外周血干细胞输注对肺腺癌免疫行为的影响.doc

www.CRTER.org王美江，等. 外周血干细胞输注对肺腺癌免疫行为的影响外周血干细胞输注对肺腺癌免疫行为的影响王美江，齐 琳(贵州省遵义市第一人民医院，遵义医学院附属第三医院，贵州省遵义市 563000)引用本文：王美江，齐琳. 外周血干细胞输注对肺腺癌免疫行为的影响J.中国组织工程研究，2017，21(9):1402-1407.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.09.017 ORCID: 0000-0001-6612-8961(王美江)文章快速阅读：外周血干细胞输注对肺腺癌大鼠免疫功能的影响18只Wistar大鼠。建立肺腺癌模型。常规处理组9只不给予任何处理。细胞移植组9只采用自体外周血干细胞移植治疗。检测其免疫指标，分析自体外周血干细胞对肺腺癌大鼠免疫功能的影响。文题释义：外周血干细胞：外周血干细胞是存在于外周血中的干细胞。正常情况下，外周血中的干/祖细胞的含量占单个核细胞的 0.01%-0.1%，相当于骨髓的1%-10%，动员后外周血单个核细胞中CD34+细胞数及CFU-删数均明显高于骨髓。迄今已发现多聚阴离子化合物(如硫酸葡聚糖)、糖皮质激素、细菌内毒素、抗肿瘤药物、四氢叶酸以及造血生长因子等均能有效地动员骨髓和其他部位的造血干/祖细胞进入外周血。密度梯度离心法：是自体外周血干细胞分离中最为普遍的方法之一，该方法主要利用细胞在物理学(密度)等方法存在的差异对细胞进行分离，该方法获得的细胞纯度相对较高，操作也相对比较简单，能够克服传统分离方法产生的弊端。摘要背景：目前临床上自体外周血干细胞分离鉴定方法相对较多，尚缺乏统一的标准。同时自体外周血干细胞在肺腺癌移植治疗过程中对免疫的影响也缺乏报道。目的：探讨自体外周血干细胞的分离、鉴定方法，观察自体外周血干细胞移植对肺腺癌大鼠免疫功能的影响。方法：采用密度梯度离心法从Wistar大鼠外周血分离单个核细胞并进行鉴定。将18只Wistar大鼠随机分为常规处理组和细胞移植组，每组9只，建立肺腺癌模型，常规处理组不给予任何方法治疗，细胞移植组经尾静脉注入0.2 mL含有2.5106 L-1的自体外周血干细胞悬液，大鼠治疗后检测其免疫指标。2组大鼠分别于治疗4，10，14 d后麻醉处死(n=3)，观察自体外周血干细胞移植治疗对肺腺癌免疫行为的影响。结果与结论：从大鼠外周血新分离的单个核细胞呈现圆形或者椭圆形，且体积相对较小；自体外周血干细胞培养5 d后细胞生长迅速，圆形细胞开始向两端伸展，并呈现梭形，从而能够形成较小的细胞集落；自体外周血干细胞体外诱导培养后先后经历了生长滞缓期、对数增殖期以及生长平台期；流式细胞仪分选纯化的细胞，干细胞因子受体CD90、CD133及Flk-1均有表达，提示分离培养获得的细胞为自体外周血干细胞；自体外周血干细胞培养4，10，14 d后检测其表面抗原表达结果显示，CD90，CD133呈现先升高后下降趋势；Flk-1呈现上升趋势；在移植治疗后第4，10，14天，细胞移植组免疫指标肿瘤坏死因子诱导蛋白6显著高于常规处理组(P 0.05)，而核因子B显著低于常规处理组(P 0.05)；结果提示，自体外周血干细胞分离、鉴定方法比较简单，并且应用于治疗肺腺癌能够分泌大量营养因子，治疗过程中能够增强机体免疫。关键词：干细胞；移植；自体外周血干细胞；分离；鉴定；肺腺癌；治愈率；免疫指标；增殖能力；肿瘤坏死因子诱导蛋白6；核因子B主题词：外周血干细胞移植；肺肿瘤；腺癌；细胞分离；免疫；组织工程王美江，男，1971年生，贵州省遵义市人，1996年遵义医学院毕业，主治医师，主要从事肺肿瘤方面的研究。中图分类号:R394.2文献标识码:B文章编号:2095-4344(2017)09-01402-06稿件接受：2016-10-14Wang Mei-jiang, Attending physician, First Peoples Hospital of Zunyi, Third Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China基金资助：贵州省卫生厅计划科技发展项目(201503321)Immunological impact of autologous peripheral blood stem cell infusion on lung adenocarcinoma Wang Mei-jiang, Qi Lin (First Peoples Hospital of Zunyi, Third Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China)3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 AbstractBACKGROUND: Although clinical methods for autologous peripheral blood stem cell separation and identification are relatively more, there is no unified standard. Moreover, little is reported on immune effects on lung adenocarcinoma during autologous peripheral blood stem cell transplantation. OBJECTIVE: To study the effect of autologous peripheral blood stem cell transplantation on immunological function of lung adenocarcinoma rats by exploring the separation and identification methods of autologous peripheral blood stem cells. METHODS: The mononuclear cells were isolated from the peripheral blood of Wistar rats by density gradient centrifugation method and then identified. Eighteen Wistar rats were randomly divided into routine treatment group and cell transplantation group, with nine rats in each group. Animal models of lung adenocarcinoma were established in the rats, and underwent no treatment in the routine treatment group but injection of autologous peripheral blood stem cell suspension (0.2 mL, 2.5106/L) via the tail vein in the cell transplantation group. Immune indicators were detected in two groups after treatment. Three rats from each group were anesthetized and scarified at 4, 10, 14 days after treatment, respectively. Afterwards, we detected the effects of autologous peripheral blood stem cell transplantation on immunological function of lung adenocarcinoma rats.RESULTS AND CONCLUSION: Newly isolated mononuclear cells from rat peripheral blood showed a round or oval shape and were relatively small in size. After 5 days of culture, autologous peripheral blood stem cells grew rapidly, and the round cells began to spread to both ends and became spindle-shaped, thereby forming small colonies. Autologous peripheral blood stem cells induced in vitro experienced three stages successively: cell arrest, logarithmic and plateau phases. Flow cytometry showed that sorted cells were identified as autologous peripheral blood stem cells by expressing CD90, CD133 and Flk-1. After 4, 10 and 14 days culture, the expression of CD133 increased first and then descended, and Flk-1 showed an increasing trend. Compared with the routine treatment group, the expression of tumor necrosis factor- induced protein 6 in the cell transplantation group was significantly higher (P 0.05), while the expression of nuclear factor B was significantly lower (P 0.05). In conclusion, the isolation and identification methods of autologous peripheral blood stem cells are simple and can be used to secrete a large number of nutritional factors in the treatment of lung adenocarcinoma, which can enhance body immunity in the treatment.Subject headings: Peripheral Blood Stem Cell Transplantation; Lung Neoplasms; Adenocarcinoma; Cell Separation; Immunity; Tissue EngineeringFunding: the Scientific Development Plan of Guizhou Provincial Health Department, No. 201503321Cite this article: Wang MJ, Qi L. Immunological impact of autologous peripheral blood stem cell infusion on lung adenocarcinoma. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2017;21(9):1402-1407.1403ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction肺腺癌是非小细胞肺癌常见的病理类型之一，该疾病发病年龄较小，且在女性中常见1。同时，肺腺癌生长缓慢，部分患者早期能引起血行转移，加剧病情严重程度2-3。目前，临床上对于肺腺癌治疗方法相对较多，如全身化疗、支持治疗等为主，这些方法虽然能改善患者症状，延长患者寿命，但是治疗总有效率较低(一般为20%-40%)，1年生存率为35%-45%，影响患者生活质量4-5。干细胞是一类特殊的细胞，它在机体的整个生命期中具备自我更新能力，并且能够在一定的条件下分化为多种功能细胞。根据干细胞来源可以将其分为胚胎干细胞和成体干细胞，而根据其分化潜能角度则能分为3大类：全能干细胞、多能干细胞以及单能干细胞6-7。自体外周血干细胞源于成体干细胞，具有无限增殖能力，并且能够向特定细胞分化的潜能8。由于自体外周血干细胞具有多向分化潜能、来源相对广泛及其特有的免疫调节作用，而成为组织神经功能研究的重点，成为组织工程最为理想的种植细胞9-10。目前，临床上自体外周血干细胞分离鉴定方法相对较多，尚缺乏统一的标准，同时自体外周血干细胞在肺腺癌移植治疗过程中对免疫的影响也缺乏报道11。文章在探讨自体外周血干细胞分离、鉴定方法的基础上，观察自体外周血干细胞移植治疗对肺腺癌免疫行为的影响。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计 随机对照动物实验。1.2 时间及地点 于2014年11月至2015年11月在遵义医学院完成。1.3 材料实验动物：选取18只Wistar大鼠，清洁级，体质量350-450 g，平均(42338) g，雌雄不拘，实验动物均由遵义医学院提供，饲养严格遵守相关标准进行饲养，合格证号为许可证号：SYXK(黔)2011-0039。对Wistar大鼠进行等条件喂养，处理方法符合关于善待实验动物的指导性意见中相关规则12-13。18只大鼠按随机数字表法分为2组，常规处理组及细胞移植组各9只。主要仪器及试剂：DMEM培养基(Gibco公司)，CO2培养箱(美国Thermo Forma公司)，乙二胺四乙酸(EOTA)(北京化工厂)，倒置相差显微镜(日本 OLYMPUS公司)，通用型SP-9000免疫组化染色试剂盒(北京天来生物医学科技公司)，小鼠抗细胞角蛋白多抗(武汉博士德生物工程公司)，抗体稀释液(武汉博士德生物工程公司)等。1.4 方法自体外周血干细胞分离、鉴定：外周血单个核细胞获取：肺腺癌模型制备前取细胞移植组9只Wistar大鼠，在腹腔注入10%浓度为3 mL/kg水合氯醛进行麻醉，待麻醉生效后将大鼠固定在手术台上，仰卧，在其背部置入一个粗食管，充分暴露主动脉，抽取10 mL血液，加入PBS混合均匀，5 min离心，离心速度为1 500 r/min14-15；细胞培养：将获得的末次洗涤液，取出上层清液，将浓度为2106/cm2接种在载玻片上，并将其放置在37 、体积分数为5%的CO2培养箱中，每2 d换液1次，观察细胞生长情况及其形态16-17；细胞传代：待细胞融合培养皿80%后开始传代培养，在显微镜下观察细胞形态，看见细胞变圆脱离瓶底后终止消化，离心5 min，获取自体外周血干细胞18-19；自体外周血干细胞鉴定：利用传代方法收集细胞，将处理好的自体外周血干细胞单个细胞悬液按照5109 L-1细胞浓度分装到EP管中，向每个EP管中各加入1 L抗体(包括Flk-1、PE-CD133、PE-CD90)，充分混合均匀后放置在4 冰箱进行30 min反应，向每个样品中各加入1 mL含有体积分数2%胎牛血清的终止染色反应，5 min离心，速度1 200 r/min，去除上层清液，350-400 L PBS回溶沉淀并转移到流式管中送检。肺腺癌模型大鼠建模及处理方法：18只Wistar大鼠均采用浓度为3.6%水合氯醛进行全身麻醉，待麻醉生效后进行消毒、铺巾。大鼠仰卧固定在手术台上，将50 mL浓度为2.5107 pfu的AsCre Capi加入到69ilMEM中，再加入 6 L的2.5 mol/L的氯化钙的供沉淀物，滴入Wistar大鼠鼻腔，共滴入125 L，分2次滴入，间隔5 d重复滴入，重复2次，连续滴入30 d，建立Wistar大鼠肺腺癌模型。在影像学检查下观察大鼠肺部情况，对于存在明显占位大鼠视为建模成功。将18只大鼠按随机数字表法分为2组，常规处理组不给予任何方法治疗；细胞移植组采用自体外周血干细胞移植治疗，经大鼠尾静脉注入0.2 mL含有2.5106 L-1的自体外周血干细胞悬液。2组大鼠治疗4，10，14 d后麻醉处死(n=3)，进行相关指标观察20-21。0.20A值第1天 第3天 第5天 第7天图2 自体外周血干细胞传代生长情况Figure 2 Passage and growth of autologous peripheral blood stem cells第1代 第3代第5代B A图1 自体外周血干细胞形态学观察(40)Figure 1 Morphology of autologous peripheral blood stem cells (40)图注：图A为自体外周血干细胞分离起初细胞形态；图B为自体外周血干细胞分离5 d细胞形态。图3 自体外周血干细胞的流式细胞仪鉴定结果Figure 3 Flow cytometry detection of autologous peripheral blood stem cellsCD90 CD133 Flk-1 120100806040200比例(%)第4天 第10天 第14天图4 自体外周血干细胞流式细胞仪鉴定结果Figure 4 Flow cytometry identification of autologous peripheral blood stem cellsCD90 CD133Flk-11.5 主要观察指标 观察自体外周血干细胞形态：待自体外周血干细胞成功分离鉴定后在细胞生长过程采用倒置显微镜观察细胞的形态22；观察自体外周血干细胞传代生长情况：利用细胞计数板完成细胞计数；采用流式细胞仪鉴定细胞表面因子水平23-24；观察自体外周血干细胞移植治疗对肺腺癌免疫行为的影响：为了进一步说明自体外周血干细胞对抗炎和免疫调节的作用，采集大鼠3 mL静脉血，利用细胞计数板完成细胞计数，从mRNA和蛋白质水平分析抗炎因子肿瘤坏死因子诱导蛋白6和转录因子核因子B的表达，相关操作必须严格遵循试剂盒参数指标进行测定25-26。1.6 统计学分析 采用SPSS 18.0软件对采集到的数据进行分析，其中符合正态分布的数据进行单因素方差分析，存在统计学意义予以LSD法两两比较。P 0.05提示经比较2组数据间差异有显著性意义。2 结果 Results 2.1 实验动物数量分析 纳入18只Wistar大鼠进行分组实验，分为2组，全部进行结果分析，中途无脱失。2.2 自体外周血干细胞形态学观察 从大鼠外周血新分离的单个核细胞呈现出圆形或者椭圆形且体积相对较小，见图1A。自体外周血干细胞培养5 d后细胞生长迅速，圆形细胞开始向两端伸展，并呈现梭形，从而能够形成较小的细胞集落，见图1B。2.3 自体外周血干细胞传代生长情况 自体外周血干细胞体外诱导培养后先后经历了生长滞缓期、对数增殖期以及生长平台期。自体外周血干细胞第1-3代整体呈现增长趋势，但是随着代数的增加细胞增殖能力出现下降，见表1。表1 自体外周血干细胞传代生长情况 (s，n=3，A)Table 1 Passage and growth of autologous peripheral blood stem cells 细胞代数第1天第3天第5天第7天第1代1.10.4第3代0.70.3第5代0.50.2从图2可以看出，自体外周血干细胞总体呈现正增长趋势，且随着代数降低，细胞增殖降低。2.4 自体外周血干细胞鉴定 原代细胞经过传代扩增，再由流式细胞仪分选纯化的细胞，干细胞因子受体CD90、CD133及Flk-1均有表达，见图3。提示分离培养获得的细胞为自体外周血干细胞。2.5 流式细胞仪鉴定结果 自体外周血干细胞培养第4，10及14天检测其表面抗原表达结果显示，CD90，CD133呈现先升高后下降趋势，Flk-1呈现上升趋势，见表2。从图4可以看出，自体外周血干细胞CD90、CD133呈现先上升后下降的趋势；ELK-1呈现上升趋势。表2 自体外周血干细胞流式细胞仪鉴定结果 (s，n=3，%)Table 2 Flow cytometry results of autologous peripheral blood stem cells 指标第4天第10天第14天CD9035.74.281.86.432.15.4CD1333.20.93.8Flk-131.23.556.33.8 自体外周血干细胞对肺腺癌移植治疗的免疫影响 细胞移植组自体外周血干细胞移植治疗后免疫指标肿瘤坏死因子诱导蛋白6在第4，10，14天显著高于常规处理组 (P 0.05)；核因子B在第4，10，14天显著低于常规处理组(P 0.05)，见表3。由此看出，自体外周血干细胞能发挥其抗炎和免疫调节作用。表3 两组大鼠不同时间点肿瘤坏死因子诱导蛋白6和核因子B表达水平比较 (s，n=3，g/L)Table 3 Comparison of tumor necrosis factor- induced protein 6 and nuclear factor B levels between two groups at different time points 组别第4天第10天第14天细胞移植组肿瘤坏死因子诱导蛋白6核因子B7.180.86a13.911.67a15.341.95a1.970.14a3.020.38a3.950.92a常规处理组肿瘤坏死因子诱导蛋白6核因子B2.530.153.630.464.451.003.370.384.521.105.670.79表注：与常规处理组相比，aP 0.05。3 讨论 Discussion肺癌是临床上常见的疾病，这种疾病发病率较高，且近年来该疾病发生率呈现上升趋势。根据2013年中国肿瘤登记年报结果显示，肺癌发生率和死亡率占据恶性肿瘤首位，已经成为近2年威胁人类健康的头号杀手27-28。而肺腺癌占肺癌的40%，属于肺癌的主要形式29。常规方法更多的以化疗为主，该方法虽然能改善患者症状，但是创伤较大，治疗预后较差，5年生存率仅有15%。自体外周血干细胞是一种特殊的细胞，从传统理论上来说，出生后血管的生成以及血管损伤修复就得到更新，该方法能够为肿瘤的治疗提供新的思路30-32。 目前，临床上对于自体外周血干细胞的分离方法相对较多，如免疫磁珠法、流式细胞仪法以及密度梯度离心法等33。密度梯度离心法是自体外周血干细胞分离中最为普遍的方法之一，该方法主要利用细胞在物理学(密度)等方法存在的差异对细胞进行分离，该方法获得的细胞纯度相对较高，操作也相对比较简单，能够克服传统分离方法产生的弊端34-35。本实验从大鼠外周血新分离的单个核细胞呈现出圆形或者椭圆形且体积相对较小。自体外周血干细胞培养5 d后细胞生长迅速，圆形细胞开始向两端伸展，并呈现梭形，从而能够形成较小的细胞集落。对于胚胎干细胞还是成体干细胞的诱导、分化均需要适合的微环境，对分离出的细胞应该根据目的细胞的需要增加不同的生长因子，以保证能进行预期培养36-37。本研究中，自体外周血干细胞体外诱导培养后先后经历了生长滞缓期、对数增殖期以及生长平台期。自体外周血干细胞第1到第3代整体呈现增长趋势，但是随着代数的增加细胞增殖能力出现下降。自体外周血干细胞是一种具有游走功能并且能增殖分化为成熟内皮细胞，单一的从细胞形态上难以做出准确的鉴定38。本文中原代细胞经过传代扩增，再由流式细胞仪分选纯化的细胞，主要表达干细胞因子受体c-kit，但是CD34、CD45、CD31及Lineage等几乎不表达。提示分离培养获得的细胞为自体外周血干细胞。同时，自体外周血干细胞与一些造血干细胞相同的细胞标记，如CD90，CD134等，这些细胞标记能够更加清晰的显示自体外周血干细胞的生物学特性，能为肿瘤的治疗提供新思路39。本文中自体外周血干细胞培养4，10以及14 d后检测其表面抗原表达结果显示，CD90呈现先升高后下降趋势；CD133呈现先升高后下降趋势；Flk-1呈现上升趋势。自体外周血干细胞在植入治疗肺腺癌时能够发挥其抗炎和免疫抑制作用，其机制相对复杂，可能与一些抑制因子等关系密切。并且，部分因子已经被报道参与自体外周血干细胞的免疫调节中，如一氧化氮合成酶、吲哚胺2，3等，但是其具体机制尚需要进一步研究和探讨40-49。本实验中细胞移植组移植治疗后免疫指标肿瘤坏死因子诱导蛋白6在第4，10，14天，显著高于常规处理组(P 0.05)；细胞移植组移植治疗后免疫指标核因子B在第4，10，14天显著低于常规处理组(P 0.05)。由此看出，自体外周血干细胞能发挥其抗炎和免疫调节作用，通过植入自体外周血干细胞能调节机体免疫，改善大鼠症状，从而能发挥明显的抑瘤作用。综上所述，自体外周血干细胞分离、鉴定方法比较简单，并且运用与肺腺癌中能够分泌大量营养因子，引导和促进组织再生，进行自我更新和增殖，且治疗过程中能够增强机体免疫，具有较高的临床应用价值。致谢：感谢遵义医学院老师们对课题的支持。作者贡献：王美江负责设计实施，齐琳负责核对修改。利益冲突：所有作者共同认可文章无相关利益冲突。伦理问题：实验过程中对动物的处置符合2009年Ethical issues in animal experimentation相关动物伦理学标准的条例。实验方案中有关动物伦理问题已经遵义医学院实验动物伦理委员会讨论批准。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。作者声明：第一作者王美江对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。开放获取声明：这是一篇开放获取文章，文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。根据知识共享许可协议“署名-非商业性使用-相同方式共享3.0”条款，在合理引用的情况下，允许他人以非商业性目的基于原文内容编辑、调整和扩展，同时允许任何用户阅读、下载、拷贝、传递、打印、检索、超级链接该文献，并为之建立索引，用作软件的输入数据或其它任何合法用途。4 参考文献 References1 朱雄增,张杰.肺腺癌IASLC/ATS/ERS国际多学科分类解读J.临床与实验病理学杂志,2012,28(3):241-244.2 Warth A,Muley T,Meister M,et al.The novel histologic International Association for the Study of Lung Cancer / American Thoracic Society / European Respiratory Society classification system of lung adenocarcinoma is a stage-independent predictor of survival.J Clin Oncol. 2012; 30(13): 1438-1446.3 刘标,周晓军.非小细胞肺癌个体化治疗的靶向分子检测J.临床与实验病理学杂志,2012,28(8):831-837.4 Russell P A,Wainer Z,Wright G M,et al. Does lung adenocarci noma subtype predict patient survival? A clinicopathologic study based on the new International association for the study of lung cancer/American thoracic society/European respiratory society international multidisciplinary lung adenocarcinoma classification.J Thoracic Oncol. 2011;6( 9) : 1496-1504.5 Warth A,Stenzinger A,von Brnneck A C,et al. Interobserver variability in the application of the novel IASLC/ATS/ERS classifi-cation for pulmonary adenocarcinomas. Eur Respir J. 2012;40(5):1221-1227.6 章必成,杨波,刘健,等. 肺腺癌瘤周微淋巴管密度的检测及其预后意义J.临床肿瘤学杂志,2010,15(11): 978-981.7 张力. 脑转移瘤的诊断和治疗C.中华医学会第五届全国胸部肿瘤及内窥镜学术会议论文汇编,2011.8 Motoi N,Szoke J,Riely GJ,et al. Lung adenocarcinoma: modification of the 2004 WHO mixed subtype to include the major histologic subtype suggests correlations between papillary and micropapillary adenocarcinoma subtypes,EGFR mutations and gene expression analysis. Am J Surg Pathol. 2008;32(6): 810-827.9 刘丽,姜建威.肺腺癌新增分类及研究新进展J. 中华临床医师杂志:电子版,2014,8(6):1128-1133.10 Mc Carroll JA,Gan PP,Liu M,et al. -tubulin is a multi functional protein involved in drug sensitivity and tumorigenesis in non-small cell lung cancer. Cancer Res. 2010;70(12): 4995-5003.11 石祥宇,庞青松,赵纲,等. 伴微乳头结构肺腺癌的研究进展J. 中国肺癌杂志,2015,18(11):701-705.12 Hung JJ,Yeh YC,Jeng WJ,et al. Predictive value of the international association for the study of lung cancer/American Thoracic Society/ European Respiratory Society classification of lung adenocarcinoma in tumor recurrence and patient survival. J Clin Oncol. 2014;32(22): 2357-2364.13 刘雨桃,石远凯,胡兴胜,等.吉非替尼治疗EGFR基因突变状态不明的青年晚期肺腺癌疗效分析J.中国肺癌杂志,2014,17(5): 401-405.14 丁粉干,刘标,张新华,等.不同肺腺癌分级评分系统在I期肺腺癌预后评估中的意义J.中华病理学杂志,2012,41(3):145-150.15 Shi Y,Au JS,Thongprasert S,et al. A prospective,molecular epide miologystudy of EGFR mutations in Asian patients with advanced non -small - celllung cancer of adenocarcinoma histology(PIONEER). J Thorac Oncol. 2014;9(2):154 -162.16 冯瑞娥.最新国际肺腺癌多学科分类中的病理分类及其临床意义J.中华结核和呼吸杂志,2012,35(2):95-96.17 金鑫,赵绍宏,高洁,等.纯磨玻璃密度肺腺癌病理分类及影像表现特点分析J.中华放射学杂志,2014,48(4):283-287.18 Backos DS,Franklin CC,Reigan P. The role of glutathione in brain tumor drug resistance. Bio Chem Pharmacol. 2012; 83(8): 1005-1012.19 周晓军,刘摇标.解读2011年IASLC/ATS/ERS肺腺癌国际多学科分类J.临床与实验病理学杂志,2011,27(8):801-805.20 刘颖汇,朱彦君,郭延林,等.肺腺癌中C/EBP、MVD表达的临床意义及相关性分析J.临床肺科杂志,2013,18(11):2057-2059.21 Fujikawa Y,Urano Y,Komatsu T,et al. Design and synthesis of highly sensitive fluorogenic substrates for glutathione S-transferase and application for activity imaging in living cells. Am Chem Soc. 2008;130(44): 14533-14543.22 王凯,李晓军,陈芳芳,等. ID3 蛋白在肺腺癌中的表达及临床病理学意义J.临床检验杂志,2011,29(2): 118-120.23 Citti A,Boldrini R,lnserra A,et al. Expression of multidrug resistance-associated proteins in paediatric soft tissue sarcomas before and after chemotherapy.Oncol. 2012;41(1): 117-124.24 Cao Y,Zhang L,Kamimura Y,et al. B7-H1 over-expression regulates epithelial-mesenchymal transition and accelerates carcinogenesis in skin. Cancer Res.2011;71(4): 1235-1243.25 史妍婷,井欢,王莹,等.补中益气汤含药血清逆转A549/DDP的顺铂耐药及对mTOR表达的影响J.中国实验方剂学杂志,2013, 19(9):215-219.26 季旭明,欧阳兵,吴智春,等.温下方含药血清诱导A549/DDP细胞凋亡及对Bcl-2,Bax,p53蛋白表达的影响J.中国实验方剂学杂志,2011,17(12):123-126.27 Ye MX,Zhao YL, Li Y, et al. Curcumin reverses cis-platin resistance and promotes human lung adenocarcinoma A549 / DDP cell apoptosis through HIF-1 and caspase-3 mechanisms. Phytomedicine. 2012;19( /9): 779-787.28 张莹,贾英杰,李小江,等.消岩汤对耐顺铂人肺腺癌A549/DDP细胞多药耐药基因调控作用的研究J.药物评价研究,2014,37(6): 507-510.29 张继新,崔力方,周全,等.肺腺癌转移至胸膜孤立性纤维性肿瘤临床病理观察J.诊断病理学杂志,2014,21(3):145-148.30 马云帆,范梦颖,陈克能.肺鳞癌与肺腺癌的免疫组化指标的诊断及预后意义J.中国肺癌杂志,2014,17(6):506-510.31 俎云芬,王熙才,刘馨,等.甲状腺转录因子在宣威肺腺癌中的表达及临床意义J.中国肺癌杂志,2013,16(3):131-137.32 王艳芬,刘标,徐艳,等.窖蛋白-1表达与肺腺癌临床病理特征和预后的关系J.中华病理学杂志,2014,43(4):251-255.33 张莹,贾英杰,李小江,等.注射用黄芪多糖对耐顺铂人肺腺癌细胞A549/DDP耐药逆转作用研究J.药物评价研究,2012,35(6): 417-419.34 Kim TJ,Goo JM,Lee KW,et al. Clinical,pathological and thin-section CT features of persistent multiple ground glass opacity nodules: comparison with solitary ground-glass opacity nodule. Lung Cancer. 2009;64(2):171-178.35 Eisenberg RL,Bankier AA,Boiselle PM. Compliance with Fleischner Society guidelines for management of small lung nodules: a survey of 834 radiologists. Radiology. 2010;255(1): 218-224.36 Yoshizawa A,Motoi N,Riely GJ,et al. Impact of proposed IASLC/ATS/ERS classification of lung adenocarcinoma: prognostic subgroups and implications for further revision of staging based on analysis of 514 stage I cases. Mod Pathol. 2011;24 (5):653-664.37 Sawada E,Nambu A,Motosugi U,et al. Localized mucinous bronchioloalveolar carcinoma of the lung: thin-section computed tomography and fluorodeoxyglucose positron emission tomography findings. Jpn J Radiol. 2010;28(4): 251-258.38 唐晓勇,唐迎雪.浙贝母碱对肺癌A549/DDP细胞多药耐药的逆转作用观察及机制探讨J.山东医药,2012,52(18):4-6.39 李泽慧,安超,胡凯文,等.浙贝母总生物碱对人肺腺癌A549/顺铂细胞耐药性的逆转作用J.中国药理学与毒理学杂志,2013, 27(3):315-320.40 Kim TJ,Park CM,Goo JM,et al. Is there a role for FDG PET in the management of lung