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实验七淀粉酶活力的测定 一 实验目的 掌握测定淀粉酶活力的原理和基本方法 二 实验原理 酶是一种具有高度专一性的催化剂 其催化能力的大小用酶的活力来表示 酶活力也称酶活性 是以酶在最适温度 最适pH等条件下 催化一定的化学反应的初速度来表示 本实验是以一定量的 淀粉酶液 于37 pH6 8的条件下 在一定的初始作用时间内将淀粉转化为还原糖 然后通过与DNS试剂作用 比色测定求得还原糖的生成量 从而计算出酶反应的初速度 即酶的活力这里规定 一个淀粉酶活力单位为在37 pH6 8的条件下 每分钟水解淀粉生成1mg还原糖所需要的酶量 1U 1mg还原糖 min mL酶 三 实验材料及设备 1 材料淀粉酶液 粗酶液 盐析液 脱盐液 2 仪器分光光度计恒温水浴沸水浴3 器材刻度试管 25mL 17移液管 1mL 3 取稀释后的酶液 烧杯 250mL 1滴管 2洗耳球 2洗瓶 试管架 移液管架 玻棒 各1移液器 专取NaOH注射器 专取蛋白样品 四 试剂的配制 1 淀粉溶液 0 5 称取5g可溶性淀粉 溶于1000mL热水中 2 3 5 二硝基水杨酸试剂 DNS试剂 3 磷酸缓冲液 0 1mol L pH6 8 含0 3 NaCl4 NaOH溶液 2 5mol L 五 操作步骤 1 淀粉酶的制备 1 取硫酸铵沉淀法纯化蛋白质实验中获得的粗酶提取液解冻 取上清液0 05mL 加蒸馏水稀释到25mL 摇匀备用 2 取硫酸铵沉淀法纯化蛋白质实验中获得的盐析蛋白质解冻 取上清液0 05mL 加蒸馏水稀释到25mL 摇匀备用 3 取葡聚糖凝胶层析脱盐获得的蛋白液解冻 取0 05mL 稀释 收集1管的同学 将0 05mL稀释到15mL收集2管的同学 将0 05mL稀释到10mL 试管排列顺序 装约20mL淀粉溶液 标记 转至37 水浴锅中 因淀粉中含有少量还原糖 某些溶液有色素 杂质 需查看酶不水解淀粉的情况 37 室温 六 结果处理 1 分别计算0时刻 5min时刻的A540nm平均值 2 根据图表中的实验结果 并利用实验 3 5 二硝基水杨酸比色法测定糖的含量 中制作的标准曲线 计算淀粉酶的活力 需要详细过程 七 思考题 1 在测定酶活力时应注意哪些反应条件 为什么 2 本实验中两次加入NaOH溶液的意义是什么 八 分析 1
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