蛋白质不稳定性

第二章蛋白质的不稳定性及对策刘耀玺河南科技大学林业职业学院生物技术教研室 一 蛋白质失活的机制 根据蛋白质的结构层次不同 经常将蛋白质的结构分为一级结构 二级结构 三级结构和四级结构 蛋白质的一级结构就是共价主链的氨基酸序列 有时也称化学结构 二 三 四级结构又称空间结构 即三维结构 或高级结构 蛋白质的生物功能决定于它的高级结构 高级结构是由一级结构即氨基酸序列决定的 而氨基酸序列是由遗传物质DNA的核苷酸序列决定的 肽键 CO NH 是连接多肽链主链中氨基酸残基的共价键 二硫键 S S 是使多肽链之间交联或使多肽链内成环的共价键 一 蛋白质失活的机制 蛋白质不稳定 失活 的表现分为两种 即化学不稳定和物理不稳定 化学不稳定是指蛋白质分子通过共价键的形成和断裂形成新的化学实体 物理不稳定指蛋白质分子的高级结构的物理转变 无共价键改变 物理不稳定包括变性 聚集 沉淀和表面吸附 蛋白质一旦发生了化学不稳定 就会完全丧失其原有生理活性 产生新的功能活性或完全丧失生物活性 但物理不稳定现象一般可以通过特定的途径恢复其空间结构 而恢复原有的活性 我们称这一过程为蛋白质的复性 二 蛋白质结构中影响稳定性的重要因素 蛋白质的天然折叠结构决定于3个因素 1 与溶剂分子 一般为水 的相互作用 2 溶剂的pH和离子组成 3 蛋白质的氨基酸序列 前两个因素的影响明确 易理解 而氨基酸序列的作用则不那么直觉 实际上 一级结构便于序列上相邻部分之间短程相互作用的形成 也便于相隔部分之间长程相互作用的出现 虽然蛋白质分子的整个结构出看起来像是无组织的随机排列 然而其结构中无例外地有多种力处于精细的平衡之中 正是它决定了蛋白质的独特构象 二 蛋白质结构中影响稳定性的重要因素 稳定蛋白质三维结构的作用力主要是一些所谓的弱的相互作用或称非共价键或次级键 包括 氢键 范德华力 疏水作用和盐键 离子键 此外 共价二硫键在稳定某些蛋白质的构象方面也起着重要作用 这几种作用力的键能 断裂该键所需的能量 都是较低的 二 蛋白质结构中影响稳定性的重要因素 氢键13 30KJ mol 1范德华力4 8KJ mol 1疏水作用12 20KJ mol 1 注意 疏水作用的数值表示在25 非极性侧链能够从蛋白质内部转移到水介质中所需的自由能 它与其他键的键能不同 此数值在一定范围内随温度的升高而增加 实际上它并不是键能 此能量的大部分并不用于伸展过程中键的断裂 盐键12 30KJ mol 1二硫键210KJ mol 1 二 蛋白质结构中影响稳定性的重要因素 一 氢键 氢键在稳定蛋白质的结构中起着极其重要的作用 多肽主链上的羰基和酰胺基之间形成的氢键是稳定蛋白质二级结构的主要作用力 另外 氢键还可以在侧链与侧链 侧链与介质水 主链肽基与侧链或主链肽基与水之间形成 大多数蛋白质分子所采取的折叠策略是使主链肽基之间形成最大数目的分子内氢键 如 螺旋 折叠 与此同时保持大多数能成氢键的侧链处于蛋白质分子的表面将与水结合 二 蛋白质结构中影响稳定性的重要因素 二 范德华力 范德华相互作用 广义的范德华力包括3种较弱的作用力 即 定向效应 发生在极性分子或极性基团之间 它是永久偶极间的静电相互作用 氢键可被认为属于这种范德华力 诱导效应 发生在极性物质与非极性物质之间 这是永久性偶极与由它诱导而来的诱导偶极之间的静电相互作用 分散效应 是在多数情况下起主要作用的范德华力 它是非极性分子或基团间仅有的一种范德华力 即狭义的范德华力 通常所说的范德华力指的就是这种作用力 它是瞬时偶极间的相互作用 偶极方向是瞬时变化的 二 蛋白质结构中影响稳定性的重要因素 瞬时偶极是由于所在分子或基团中电子电荷密度的波动 即电子运动的不对称性造成的 瞬时偶极可以诱导周围的分子或基团产生诱导偶极 诱导偶极反过来又稳定了原来的偶极 因此它们之间产生了相互作用 狭义的范德华力是一种很弱的作用力 而且随非共价键合原子与分子间距离 R 的6次方的倒数而变化 虽然就个别来说 范德华力是很弱的 但是范德华相互作用数量大 并且具有加和效应和位相效应 当分子或集团相同时 其瞬间偶极矩同位相 从而产生最大的相互作用 因此 就成为一种不可忽视的作用力 二 蛋白质结构中影响稳定性的重要因素 三 疏水作用 水介质中球状蛋白质的折叠总是趋向于把疏水残基埋藏在分子的内部 这一现象称为疏水作用或疏水效应 它在稳定蛋白质的三级结构方面占有突出地位 疏水作用其实并不是疏水基团之间有什么吸引力的缘故 而是疏水基团或疏水侧链出自避开水的需要而被迫接近 当然 当疏水基团接近到等于范德华距离时 相互间将有弱的范德华引力 但这不是主要的 蛋白质溶液中的熵增加是疏水作用的主要动力 疏水作用在生理温度范围内随温度升高而加强 但超过一定温度后 50 60 因侧链而异 又趋减弱 因为超过这个温度 疏水基团周围的水分子有序度降低 因而有利于疏水基团进入水中 非极性溶剂 去污剂是破坏疏水作用的试剂 因此是变性剂 尿素和盐酸胍既能破坏氢键 又能破坏疏水作用 因此是强变性剂 二 蛋白质结构中影响稳定性的重要因素 四 盐键 又称盐桥或离子键 它是正电荷与负电荷之间的一种静电相互作用 在生理pH下 蛋白质中的酸性氨基酸 天冬氨酸和谷氨酸 的侧链可离解成负离子 碱性氨基酸 赖氨酸 精氨酸和组氨酸 的侧链可离解成正离子 在多数情况下这些基团都分布在球状蛋白质分子表面 而与介质水分子发生电荷 偶极之间的相互作用 形成排列有序的水化层 这对稳定蛋白质的构象有着一定作用 带电荷的侧链也在蛋白质分子内部出现 它们一般与其他基团形成强的氢键 但是偶尔也有少数带相反电荷的侧链在分子的疏水作用内部形成盐键 在疏水环境中 介电常数比在水中低 相反电荷间的吸引力相应增大 当荷电侧链从水中转移到分子内部时 它周围有序排列的水分子被释放到介质水中 因此 盐键的形成不仅是静电吸引而且也是熵增加的过程 升高温度 可以增加盐桥的稳定性 此外 盐键因加入非极性溶剂而加强 加入盐类而减弱 二 蛋白质结构中影响稳定性的重要因素 五 二硫键 二硫键的形成并不规定多肽链的折叠 然而一旦蛋白质采取了它的三维结构 则二硫键的形成将对此构象起稳定作用 同一个蛋白质中 有些二硫键是生物活性所必需的 另一些二硫键则不是生物活性所必需的 但与维持蛋白质的稳定有关 假如蛋白质中所有的二硫键相继被还原 将引起蛋白质的天然构象改变和生物活性丢失 三 环境因素对蛋白质稳定性的影响 物理因素 温度 紫外线照射 高压和表面张力等 化学因素 有机溶剂 脲 胍 酸 碱等 如尿素和盐酸胍 一方面能与多肽主链竞争氢键 破坏蛋白质的二级结构 更重要的是它们可以增加非极性侧链在水中的溶解度 因而降低了维持蛋白质三级结构的疏水相互作用 酶的作用 一些蛋白质分解酶类的作用 微生物因素 微生物分解利用蛋白质进行生长繁殖 三 环境因素对蛋白质稳定性的影响 值得注意的是 蛋白质的变性是一个协同过程 它是在所加变性剂的很窄浓度范围内或很窄pH或温度间隔内突然发生的 四 分离纯化中保持蛋白质稳定的方法 1 尽量在相对密封和无菌的环境下快速进行分离纯化操作 2 在生理温度和压力范围内完成分离纯化操作 3 慎用溶剂和酸 碱 盐类 使用前要进行详细的试验 确定最佳添加量和条件 4 钝化或抑制蛋白质分解酶类的活性 5 选择合适分离方法 如 凝胶过滤 离子交换 吸附层析 亲和层析 电泳 结晶等 五 包含体的形成与性质 重组蛋白质的过量表达常常导致其在胞内发生错误折叠和聚集 形成被称为包含体的集聚体 包含体主要是由蛋白质构成 其中大部分是基因表达产物 这些基因表达产物的一级结构是正确的 但立体结构是错误的 所以没有生理活性 对于以包含体形式表达的蛋白质 需要在分离回收包含体后 溶解包含体使其肽链伸展 然后在合适的溶液环境下使目标蛋白质恢复天然构型和生物活性 这一过程称为蛋白质的体外再折叠或复性 五 包含体的形成与性质 一 包含体的形成目前 关于包含体的形成机理尚不完全清楚 一般认为包含体的形成是部分折叠的中间态之间疏水性相互作用的结果 主要原因是蛋白质本身具有易于聚集沉淀的性质 或表达产物周围的物理环境 如温度 离子组成 不适或某些折叠辅助因子 分子伴侣 的作用 五 包含体的形成与性质 现代研究表明 在大多数情况下 包含体的形成是蛋白质过量表达的结果 而与蛋白质的种类和表达系统无关 即包含体的形成与其相对分子质量 疏水性以及折叠途径等内在性质没有必然的联系 换句话说 对于任何蛋白质和任何表达系统 在过量表达的情况下都可能形成包含体 蛋白质的折叠复性和包含体的形成为动力学竞争的结果 五 包含体的形成与性质 UkiIkrNkaA其中 U为伸展肽链 I为折叠过程的中间态 N为天然活性态 A为聚集体 包含体 ki kr ka分别为中间体生成速率常数 折叠速率常数和聚集体生成速率常数 活性产物N的形成为分子内折叠反应 折叠速率与浓度成正比 聚集体A的形成反应在分子间发生 反应速率与浓度的高次方成正比 即反应级数 2 因此 如果新生肽浓度增加和中间态的疏水相互作用就可能导致包含体的形成 五 包含体的形成与性质 上述分析表明 包含体的形成是不可预测的 取决于系统的表达速度和浓度 但当含有二硫键的蛋白质在细菌的胞液中表达时 由于胞液为还原性 巯基间不能被氧化形成二硫键而导致错误折叠 必然会形成包含体 五 包含体的形成与性质 二 包含体形成的利与弊胞内重组蛋白质包含体的沉积可能是 天堂 也可能是 地狱 至于是 天堂 还是 地狱 主要取决于沉积的包含体蛋白质是否容易复性 1 包含体的体内抑制对于那些难于复性的蛋白质 如相对分子量较大 结构复杂和含有较多二硫键的蛋白质 包含体的形成意味着表达系统的失败 必须着力于胞内可溶性蛋白质表达的研究 避免包含体的形成 提高可溶性蛋白质的表达量 即包含体的体内抑制 主要方法有 五 包含体的形成与性质 1 降低细胞培养温度 减缓蛋白质的表达速度和降低表达量 2 将目标蛋白质与分子伴侣蛋白 折叠酶和二硫键异构酶共表达 弥补外源蛋白质表达过程中缺乏的辅助因子 3 使用非代谢性碳源 降低代谢速度和蛋白质表达量 4 将目标蛋白质与亲水性蛋白质融合表达 常用的融合蛋白质有谷胱甘肽转移酶 麦芽糖结合蛋白和硫氧还原蛋白 五 包含体的形成与性质 2 以包含体形式表达重组蛋白质的优势 1 包含体蛋白质主要在以大肠杆菌为宿主细胞的原核细胞表达系统中形成 而大肠杆菌生长速度快 易于高密度培养 有利于大规模生产目标蛋白质 2 包含体是在过量表达的情况下形成的 因此一般包含体蛋白质的表达量都很高 3 包含体富含目的基因表达产物 有利于后续的分离纯化 在适宜的包含体提取和纯化条件下 目标产物纯度可达90 以上 以包含体形式表达重组蛋白质的优势 4 沉积于包含体内的目标蛋白质不易被蛋白酶水解 5 对于那些对宿主细胞有毒害作用或杀伤作用的目的基因表达产物 以包含体形式表达是最可取的生产途径 五 包含体的形成与性质 二 包含体的性质1 包含体为高密度蛋白质聚集体 密度约1 3g ml 颗粒尺寸约0 1 1 0 m 有些达3 m 对表达产物和表达系统而异 2 包含体通常位于细胞质中 而一些分泌性蛋白质可能在外周胞质中形成 3 包含体的主要成分为基因表达产物 占包含体的50 以上 其他成分因表达系统而异 包括磷脂 微量的质粒 rRNA和RNA聚合酶 更多的是黏附于包含体颗粒的外膜蛋白质 六 包含体的分离纯化与溶解 1 包含体的分离包含体分离的最常用的方法就是 机械破碎后进行离心沉降和膜分离 洗滤 包含体为致密的蛋白质聚集体 密度较大 达1 3g ml 高强度的机械破碎后 低速离心便可沉淀 从而使之与细胞碎片和可溶性产物分离 六 包含体的分离纯化与溶解 2 包含体的纯化原因 蛋白质的折叠复性和包含体的形成为动力学竞争的结果 也就是说 蛋白质的复性是分子内折叠和分子间聚集反应的竞争动力学过程 因此 为了提高蛋白质的复性收率 必须抑制聚集体的生成 促进复性反应向正确折叠的方向进行 研究表明 在质粒DNA 脂多糖和其他蛋白质存在时 蛋白质的聚集体生成速率增大 复性收率降低 而纯化的变性 还原蛋白质的复性收率可以得到大幅度的提高 因此 包含体的纯度对复性收率影响显著 为了实现较高的蛋白质复性收率 必须进行包含体的纯化 六 包含体的分离纯化与溶解 方法 包含体的纯化过程因表达系统和表达产物而异 没有通用的最佳方案 因此 对于特定的表达系统和表达产物 需要根据具体情况进行过程开发试验 确定适宜的纯化方案 经常采用的包含体分离纯化过程包括差速离心和反复洗涤步骤 以最大限度地清除难以去除的膜蛋白质 可参考的一般过程如下 六 包含体的分离纯化与溶解 路线1 细胞破碎 为提高下一步的离心分离效率 需进行高强度的破碎 利用高压匀浆破碎时需反复操作多次 离心沉降回收包含体 在较高的离心机转数 离心力 下除去可溶性组分和沉降速度较小的细胞碎片 回收沉降的粗包含体 粗包含体的洗涤 向粗包含体中加入鳌合剂EDTA 乙二胺四乙酸 和低浓度变性剂 如1 4mol L尿素 或1一2mol L盐酸胍 或表面活性剂 如1 20g LTritonX 100聚氧乙烯烷基酚 溶解吸附在包含体表面的磷脂和膜蛋白质 同时加入一定浓度的蔗糖 提高包含体悬浮液的密度 六 包含体的分离纯化与溶解 离心沉降回收包含体 在较低的转数下离心分离 回收沉降的包含体 根据需要 可重复上述步骤 和 直至达到满意的包含体纯度 六 包含体的分离纯化与溶解 细胞破碎可采用机械破碎和酶解相结合的方法 以提高破碎效率 包含体纯化过程中也可利用核酸水解酶 提高核酸去除率 DeBernardezClark等提出的利用酶解辅助细胞破碎和包含体纯化的过程如下 路线II 离心分离 回收细胞 向回收的细胞中加入含lmmol LEDTA和1 5mg mL溶菌酶的Tris缓冲溶液 三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液 0 lmol L pH 7 0 细胞浓度为20g L 湿重 总体积为V 放置30min 六 包含体的分离纯化与溶解 细胞破碎 反复机械破碎 使细胞破碎完全 核酸水解 向细胞破碎液中加入DNA水解酶 DNase 至10 g mL和MgCl2至3mmol L 25 温浴30min 水解DNA 包含体洗涤 向上述悬浮液中加人TritonX 100至20g L NaCl至1 5mo1 L EDTA至20mmo1 L 悬浮液体积为3V 4 搅拌30min 离心分离回收包含体 包含体洗涤 向回收的包含体中加入Tris至0 lmol L pH 7 0 EDTA至20mmol L 悬浮液体积为8V 离心分离回收纯化的包含体 六 包含体的分离纯化与溶解 3 包含体的溶解目的 获得适当纯度的包含体后 需要对包含体进行溶解 使目标蛋白质的肽链伸展 为进一步的复性创造条件 方法 包含体溶解的方法 1 加入高浓度的强变性剂 如6 8mol L的盐酸胍或8mol L的尿素 2 加入硫氰酸盐或表面活性剂 3 对于含有二硫键的蛋白质 还需加入还原剂解离错配的二硫键 六 包含体的分离纯化与溶解 常用的还原剂有1 100mmol L的二硫苏糖醇 DTT 1 200mmol L的 巯基乙醇和半胱氨酸等 有时还需要加入螯合剂 以清除重金属离子 如加入2mol L的EDTA等 注意 溶解后的包含体蛋白质中仍会存在一些诸如非目标蛋白质 核酸和细胞膜组分等杂质 为了提高复性收率 在复性前要对变形 还原的蛋白质进一步纯化 主要方法有凝胶过滤色谱 离子交换色谱 反相色谱和固定化金属离子色谱等 纯化操作中使用的流动相需保证蛋白质处于变性 还原状态 如苯酚 正丁醇等 如果要保存变性蛋白质 可以将蛋白质变换到酸性溶液中 10 醋酸或5 10mmol L盐酸 并冷冻干燥 复性前用变性剂重新溶解干粉 就可以进行蛋白质的复性操作 七 蛋白质复性 一 蛋白质复性的方法 七 蛋白质复性 1 直接稀释复性 即将变性蛋白质溶液直接稀释到适宜的复性缓冲液中 变性蛋白质是溶解在高浓度变性剂中的 降低变性剂浓度至非变性浓度范围即可引发蛋白质的折叠复性 当变性剂浓度降低后 伸展的肽链U迅速折叠成具有丰富的二级结构 螺旋和 折叠结构 和部分三级结构的中间体I 该过程非常迅速 通常在几毫秒内完成 因此 I的生成可以认为是瞬间完成 即ki 蛋白质的折叠复性和聚集体的形成过程可以简化为从中间体I折叠成天然活性态N和生成聚集体A的平行反应 AKaIKrN 七 蛋白质复性 注意 聚集体的形成是蛋白质过量表达的结果 因此 在这个过程中 蛋白质的复性收率一般是随变性蛋白质溶液浓度的提高而降低的 而聚集体的生成速率随浓度的提高而增大 即 U 则I N 因此 在稀释复性过程中 若复性系统的混合不利 会造成局部蛋白浓度过高 使复性收率下降 在设计复性反应器时 要尽量考虑混合搅拌均匀 七 蛋白质复性 对于含有二硫键的蛋白质的复性 需要添加氧化剂和还原剂 调节复性液的氧化还原环境 促进正确二硫键的形成 常见的氧化 还原剂有 氧化型谷光甘肽 GSSG 还原型谷光甘肽 GSH 胱氨酸 半胱氨酸或在金属离子 如Cu2 存在下的空气中氧化 氧化复性通常在弱碱性 pH 7 5 9 5 缓冲溶液中进行 在此pH值条件下有利于硫醇阴离子的形成 促进二硫键的形成和交换 同时 氧化还原剂的浓度对复性收率影响显著 具体浓度范围要根据实验确定 因为 一般情况下 不同蛋白质的最佳复性条件不同 并且同一种蛋白质在不同浓度下的最佳条件也不完全相同 这也是蛋白质复性的特点和难点之一 七 蛋白质复性 2 流加复性降低蛋白质浓度有利于获得较高的复性收率 因此 为了提高复性收率 通常需要在较低的浓度下进行蛋白质复性操作 有时蛋白质的浓度需低于0 01mg ml 但是 降低蛋白质浓度势必会增大复性液的体积 给后续的分离纯化增加困难 为了实现高浓度下的高收率复性 产生了将变性蛋白质分批次加入到复性液中或采用连续流加到复性液中的流加复性法 由于在流加变性蛋白质的同时 复性液中的蛋白质发生折叠复性 使变性蛋白质 折叠中间体 浓度始终保持在较低的水平 最终可在较高的蛋白质浓度下获得较高的复性收率 七 蛋白质复性 3 透析 或洗滤 复性 即采用高亲水性膜材料进行透析或超滤的方法降低变性剂浓度和调节复性液的氧化还原环境 4 添加剂辅助复性 由于聚集体的形成是导致复性收率降低的主要原因 在控制复性液的pH值 温度和氧化还原剂浓度等参数同时 研究者努力尝试在稀释复性中添加各种小分子溶质 以抑制聚集体的生成 即利用添加一些小分子溶质等辅助因子的稀释复性法 又称为稀释添加复性 常用的稀释添加剂见下表 七 蛋白质复性 七 蛋白质复性 七 蛋白质复性 添加剂辅助蛋白质复性的机理尚不完全清楚 但一般认为主要有以下两种作用 稳定天然肽蛋白质的结构 降低错误折叠蛋白质的稳定性 提高折叠中间体或伸展肽链的溶解度 稳定性 不同添加剂的作用机理不同 甘油的作用是稳定天然态蛋白质结构 提高其热力学稳定性 促进折叠反应的进行 低浓度变性剂 聚乙二醇和表面活性剂等其他大部分添加剂的作用是提高折叠中间体或伸展肤链的溶解度 抑制聚集体的生成 低浓度变性剂 如盐酸胍 可诱导酸变性蛋白质二级结构的生成 稳定复性过程中的熔球态中间体 七 蛋白质复性 蛋白质折叠复性过程复杂多变 利用稀释添加剂需要注意如下问题 添加剂辅助蛋白质复性的作用具有选择性 即一种添加剂可能对某种蛋白质复性具有辅助作用 而对其他蛋白质复性无作用 甚至起反作用 例如 聚乙二醇可辅助碳酸脱水酶 carbonicanhydraseB 复性 但对溶菌酶复性无影响 七 蛋白质复性 对于那些稳定折叠中间体或伸展肤链的添加剂 添加剂的辅助作用在一定的浓度范围内有效 即存在最佳浓度或浓度范围 在较低的浓度下添加剂的辅助作用不明显 而在较高的浓度下复性收率亦降低 这是由于这类添加剂在抑制聚集体生成的同时 也会抑制蛋白质的折叠复性 造成折叠速率和聚集体生成速率均随浓度提高而下降 添加剂的最佳浓度或浓度范围与蛋白质种类和浓度有关 即不同蛋白质复性所需的添加剂浓度不同 并且随蛋白质浓度的提高 所需添加剂浓度也会提高 因此 一般添加剂的辅助作用在较低的蛋白质浓度下 0 1 lmg mL 有效 在较高的蛋白质浓度下由于分子间聚集的趋势强烈 添加剂的作用不明显 七 蛋白质复性 在生理环境下 低浓度蛋白质的折叠可在数分钟内完成 一般不超过60min 但是 大部分添加剂在抑制聚集体生成的同时 也会抑制蛋白质的折叠复性 造成折叠速率降低 因此 在这类添加剂的存在下 由于复性速率较低 需要较长的复性时间 5 40h 才能获得较高的复性收率 因此 利用添加剂提高复性收率常需以延长复性操作时间为代价 七 蛋白质复性 在包含体蛋白质的复性中 若利用盐酸肌或尿素溶解包含体 应首先考虑通过调节盐酸胍或尿素的浓度来获得满意的复性效果 只有在复性效果不佳的情况下才考虑其他添加剂 在后续的分离过程中表面活性剂类添加剂的去除是必须考虑的问题 表面活性剂与蛋白质结合作用较强 长时间作用还会引起蛋白质变性 需要及时除去 离子型表面活性剂可用离子交换色谱去除 七 蛋白质复性