青霉素课程设计.doc

青霉素课程设计生物 学术知识 2007-11-21 09:51:05 阅读1534 评论15 字号：大中小订阅 青霉素的生产设计姓 名： 曾长金 指导教师： 李 凛 彭 书 明 完成日期： 2007-11-21 【长金设计任务书】. 3一、设计题目：青霉素生产设计. 3二、设汁任务. 3三、设备型号. 3四、设计内容. 3五、设计基础数据. 3长金设计方案简述：. 3一、青霉素【简介】. 3二、青霉素【生产背景】. 4三、青霉素【生产现状】. 5四、青霉素【生产原理】. 5五、青霉素【生产工艺简述】. 5设计方案. 6二、【培养基 】. 6三、【生产】. 6四、【结果与讨论】. 7五、【青霉素生产菌种的选育】. 7六、【pH控制】. 7七、【发酵罐搅拌器的转速与青霉素产生菌生长代谢的关系】. 7设计心得. 8附图. 8【长金设计任务书】一、设计题目：青霉素生产设计二、设汁任务(1)保证青霉素能够高质量高效率的生产(2)合理设计生产使青霉素取得高经济效益三、设备型号设备型式为筛板塔或浮阀塔四、设计内容(1)设计方案的确定及流程说明。(1)对发酵过程的控制(2)杂菌的控制与灭菌(3)空气与蒸汽的控制(4)成品的鉴定(3)设计结果概要或设计一览表。(4)生产工艺流程图(5)对本设计的评述或有关问题的分析讨论。五、设计基础数据(1)进料泵频率、发酵罐温度、罐重、PH值、搅拌器转速、发酵罐压力。(2)溶解氧含量、泡沫高度、硫铵含量、糖浓度、前体浓度。(3) BA用量、破乳剂用量、重相液位。(4) 碳酸氢钠的用量、活性碳的用量、结晶温度、丁醇用量、青霉素钠盐晶体效价。长金设计方案简述：一、青霉素【简介】 青霉素是指分子中含有青霉烷，能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素。青霉素又被称为青霉素G、peillin G、 盘尼西林、配尼西林、青霉素钠、苄青霉素钠、青霉素钾、苄青霉素钾。结构见图【青霉素发展史】1928年，英国细菌学家弗莱明从在被污染的葡萄球菌培养基中发现了“青霉素”。1939年，英国牛津大学病理学家弗洛里和德国生物化学家钱恩得到了英国和美国的关组织和基金会的支持，经过努力提纯出青霉素的结晶。1940年，青霉素时入临床试验阶段，经过对五位受试者的临床观察证明青霉素具的较好的效果。1943年青霉素药物完成了商业化生产并且正式进入临床治疗。进入八十年代，特别是八十年代的后5年，即1985-1990年，世界青霉素产量增长迅猛，市场需求扩大，可以说这一时期是青霉素发展的黄金时期；九十年代初期，世界青霉素虽然遭受了一次重创，但是经过几年的努力，其产量已恢复到了原来的水品，1995年市场已趋稳定。从1995年开始，青霉素市场对其原料药的需求，无论是青霉素G钾，还是青霉素V钾，都已经达到饱和。青霉素类的抗生素临床实践中得到广泛的应用，挽救了成千上万人的生命。【特点】 青霉素是抗菌素的一种，是指从青霉菌培养液中提制的分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素。青霉素类抗生素是-内酰胺类中一大类抗生素的总称。但它不能耐受耐药菌株(如耐药金葡)所产生的酶，易被其破坏，且其抗菌谱较窄，主要对革兰氏阳性菌有效。青霉素G有钾盐、钠盐之分。 青霉素类抗生素的毒性很小，由于-内酰胺类作用于细菌的细胞壁，而人类只有细胞膜无细胞壁，故对人类的毒性较小，除能引起严重的过敏反应外，在一般用量下，其毒性不甚明显.青霉素通过抑制细菌细胞壁四肽则链和五肽交连桥的结合而阻碍细胞壁合成而发挥杀菌作用。对革兰阳性菌有效，由于革兰阴性菌缺乏五肽交连桥而青霉素对其作用不大。【应用】见手册二、青霉素【生产背景】青霉素是抗生素的一种，是从青霉菌培养液中提制的药物。由于青霉素是一种酸性物质，性质不稳定，通常用碱中和，酸碱中和之后的产物即为盐，所以青霉素通常以青霉素工业盐的形式存在。 青霉素产品链很长，包括原料药、中间体和制剂。青霉素工业盐为最初级产品，可作为原料药直接加工成制剂，这大约消耗国内青霉素工业盐产量的，另有一小部分加工成兽药或饲料添加剂，而左右的青霉素工业盐是制备、的原料。（六氨基青霉烷酸）是青霉素工业盐、酰基酶在严格的工艺条件下，经过裂解后获得的重要的中间体，是合成氨苄西林、阿莫西林、派拉西林的重要原料。（氨基去乙酰氧基头孢烷酸）是一种重要的头孢类抗菌素半合成的中间体，在医药工业上用于合成头孢氨苄、头孢拉啶、头孢克罗、头孢他美酯和头孢羟氨苄等药物，这些药物都是市场用量较大的抗生素。、都是通过化学合成的方法对青霉素的母核进行改造后的产物，因此以这两中间体为原料合成的下游产品（如阿莫西林、头孢拉啶等）被称为半合成青霉素。青霉素自问世以来,一直以疗效显著而成为抗生素市场的基石。上世纪年代，青霉素市场进入相对饱和状态，经过年的价格战，青霉素工业盐出口价格从年的美元亿单位狂跌至年的美元亿单位，生产厂家也仅剩华药、哈药、石药、鲁抗等“四大家族”。经过一番调整，年第四季度以来，青霉素工业盐价格开始上扬，国内生产企业增加到十几家，产量也节节攀升：年产量达到万吨，比上年增加；年产量达万吨，同比增加。这段时间内青霉素工业盐价格一直稳中有升，出口价格保持在美元亿单位，国内供应价格保持在元亿单位以上。三、青霉素【生产现状】【青霉素生产现状】：发酵过程是制药企业和化工企业的重要生产环节,同时也是一个非常复杂的生物化学过程。随着企业生产规模的逐步扩大,对生产过程自动化各项指标的要求也愈来愈高,控制方案也向着更加复杂,更加高级的方向发展,这些都给它的自动化带来了一定的难度,传统的控制方法已经无法满足这种现代大生产的要求。近些年,随着计算机技术和智能控制技术的飞速展,其特点是向计算机网络控制扩展,将过程控制、监督控制和管理调度进一步结合起来,达到高度集成,实现测、控、管一体化。 目前在国内青霉素的生产中，大多数厂家的前期生产工艺发酵罐采用传统的恒定转速搅拌器来搅拌发酵液。这种搅拌器的转速是根据产生菌种特性与参照产生菌在不同生长代谢阶段的摄氧要求的最高转速设定的，为恒定转速发酵工艺奠定了基础。四、青霉素【生产原理】【天然青霉素】 青霉素G生产可分为菌种发酵和提取精制两个步骤。菌种发酵：将产黄青霉菌接种到固体培养基上，在25下培养710天，即可得青霉菌孢子培养物。用无菌水将孢子制成悬浮液接种到种子罐内已灭菌的培养基中，通入无菌空；气、搅拌，在27下培养2428h，然后将种子培养液接种到发酵罐已灭菌的含有苯乙酸前体的培养基中，通入无菌空气，搅拌，在27下培养7天。在发酵过程中需补入苯乙酸前体及适量的培养基。提取精制：将青霉素发酵液冷却，过滤。滤液在pH22.5的条件下，于萃取机内用醋酸丁酯进行多级逆流萃取，得到丁酯萃取液，转入pH7.07.2的缓冲液中，然后再转入丁酯中，将此丁酯萃取液经活性炭脱色，加入成盐剂，经共沸蒸馏即可得青霉素G钾盐。青霉素G钠盐是将青霉素G钾盐通过离子交换树脂（钠型）而制得。【半合成青霉素】 以6APA为中间体与多种化学合成有机酸进行酰化反应，可制得各种类型的半合成青霉素。6APA是利用微生物产生的青霉素酰化酶裂解青霉素G或V而得到。酶反应一般在4050、pH810的条件下进行；近年来，酶固相化技术已应用于6APA生产，简化了裂解工艺过程。6APA也可从青霉素G用化学法来裂解制得，但成本较高。侧链的引入系将相应的有机酸先用氯化剂制成酰氯，然后根据酰氯的稳定性在水或有机溶剂中，以无机或有机碱为缩合剂，与6APA进行酰化反应。缩合反应也可以在裂解液中直接进行而不需分离出6APA。五、青霉素【生产工艺简述】 青霉素的生产分成发酵工艺和提炼工艺过程。 其中，青霉素发酵过程是属于二次微生物代谢的过程,所获得的是下一级代谢的产物,即菌种在一定条件下(培养基、温度、pH、通气搅拌等)进行培养发酵,经过下一级代谢得到生成物青霉素,此环节是在发酵罐中进行的,最终是微生物分泌大量的抗生素。为了保证发酵过程正常进行,需对一些物理、化学、生理参数进行检测和控制。检测的物理参数有罐温、罐压、冷却水流量及进出口温度;化学参数有尾气中O2含量、CO2含量、罐内溶解氧、pH值等;生理参数有菌丝浓度、基液质浓度、代谢产物浓度等,由于传感器及检测元件等原因,目前生理参数还不能直接在线测量,只能采用模型进行在线推算或离线化验分析。另外发酵过程中还存在一些通过可测参数在线计算来得到的重要参数,如氧摄取率、呼吸商、生物热等。罐温、发酵液pH、发酵液中的DO2及罐压等环境参数对菌丝的生长、衰老及青霉素的合成有很大的影响,因此,控制系统主要就针对这些参数实行自动控制。 总工艺流程：文字和图见手册设计方案见手册 传统的青霉素发酵生产把发酵罐接种量控制在1015 ，种子罐种子液进入发酵罐后，经停滞期、菌丝生长期、菌丝生长到次级代谢的转化期，才进入代谢稳定期，因此停滞期和菌丝生长期长，严重影响了发酵罐的设备利用率和发酵水平的提高。产黄青霉P一8菌种由于是一种具有高摄氧能力的基因工程菌，传统的接种工艺没能充分发挥出该菌种的优良特性，我们通过改进青霉素发酵罐的接种工艺，优化发酵前期工艺，既实现了大幅缩短停滞期和菌丝生长期的目的，又保证了次级代谢阶段的菌丝量和维持时间，从而显著提高了青霉素的生产水平和经济效益。一、【菌种 】产黄青霉P一8，由山东鲁抗医药公司保存。二、【培养基 】种子培养基：玉米浆，蔗糖，硫酸铵，碳酸钙，豆油，消沫剂；pH6265。发酵培养基：玉米浆，磷酸二氢钾，无水硫酸钠。碳酸钙，硫酸锰，硫酸亚铁，消沫剂；pH4749。三、【生产】 1、种罐 2、发酵罐发酵培养基在5O吨发酵罐内经高温消毒后降温至25 ，分别进行种罐种子液接种，发酵罐前期发酵液接种，混合接种和发酵前期工艺优化实验，实验过程中主要控制参数：温度25 ，罐压00900100MPa，搅拌转速130r-min-。，空气流量和补料根据发酵过程中的参数变化进行控制。 3、参数测定和计算方法 【菌浓测定】取发酵液lOml于离心管中，离心(3000 rmin_。)5min，测得沉淀物在培养液中的体积比即为菌浓。 【发酵效价测定】 发酵液经滤纸和微孔滤膜过滤后进行HPLC测定，高效液相色谱仪为Agilent 1100型； 色谱条件：以HAc-NaAc缓冲液一乙腈(体积比80：20)作流动相。检测波长为254 nm，流速12ml-min-。 进样量20 l，柱温25 ，柱型Diamonsil C18(46mm 250mm)，采用外标法测定样品中的青霉素效价。 【发酵指数计算】发酵指数=发酵效价发酵液体积发酵罐体积发酵周期 【发酵提炼的生产指数计算】发酵提炼的生产指数：发酵指数提炼收率四、【结果与讨论】 第一次pH 自控时间影响最为明显，然后依次是起始补糖率、前期空气流量和苯乙酸补加时间。最佳工艺条件为A2Bl ClD3，即起始补糖率为05，苯乙酸补加时间为6h，第一次pH 自控时间为6h，前期空气流量为07vvm。按正交实验得到的最佳工艺条件实验5批，与原工艺条件对照，5批的平均生产指数升高了36。表明实验所确定的工艺条件为较优的工艺条件。【结论】混合接入两种种源，其中种罐种子液的接种量为20 ，60 h左右的前期发酵液的接种量为10 ，总接种量为30 ；优化发酵前期工艺，调整起始补糖率为05 ，苯乙酸起始补加时间为6h，第一次pH 自控时间为6 h，前期空气流量为07 vvm。改进后的接种工艺大幅提高了生产指标，其中发酵指数提高了108 ，提炼收率提高了04，发酵提炼的生产指数提高了II2 。显著提高了青霉素的生产效益。五、【青霉素生产菌种的选育】目的:为了获得比现有青霉素生产菌株985更高产的稳定菌株.方法是自然选育与紫外线诱变育种结合使用,经过初筛、复筛等一系列工作,结果筛选得到高产菌株989.经考察,989菌株是一个比985菌株更高产的稳定菌株,可用于青霉素发酵生产以提高发酵单位.六、【pH控制】发酵液中的pH值对微生物的生长及生成物合成影响很大,必须进行有效控制。在发酵过程中,由于生化反应过程的特性,会使pH值逐渐降低,另外(NH4)2SO4也会作为生物质的合成氮源加入发酵液中。为了维持适宜的值,需加入碱性物质加以调整,而一般是用NH3?H2O来调节发酵液中的pH值,原因是NH?H2O也可作为生物质的氮源物质。同时,由于青霉素菌适宜于稍偏酸性的环境生长,如发酵液中出现偏碱性或中性,不宜于菌体生长和产物合成,菌体衰老也会加快,因此这种pH控制系统中应避免出现超调现象。若产生了超调,即pH值大于设定值时,一般就得靠发酵过程的生化反应机理来自然降低pH值,整个调节速度就比较缓。通常情况下避免超调的办法是采用高比例度的PID调节规律,但这样一来,遇干扰时(若补料时补入(NH4)2SO4,pH值下降),调节过程虽不出现超调现象,但过渡过程时间较长。在研究和设计该控制回路时,最好既保证系统不出现超调,又要有较快的过渡过程。七、【发酵罐搅拌器的转速与青霉素产生菌生长代谢的关系】 根据青霉素的不同产生菌与不同生长代谢阶段对摄氧量的不同要求及搅拌器转速对溶氧浓度占据的主导地位，对青霉素发酵罐的传统搅拌器进行调速技术改造非常必要。通过改造工程，使青霉素发酵工艺中搅拌器转速、通气量、溶氧浓度和罐压等工艺参数有机结合，促使产生菌的生长代谢条件达到最佳状态。【搅拌器】 青霉素生产发酵工艺是产生菌在适合的培养性、PH值、温度、通气和搅拌等条件下进行生长与合成青霉素的代谢活动。发酵工艺的持续时间与发酵液内氧的传递能力、营养物质的消耗程度、有毒性和有抑制性化合物的形成及菌种的物质特性有关。其中通气和搅拌功能是对产生菌提供生长代谢活动的氧源，而搅拌器的功能则是在发酵液通气的条件下，将空气打碎成小气泡，使其均匀分布在发酵液的各个角落，增加气液接触的有效面积，使发酵液随搅拌叶转动形成涡流并提高其湍动程度，减少菌丝因缺氧而产生结团现象，使氧的传递面积增大，延长氧在发酵液中的停留时间，达到增加青霉素产量的目的。【搅拌器转速对青霉素发酵工艺的影响】发酵罐的罐压维持微正状态虽然可以避免负压时造成的染菌和延长氧在发酵液中的停留时间，但是还应当考虑到，如将罐压从微正状态提高时，既不利于产生菌代谢时废气的排除与氧在发酵液内的传递，又增加了设备的负载，同时提高了有害气体的溶解度。在这种情况下，如果单一考虑增大空气流量来提高供氧浓度，将会加快发酵液水分蒸发，随之也会带走更多的挥发性有机酸等其他的中间产物，对产生菌的代谢十分有利。同时，发酵液的黏度也会上升，还会影响液体的湍动程度和氧从气相传递到发酵液中的液膜阻力，使氧的传递阻力增大。此外，发酵液粘度较大时，泡沫将剧增而稳定，且不易破裂，使气液接触的总面积降低。因此，为了消除过多的泡沫就要耗用大量的消沫剂。但是，消沫剂用量过多时，不但不能消除泡沫，反而引起泡沫调节失控，PH值波动，最终导致异常发酵，造成不可挽回的青霉素生产工艺损失。由于空气在发酵液中滞留的时间有限，对溶氧浓度的影响也将远小于搅拌器转速的影响。由此可见，在青霉素发酵工艺中，并不提倡一味地增大空气流量，而应当调整搅拌器的转速，以便满足不同产生菌及其在不同生长代谢阶段对溶氧的需求。但是，如果搅拌器的转速过高，不仅溶氧浓度趋向饱和，并且浪费能源，还容易损伤菌体形态和产生过多的泡沫。设计心得 可以说是很高兴完成这份作业, 因为这对我来说不仅是收获,而是有更多的感触,刚开始做这个作业的时候,我几乎是无从下手的.让人深感烦躁.幸好在老师的指导和自己不断的摸索下找到了一定的方法.这是值得庆幸的.在做这个设计的时候遇到了很多问题,如。 第一次搞这样的课程设计,肯定有好多的不足之处,希望老师多多指点。附图附表（操作规程）及工程图(工艺流程简图、主体设备工艺条件图)：P8-【附图】 9、操作规程 见手册10、参考文献P9-【参考文献】青霉素生产工艺过程一、青霉素的发酵工艺过程1、工艺流程（1）丝状菌三级发酵工艺流程冷冻管（25C，孢子培养，7天）斜面母瓶（25C，孢子培养，7天）大米孢子（26C，种子培养56h,1:1.5vvm）一级种子培养液（27C，种子培养，24h,1:1.5vvm）二级种子培养液（2726C,发酵,7天,1:0.95vvm）发酵液。（2）球状菌二级发酵工艺流程冷冻管（25C，孢子培养，68天）亲米（25C，孢子培养，810天）生产米（28C，孢子培养，5660h,1:1.5vvm）种子培养液（2625-24C，发酵，7天，1：0.8vvm）发酵液。 2、工艺控制（1）影响发酵产率的因素基质浓度 在分批发酵中，常常因为前期基质量浓度过高，对生物合成酶系产生阻遏（或抑制）或对菌丝生长产生抑制（如葡萄糖和钱的阻遏或抑制 , 苯乙酸的生长抑制）, 而后期基质浓度低限制了菌丝生长和产物合成 , 为了避免这一现象 , 在青霉素发酵中通常采用补料分批操作法 , 即对容易产生阻遏、抑制和限制作用的基质进行缓慢流加以维持一定的最适浓度。这里必须特别注意的是葡萄糖的流加 , 因为即使是超出最适浓度范围较小的波动 , 都将引起严重的阻遏或限制 , 使生物合成速度减慢或停止。目前 , 糖浓度的检测尚难在线进 行 , 故葡萄糖的流加不是依据糖浓度控制 , 而是间接根据pH 值、溶氧或 C02 释放率予以调节。 （2）温度 青霉素发酵的最适温度随所用菌株的不同可能稍有差别 , 但一般认为应在25 C 左右。温度过高将明显降低发酵产率 , 同时增加葡萄糖的维持消耗 , 降低葡萄糖至青霉素的转化率。对菌丝生长和青霉素合成来说 , 最适温度不是一样的, 一般前者略高于后者, 故有的发酵过程在菌丝生长阶段采用较高的温度，以缩短生长时间, 到达生产阶段后便适当降低温度 , 以利于青霉素的合成。 （3） pH 值 青霉素发酵的最适 pH 值一般认为在 6. 5 左右 , 有时也可以略高或略低一些 , 但应尽量避免 pH 值超过7.0, 因为青霉素在碱性条件下不稳定, 容易加速其水解。在缓冲能力较弱的培养基中, pH 值的变化是葡萄糖流加速度高低的反映。过高的流加速率造成酸性中间产物的积累使 pH 值降低； 过低的加糖速率不足以中和蛋白质代谢产生的氨或其他生理碱性物质代谢产生的碱性化合物而引起 pH 值上升。 （4）溶氧 对于好氧的青霉素发酵来说 , 溶氧浓度是影响发酵过程的一个重要因素。当溶氧浓度降到 30% 饱和度以下时, 青霉素产率急剧下降, 低于 10% 饱和度时, 则造成不可逆的损害。溶氧浓度过高 , 说明菌丝生长不良或加糖率过低, 造成呼吸强度下降, 同样影响生产能力的发挥。溶氧浓度是氧传递和氧消耗的一个动态平衡点, 而氧消耗与碳能源消耗成正比, 故溶氧浓度也可作为葡萄糖流加控制的一个参考指标。（5）菌丝浓度 发酵过程中必须控制菌丝浓度不超过临界菌体浓度, 从而使氧传递速率与氧消耗速率在某一溶氧水平上达到平衡。青霉素发酵的临界菌体浓度随菌株的呼吸强度 (取决于维持因数的大小, 维持因数越大,呼吸强度越高) 、发酵通气与搅拌能力及发酵的流变学性质而异。呼吸强度低的菌株降低发酵中氧的消耗速率，而通气与搅拌能力强的发酵罐及黏低的发酵液使发酵中的传氧速率上升, 从而提高临界菌体浓度。（6）菌丝生长速度 用恒化器进行的发酵试验证明，在葡萄糖限制生长的条件下，青霉素比生产速率与产生菌菌丝的比生长速率之间呈一定关系。当比生长速率低于0.015h-1时，比生产速率与比生长速率成正比, 当比生长速率高于 O. 015h-1时, 比生产速率与比生长速率无关 D 因此, 要在发酵过程中达到并维持最大比生产速率, 必须使比生长速率不低0.015h-1 。这一比生长速率称为 临界比生长速率。对于分批补料发酵的生产阶段来说, 维持0.015h斗的临界比生长速率意味着每 46h 就要使菌丝浓度或发酵液体积加倍, 这在实际工业生产中是很难实现的。事实上 , 青霉素工业发酵生产阶段控制的比生长速率要比这一理论临界值低得多, 却仍然能达到很高的比生产速率。这是由于工业上采用的补料分批发酵过程不断有部分菌丝自溶, 抵消了一部分生长, 故虽然表观比生长速率低, 但真比生长速率却要高一些。（7）菌丝形态 在长期的菌株改良中 , 青霉素产生菌在沉没培养中分化为主要呈丝状生长和结球生长两种形态。前者由于所有菌丝体都能充分和发酵液中的基质及氧接触, 故一般比生产速率较高； 后者则由于发酵液黏度显著降低, 使气-液两相间氧的传递速率大大提高, 从而允许更多的菌丝生长 (即临界菌体浓度较高), 发酵罐体积产率甚至高于前者。 在丝状菌发酵中, 控制菌丝形态使其保持适当的分支和长度, 并避免结球 , 是获得高产的关键要素之一。而在球状菌发酵中, 使菌丝球保持适当大小和松紧 , 并尽量减少游离菌丝的含量, 也是充分发挥其生产能力的关键素之一。这种形态的控制与糖和氮源的流加状况及速率、搅拌的剪切强度及比生长速率密切相关。3、 工艺控制要点（1）种子质量的控制 丝状菌的生产种子是由保藏在低温的冷冻安瓿管经甘油、葡萄糖、蛋白胨斜面移植到小米固体上，25 C 培养 7 天, 真空干燥并以这种形式保存备用。生产时它按一定的接种量移种到含有葡萄糖、玉米浆、尿素为主的种子罐内 ,26 C 培养 56h 左右, 菌丝浓度达6%-8%, 菌丝形态正常, 按 10%-15%的接种量移人含有花生饼粉、葡萄糖为主的二级种子罐内,27C 培养 24h, 菌丝体积 10%-12%, 形态正常, 效价在700D/ml左右便可作为发酵种子。 球状菌的生产种子是由冷冻管子孢子经混有O. 5% -1. 0 %玉米浆的三角瓶培养原始亲米孢子, 然后再移人罗氏瓶培养生产大米抱子 (又称生产米), 亲米和生产米均为25 C静置培养, 需经常观察生长发育情况在培养到 3-4 天, 大米表面长出明显小集落时要振摇均匀, 使菌丝在大米表面能均匀生长, 待10 天左右形成绿色孢子即可收获。亲米成熟接人生产米后也要经过激烈振荡才可放置恒温培养, 生产米的孢子量要求每粒米300万只以上。亲米、生产米子孢子都需保存在 5 C冰箱内。工艺要求将新鲜的生产米 (指收获后的孢瓶在10天以内使用) 接人含有花生饼粉、玉米胚芽粉、葡萄糖、饴糖为主的种子罐内,28 C 培养 50-60h当pH 值由6. 0-6. 5 下降至 5.5-5. 0, 菌丝呈菊花团状,平均直径在 100- 130m, 每毫升的球数为 6万 -8万只, 沉降率在 85% 以上, 即可根据发酵罐球数控制在 8000-11000只/ml 范围的要求, 计算移种体积, 然后接入发酵罐, 多余的种子液弃去。球状菌以新鲜孢子为佳, 其生产水平优于真空干燥的孢子，能使青霉素发酵单位的罐批差异减少。（2）培养基成分的控制 a. 碳源 产黄青霉菌可利用的碳源有乳糖、蕉糖、葡萄糖等。目前生产上普遍采用的是淀粉水解糖、糖化液 (DE 值 50% 以上) 进行流加。b. 氮源 氮源常选用玉米浆、精制棉籽饼粉、麸皮，并补加无机氮源（硫酸氨、氨水或尿素）。c. 前体 生物合成含有苄基基团的青霉素 G, 需在发酵液中加人前体。前体可用苯乙酸、苯乙酰胺, 一次加入量不大于0.1%, 并采用多次加入, 以防止前体对青霉素的毒害。d. 无机盐加人的无机盐包括硫、磷、钙、镁、钾等, 且用量要适度。另外, 由于铁离子对青霉菌有毒害作用, 必须严格控制铁离子的浓度, 一般控制在30 g/ml 。（3）发酵培养的控制a. 加糖控制 加糖量的控制是根据残糖量及发酵过程中的 pH 值确定 , 最好是根据排气中CO2 量及 O2 量来控制, 一般在残糖降至 0.6% 左右, pH 值上升时开始加糖。b. 补氮及加前体 补氮是指加硫酸铵、氨水或尿素, 使发酵液氨氮控制在 O. 01%-0.05%,补前体以使发酵液中残存苯乙酰胺浓度为 0.05%-0.08% 。c. pH 值控制 对pH 值的要求视不同菌种而异, 一般为 pH 6.4-6.8, 可以补加葡萄 糖来控制。目前一般采用加酸或加碱控制pH值。 d. 温度控制 前期 2 5- 2 6 C, 后期 23 C, 以减少后期发酵液中青霉素的降解破坏。e. 溶解氧的控制 一般要求发酵中溶解氧量不低于饱和溶解氧的30% 。通风比一般为1 : 0. 8L/(L min), 搅拌转速在发酵各阶段应根据需要而调整。f. 泡沫的控制 在发酵过程中产生大量泡沫, 可以用天然油脂, 如豆油、玉米油等或用化学合成消泡剂 泡敌 来消泡, 应当控制其用量并要少量多次加入, 尤其在发酵前期不宜多用, 否则会影响菌体的呼吸代谢g. 发酵液质量控制 生产上按规定时间从发酵罐中取样 , 用显微镜观察菌丝形态变化来控制发酵。生产上惯称 镜检 ,根据 镜检 中菌丝形变化和代谢变化的其他指标调节发酵温度, 通过追加糖或补加前体等各种措施来延长发酵时间, 以获得最多青霉素。当菌丝中空泡扩大、增多及延伸, 并出现个别自溶细胞, 这表示菌丝趋向衰老, 青霉素分泌逐渐停止, 菌丝形态上即将进入自溶期, 在此时期由于茵丝自溶, 游离氨释放, pH 值上升, 导致青霉素产量下降, 使色素、溶解和胶状杂质增多, 并使发酵液变蒙古稠, 增加下一步提纯时过滤的困难。因此, 生产上根据 镜检 判断, 在自溶期即将来临之际, 迅速停止发酵, 立刻放罐, 将发酵液迅速送往提炼工段。青霉素生产工艺过程一、青霉素的发酵工艺过程1、工艺流程（1）丝状菌三级发酵工艺流程冷冻管（25C，孢子培养，7天）斜面母瓶（25C，孢子培养，7天）大米孢子（26C，种子培养56h,1:1.5vvm）一级种子培养液（27C，种子培养，24h,1:1.5vvm）二级种子培养液（2726C,发酵,7天,1:0.95vvm）发酵液。（2）球状菌二级发酵工艺流程冷冻管（25C，孢子培养，68天）亲米（25C，孢子培养，810天）生产米（28C，孢子培养，5660h,1:1.5vvm）种子培养液（2625-24C，发酵，7天，1：0.8vvm）发酵液。2、工艺控制（1）影响发酵产率的因素基质浓度 在分批发酵中，常常因为前期基质量浓度过高，对生物合成酶系产生阻遏（或抑制）或对菌丝生长产生抑制（如葡萄糖和钱的阻遏或抑制 , 苯乙酸的生长抑制）, 而后期基质浓度低限制了菌丝生长和产物合成 , 为了避免这一现象 , 在青霉素发酵中通常采用补料分批操作法 , 即对容易产生阻遏、抑制和限制作用的基质进行缓慢流加以维持一定的最适浓度。这里必须特别注意的是葡萄糖的流加 , 因为即使是超出最适浓度范围较小的波动 , 都将引起严重的阻遏或限制 , 使生物合成速度减慢或停止。目前 , 糖浓度的检测尚难在线进 行 , 故葡萄糖的流加不是依据糖浓度控制 , 而是间接根据pH 值、溶氧或 C02 释放率予以调节。（2）温度 青霉素发酵的最适温度随所用菌株的不同可能稍有差别 , 但一般认为应在25 C 左右。温度过高将明显降低发酵产率 , 同时增加葡萄糖的维持消耗 , 降低葡萄糖至青霉素的转化率。对菌丝生长和青霉素合成来说 , 最适温度不是一样的, 一般前者略高于后者, 故有的发酵过程在菌丝生长阶段采用较高的温度，以缩短生长时间, 到达生产阶段后便适当降低温度 , 以利于青霉素的合成。（3） pH 值 青霉素发酵的最适 pH 值一般认为在 6. 5 左右 , 有时也可以略高或略低一些 , 但应尽量避免 pH 值超过7.0, 因为青霉素在碱性条件下不稳定, 容易加速其水解。在缓冲能力较弱的培养基中, pH 值的变化是葡萄糖流加速度高低的反映。过高的流加速率造成酸性中间产物的积累使 pH 值降低； 过低的加糖速率不足以中和蛋白质代谢产生的氨或其他生理碱性物质代谢产生的碱性化合物而引起 pH 值上升。（4）溶氧 对于好氧的青霉素发酵来说 , 溶氧浓度是影响发酵过程的一个重要因素。当溶氧浓度降到 30% 饱和度以下时, 青霉素产率急剧下降, 低于 10% 饱和度时, 则造成不可逆的损害。溶氧浓度过高 , 说明菌丝生长不良或加糖率过低, 造成呼吸强度下降, 同样影响生产能力的发挥。溶氧浓度是氧传递和氧消耗的一个动态平衡点, 而氧消耗与碳能源消耗成正比, 故溶氧浓度也可作为葡萄糖流加控制的一个参考指标。（5）菌丝浓度 发酵过程中必须控制菌丝浓度不超过临界菌体浓度, 从而使氧传递速率与氧消耗速率在某一溶氧水平上达到平衡。青霉素发酵的临界菌体浓度随菌株的呼吸强度 (取决于维持因数的大小, 维持因数越大,呼吸强度越高) 、发酵通气与搅拌能力及发酵的流变学性质而异。呼吸强度低的菌株降低发酵中氧的消耗速率，而通气与搅拌能力强的发酵罐及黏低的发酵液使发酵中的传氧速率上升, 从而提高临界菌体浓度。（6）菌丝生长速度 用恒化器进行的发酵试验证明，在葡萄糖限制生长的条件下，青霉素比生产速率与产生菌菌丝的比生长速率之间呈一定关系。当比生长速率低于0.015h-1时，比生产速率与比生长速率成正比, 当比生长速率高于 O. 015h-1时, 比生产速率与比生长速率无关 D 因此, 要在发酵过程中达到并维持最大比生产速率, 必须使比生长速率不低0.015h-1 。这一比生长速率称为 临界比生长速率。对于分批补料发酵的生产阶段来说, 维持0.015h斗的临界比生长速率意味着每 46h 就要使菌丝浓度或发酵液体积加倍, 这在实际工业生产中是很难实现的。事实上 , 青霉素工业发酵生产阶段控制的比生长速率要比这一理论临界值低得多, 却仍然能达到很高的比生产速率。这是由于工业上采用的补料分批发酵过程不断有部分菌丝自溶, 抵消了一部分生长, 故虽然表观比生长速率低, 但真比生长速率却要高一些。（7）菌丝形态 在长期的菌株改良中 , 青霉素产生菌在沉没培养中分化为主要呈丝状生长和结球生长两种形态。前者由于所有菌丝体都能充分和发酵液中的基质及氧接触, 故一般比生产速率较高； 后者则由于发酵液黏度显著降低, 使气-液两相间氧的传递速率大大提高, 从而允许更多的菌丝生长 (即临界菌体浓度较高), 发酵罐体积产率甚至高于前者。在丝状菌发酵中, 控制菌丝形态使其保持适当的分支和长度, 并避免结球 , 是获得高产的关键要素之一。而在球状菌发酵中, 使菌丝球保持适当大小和松紧 , 并尽量减少游离菌丝的含量, 也是充分发挥其生产能力的关键素之一。这种形态的控制与糖和氮源的流加状况及速率、搅拌的剪切强度及比生长速率密切相关。青霉素生产工艺过程一、青霉素的发酵工艺过程1、工艺流程（1）丝状菌三级发酵工艺流程冷冻管（25C，孢子培养，7天）斜面母瓶（25C，孢子培养，7天）大米孢子（26C，种子培养56h,1:1.5vvm）一级种子培养液（27C，种子培养，24h,1:1.5vvm）二级种子培养液（2726C,发酵,7天,1:0.95vvm）发酵液。（2）球状菌二级发酵工艺流程冷冻管（25C，孢子培养，68天）亲米（25C，孢子培养，810天）生产米（28C，孢子培养，5660h,1:1.5vvm）种子培养液（2625-24C，发酵，7天，1：0.8vvm）发酵液。 2、工艺控制（1）影响发酵产率的因素基质浓度 在分批发酵中，常常因为前期基质量浓度过高，对生物合成酶系产生阻遏（或抑制）或对菌丝生长产生抑制（如葡萄糖和钱的阻遏或抑制 , 苯乙酸的生长抑制）, 而后期基质浓度低限制了菌丝生长和产物合成 , 为了避免这一现象 , 在青霉素发酵中通常采用补料分批操作法 , 即对容易产生阻遏、抑制和限制作用的基质进行缓慢流加以维持一定的最适浓度。这里必须特别注意的是葡萄糖的流加 , 因为即使是超出最适浓度范围较小的波动 , 都将引起严重的阻遏或限制 , 使生物合成速度减慢或停止。目前 , 糖浓度的检测尚难在线进 行 , 故葡萄糖的流加不是依据糖浓度控制 , 而是间接根据pH 值、溶氧或 C02 释放率予以调节。 （2）温度 青霉素发酵的最适温度随所用菌株的不同可能稍有差别 , 但一般认为应在25 C 左右。温度过高将明显降低发酵产率 , 同时增加葡萄糖的维持消耗 , 降低葡萄糖至青霉素的转化率。对菌丝生长和青霉素合成来说 , 最适温度不是一样的, 一般前者略高于后者, 故有的发酵过程在菌丝生长阶段采用较高的温度，以缩短生长时间, 到达生产阶段后便适当降低温度 , 以利于青霉素的合成。 （3） pH 值 青霉素发酵的最适 pH 值一般认为在 6. 5 左右 , 有时也可以略高或略低一些 , 但应尽量避免 pH 值超过7.0, 因为青霉素在碱性条件下不稳定, 容易加速其水解。在缓冲能力较弱的培养基中, pH 值的变化是葡萄糖流加速度高低的反映。过高的流加速率造成酸性中间产物的积累使 pH 值降低； 过低的加糖速率不足以中和蛋白质代谢产生的氨或其他生理碱性物质代谢产生的碱性化合物而引起 pH 值上升。 （4）溶氧 对于好氧的青霉素发酵来说 , 溶氧浓度是影响发酵过程的一个重要因素。当溶氧浓度降到 30% 饱和度以下时, 青霉素产率急剧下降, 低于 10% 饱和度时, 则造成不可逆的损害。溶氧浓度过高 , 说明菌丝生长不良或加糖率过低, 造成呼吸强度下降, 同样影响生产能力的发挥。溶氧浓度是氧传递和氧消耗的一个动态平衡点, 而氧消耗与碳能源消耗成正比, 故溶氧浓度也可作为葡萄糖流加控制的一个参考指标。（5）菌丝浓度 发酵过程中必须控制菌丝浓度不超过临界菌体浓度, 从而使氧传递速率与氧消耗速率在某一溶氧水平上达到平衡。青霉素发酵的临界菌体浓度随菌株的呼吸强度 (取决于维持因数的大小, 维持因数越大,呼吸强度越高) 、发酵通气与搅拌能力及发酵的流变学性质而异。呼吸强度低的菌株降低发酵中氧的消耗速率，而通气与搅拌能力强的发酵罐及黏低的发酵液使发酵中的传氧速率上升, 从而提高临界菌体浓度。（6）菌丝生长速度 用恒化器进行的发酵试验证明，在葡萄糖限制生长的条件下，青霉素比生产速率与产生菌菌丝的比生长速率之间呈一定关系。当比生长速率低于0.015h-1时，比生产速率与比生长速率成正比, 当比生长速率高于 O. 015h-1时, 比生产速率与比生长速率无关 D 因此, 要在发酵过程中达到并维持最大比生产速率, 必须使比生长速率不低0.015h-1 。这一比生长速率称为 临界比生长速率。对于分批补料发酵的生产阶段来说, 维持0.015h斗的临界比生长速率意味着每 46h 就要使菌丝浓度或发酵液体积加倍, 这在实际工业生产中是很难实现的。事实上 , 青霉素工业发酵生产阶段控制的比生长速率要比这一理论临界值低得多, 却仍然能达到很高的比生产速率。这是由于工业上采用的补料分批发酵过程不断有部分菌丝自溶, 抵消了一部分生长, 故虽然表观比生长速率低, 但真比生长速率却要高一些。（7）菌丝形态 在长期的菌株改良中 , 青霉素产生菌在沉没培养中分化为主要呈丝状生长和结球生长两种形态。前者由于所有菌丝体都能充分和发酵液中的基质及氧接触, 故一般比生产速率较高； 后者则由于发酵液黏度显著降低, 使气-液两相间氧的传递速率大大提高, 从而允许更多的菌丝生长 (即临界菌体浓度较高), 发酵罐体积产率甚至高于前者。 在丝状菌发酵中, 控制菌丝形态使其保持适当的分支和长度, 并避免结球 , 是获得高产的关键要素之一。而在球状菌发酵中, 使菌丝球保持适当大小和松紧 , 并尽量减少游离菌丝的含量, 也是充分发挥其生产能力的关键素之一。这种形态的控制与糖和氮源的流加状况及速率、搅拌的剪切强度及比生长速率密切相关。3、 工艺控制要点（1）种子质量的控制 丝状菌的生产种子是由保藏在低温的冷冻安瓿管经甘油、葡萄糖、蛋白胨斜面移植到小米固体上，25 C 培养 7 天, 真空干燥并以这种形式保存备用。生产时它按一定的接种量移种到含有葡萄糖、玉米浆、尿素为主的种子罐内 ,26 C 培养 56h 左右, 菌丝浓度达6%-8%, 菌丝形态正常, 按 10%-15%的接种量移人含有花生饼粉、葡萄糖为