1 不同原料 诱导物和发酵参数对法夫酵母生产虾青素的影响 7 华华 中中 科科 技技 大大 学学 博博 士士 学学 位位 论论 文文 Table 1 1 Astaxanthin productivities obtained with different strains of Xanthophyllomyces dendrorhous using low cost raw materials inducers and optimized fermentation parameters 策略 菌株 Astaxanthin mg g Astaxanthin mg l Biomass g l 方法 规模 参考文献 菌种改良菌种改良 NCHU FS301 1 5 8 6 5 7a 紫罗酮筛选 摇瓶 58 3A 4 8 3 3 13 2 a4 0 Gamma 射线 摇瓶 61 E5042 2 5 76 7 a30 7 低能量粒子束 50 L 发酵罐 62 廉价培养基廉价培养基 ATCC 24202 1 6 7 4 a4 6 泥炭水解物 摇瓶 66 ATCC 24202 0 4 7 4 19 3 甘蔗汁和尿素 2 L 发酵罐 67 N9 1 3 9 8 7 5 a葡萄汁 2 L 发酵罐 68 R1 1 8 11 2 a6 2 椰子汁 摇瓶 69 UCD 67 210 1 1 15 3 14 1 糖蜜 摇瓶 70 25 2 0 6 a23 8 39 0 枣子汁 3 L 发酵罐 71 TISTR 5730 1 3 a25 8 19 6 芥末废液 摇瓶 72 NRRL Y 17268 1 0 30 5 30 6 桉树叶水解物 2 L 发酵罐 73 2A2N 1 1 40 0 36 0 甜菜糖蜜 100 L 发酵罐 74 诱导物诱导物 NRRL Y 1092 0 2 2 4 12 0 a柠檬酸盐 摇瓶 11 ENM 5 1 3 10 4 8 0aH2O2 摇瓶 75 G276 1 3 a26 2 19 8 植物提取物 7 L 发酵罐 76 G276 2 0 31 8 15 0 a植物提取物 摇瓶 76 VKPM Y2476 4 0 221 0 55 0 白光灯 摇瓶 77 VKPM Y2476 4 4 235 0 53 0 紫外灯 摇瓶 77 发酵优化发酵优化 7B12 1 7 7 7 7 氮源 5 L 发酵罐 78 0 8 14 5 19 4 供氧 发酵罐 79 ATCC 24202 0 5 16 0 33 6 两阶段补料发酵 5 L 发酵罐 80 1 2 29 0 23 8 补葡萄糖 发酵罐 81 JH1 5 1a36 1 7 1 统计实验设计优化 摇瓶 82 ZJUT46 2 2 a39 0 17 4 补料发酵 2000 L 发酵罐 83 ZJUT003 2 6 52 3 20 6 批次 100 000 发酵罐 84 ENM 5 1 1 a58 3 54 8 灌注培养 摇瓶 85 VKPM Y2476 4 1 350 0 86 0 白光灯 800 L 发酵罐 77 VKPM Y2476 4 7 420 0 88 0 白光灯 10 L 发酵罐 77 a文中没有明确提出数据 是估算数据 国内外已有很多研究机构 利用工业来源的廉价原料对法夫酵母进行发酵生产 8 华华 中中 科科 技技 大大 学学 博博 士士 学学 位位 论论 文文 虾青素 做了大量的深入的研究 如表 1 1 用到的原料包括糖蜜 果汁 水解液 工农业生产中的副产物等 这些都被用来进行摇瓶或者发酵罐规模的液体发酵实验 其中 将芥菜籽生产调味品的废水水解后用来发酵法夫酵母 得到的生物量和虾青 素产量分别达到 19 6 g L和 25 8 mg L 虾青素产量是YM培养基的 11 倍 72 还有人 发现将麦芽汁和糖蜜单独使用 或者以一定的比例进行组合都适合法夫酵母的生长 和色素的形成 86 农业废弃物由于来源广泛 在生产工业燃料和化学制品方面有着较好的应用前 景 例如 25 kg玉米用来生产甜味剂 油或者乙醇 可产生 7 kg的富含蛋白和纤维 素的残渣 玉米残渣水解后的糖 主要是葡萄糖 木糖和阿拉伯糖 用来对五株法 夫酵母菌株进行发酵实验 结果显示这五株菌都能利用上述的三种糖 利用阿拉伯 糖的菌株色素产量最高 但高浓度的葡萄糖可能会抑制对另外两种糖的利用 利用 稀释的玉米残渣水解液发酵 酵母细胞的虾青素含量达到 0 8 mg g 糖的利用率是 100 87 此外 利用玉米生产燃料乙醇产生的六种副产物作为碳源对法夫酵母进行 发酵实验 其中的三种 酒糟水 玉米浓缩蒸馏液和玉米麸 的色素产量分别达到 YM培养基的 65 148 和 104 这说明这些副产物作为高效廉价的原料 完全可 用于对法夫酵母进行发酵生产虾青素 88 利用苜蓿残渣汁为原料发酵 得到的法夫 酵母生物量较高 但是色素产量低而且细胞容易自溶 添加一定的营养物质不能缓 解对色素生成的抑制作用 这说明苜蓿汁中含有某种抑制虾青素生物合成的成分 86 一些天然的碳源 如甘蔗汁 葡萄汁 椰子汁 菠萝汁和植物提取物 都能促 进法夫酵母中虾青素的合成 椰子果肉可广泛用于生产洗发精 糖果和其他食品 椰子残渣却可以用于虾青素的生产 其色素产率可达到 1 8 mg g 该结果要优于其他 一些天然碳源 69 此外 10 的甘蔗糖蜜作为碳源用于培养法夫酵母 其虾青素产 率也达到了 1 1 mg g 15 3 g mL 是葡萄糖发酵水平的 3 倍 70 利用蜜糖在 100 L 发酵罐生产色素 色素终产率高达 40 mg L 74 糖蜜中三种主要的糖 蔗糖 葡萄糖 和果糖 都能被很好的利用 但果糖的吸收速度稍慢 当用含尿素和磷酸盐的培养 基进行 100 L规模的发酵时 最大生物量和色素产量分别达到 36 g L和 40 mg L 74 利用稀释的菠萝汁作为培养基的主要成分来发酵生产色素也取得了成功 当用 9 华华 中中 科科 技技 大大 学学 博博 士士 学学 位位 论论 文文 10 的菠萝汁培养基代替YM培养基后 法夫酵母色素产量提高了 66 89 以枣汁作 为碳源来培养法夫酵母 其生物量和虾青素产率是利用YM培养基的 2 5 倍 90 法夫 酵母还可以利用葡萄汁培养基进行发酵 68 结果显示细胞中总色素含量和虾青素含 量分别达到 2 1 和 1 3 mg g 添加酵母粗提物到葡萄汁基本培养基中后 酵母细胞的 比生长速率 总色素量和虾青素含量都明显提高 Martin等 66 利用泥炭水解物作为主 要原料来发酵生产虾青素 得到的细胞总色素含量也高达到 1 6 mg g Acheampong 和Martin 91 提出 泥炭提取物培养基中 虾青素的产量和细胞生物量是紧密关联的 批次发酵和连续发酵中细胞的色素含量几乎维持在同一水平 桉树水解物中木糖的浓度为 16 6 40 8 g L 用来发酵培养法夫酵母取得了较好 的效果 最大生物量达到 23 2 g L 最大色素含量为 12 9 mg L 其中虾青素产量 10 4 mg L 92 进一步采用间歇补料培养后 酵母细胞的生物量提高到 30 6 g L 总色素 产量提高到 33 5 mg L 虾青素产量也提高到 30 5 mg L 93 一些采用廉价原料的培养基 如稀释的甘蔗糖蜜 尿素和磷酸盐等 都可以用 来培养法夫酵母 而且细胞中虾青素含量通常都高于 1 3 mg g 生物量也高于 5 g L 94 培养基加入玉米浆后 细胞的生物量和虾青素含量都有所提高 分别达到 9 2 g L和 1 4 mg g 酿酒厂的废水虽然不利于法夫酵母的细胞生长 但是细胞中色素含 量高达 1 9 mg g 95 除了用廉价的原料来替代培养基的碳源和其他一些营养成分等手段外 通过添 加一些诱导物到培养基中也能提高虾青素的产量 11 73 96 97 培养基中添加紫苏或者 大葱提取物后色素的产量达到 32 mg L 而细胞的生长没有受到影响 这说明这两种 提取物不仅是提供了营养物质 还起到了色素合成的诱导作用 而且添加紫苏提取 物还使整个发酵周期缩短了 2 d 76 在法夫酵母细胞生长的延迟期和对数期 通过添加 0 2 乙醇可以提高酵母细胞 的色素生产效率 这可能与HMG CoA还原酶的诱导和氧化代谢反应的激活有关 98 此外 液体烷烃类物质作为氧载体加入摇瓶中可以提高酵母的生物量和色素产量 其中以正十六烷效果最好 培养过程中添加 9 正十六烷使色素产量提高了 58 14 5 mg L 对照为 9 2 mg L 培养基中氧传递速度提高了 90 99 10 华华 中中 科科 技技 大大 学学 博博 士士 学学 位位 论论 文文 4 优化发酵参数提高虾青素产量 1 摇瓶发酵水平的研究 多数的法夫酵母发酵实验都仅限于实验室规模 而且虾青素产量较低 如表 1 1 所示 0 5 mg g 80 0 04 mg g 38 0 5 mg g 73 0 3 mg g 11 8 1 mg L 100 25 8 mg L 72 1 0 mg g 72 1 8 mg g 25 和 1 2 mg g 81 最近de la Fuente等 77 将法夫酵母发酵水平 大幅度提高 色素产量高达 235 mg L 细胞虾青素含量为 4 4 mg g 关于碳源和氮源对摇瓶中法夫酵母合成虾青素的影响的研究已经很多了 Pal gyi等 101 以葡萄糖碳源作为对照 研究了 11 株法夫酵母菌对其他碳源的吸收实 验 并取得了较好的效果 利用统计学方法优化发酵培养基的最有配比 结果显示 3 89 葡萄糖和 0 29 酵母粗提取物是影响虾青素生产的最重要的因素 获得的虾青 素产量为 36 mg L 82 而氮源的最佳配比为 0 28 g L NH4 2SO4 0 49 g L KNO3和 1 19 g L 牛肉膏 色素产量 7 7 mg L 和 1 0 mg g 虾青素含量 78 此外 析因设计和响应面分析等统计学方法也被用来对YM培养基和枣汁培养基 中五个重要参数 pH 温度 装样量 碳源和氮源浓度 进行优化 结果显示碳源 浓度和温度是影响虾青素生产的最重要的因素 通过二阶的响应面分析得出的最优 条件为 培养温度 19 7 C 碳源浓度 11 25 g L 氮源浓度 0 5 g L pH 6 0 和 5 的 装样量 上述最佳条件下虾青素产量为 8 1 mg L 较初始条件提高了 92 100 还有人研究了铵盐 磷酸盐和柠檬酸盐对虾青素合成的影响 低浓度的铵盐或 磷酸盐可以提高酵母细胞中虾青素含量和脂肪酸含量 当铵盐浓度为12 9 mmol L时 虾青素的含量达到 0 23 mg g 2 3 mg L 而磷酸盐浓度为 0 65 mmol L时 虾青素 含量则是 0 21 mg g 2 4 mg L 11 此外 添加柠檬酸盐也能明显提高酵母细胞中 虾青素的浓度 当细胞处于低铵盐或磷酸盐 还有柠檬酸盐刺激状态下色素合成增 加 但同时蛋白质的合成较少了 这说明蛋白质合成的限制是影响色素合成的一个 很重要的因素 11 一些学者研究了烟碱和二苯胺对色素形成的影响 发现烟碱能抑 制番茄红素的环化反应 而二苯胺能阻遏 胡萝卜素的氧化和八氢番茄红素的脱氢这 两步反应 38 通过白光灯的刺激来提高色素的产量这一研究已经用于很多微生物 包括杜氏 11 华华 中中 科科 技技 大大 学学 博博 士士 学学 位位 论论 文文 盐藻 雨生红球藻 绿藻 螺旋藻 红酵母 毛霉和黄杆菌等 6 当平板上的法夫酵 母酵母菌落暴露在高强度的白光灯下时 其生长受到抑制 而且色素合成减弱 但 是液体培养基中的细胞受到光的刺激后色素合成却有所增强 102 法夫酵母中的色素 合成是具有光诱导性的 但是这种刺激具有瞬时性 当细胞重新放回暗处培养是总 色素的含量是降低的 103 V zquez 104 也报道了利用光刺激提高了法夫酵母单位体积 培养基的色素产量 de la Fuente等 77 报道了法夫酵母用摇瓶发酵时在白光灯刺激下 虾青素产率高达 221 mg L 4 0 mg g 紫外灯刺激后色素产量更高 达到 235 mg L 4 4 mg g 单线态氧和过氧化氢对法夫酵母中色素组成和合成的影响有所不同 单线态氧 可以诱导色素的积累 而过氧化氢则降低虾青素的含量 促进了 胡萝卜素的积累 在氧化应激状态下 14C标记的类胡萝卜素的变化证明了终产物虾青素的反馈调节作 用 105 而且在过氧化氢的的作用下法夫酵母的虾青素产量显著提高 色素含量和产 量分别达到 1 3 mg g和 10 4 mg L 分别高于对照 83 和 65 胞内虾青素含量提高 的同时 胡萝卜素的比例相应降低 而且胞内的催化酶活力都有所升高 这说明过氧 化氢刺激细胞发生一个抗氧化响应从而导致虾青素的合成增加 74 汪等 106 研究了不同来源的真菌诱导子 红酵母 粘红酵母 贝壳状革耳菌 杂 色云芝 高山被孢霉和高大毛霉 对法夫酵母细胞的生长 总类胡萝卜素和虾青素 产量的影响 结果显示来自高大毛霉 粘红酵母和红酵母的真菌诱导子刺激了类胡 萝卜素和虾青素的合成 而且高大毛霉真菌诱导子使细胞生物量也有所增加 一种半连续灌注培养模式 培养基定时更新 细胞维持不变 被用来对法夫酵 母进行摇瓶发酵 每 12 小时瓶中 25 培养基用等量的新鲜培养基进行替换 持续 10 d后细胞的生物量达到 65 6 g L 虾青素的产量达到 52 5 mg L 虾青素的产率是 4 38 mg L d 分别是批次发酵的 8 4 倍 5 6 倍和 2 3 倍 添加过氧化氢到该培养体系 后虾青素产量和产率分别提高到 58 3 mg L和 4 86 mg L d 补料发酵培养酵母细 胞的生物量和虾青素产量都要比灌注培养模式的低 其主要原因可能是发酵液中具 有抑制作用的代谢产物的积累 如乙醇和乙酸