SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳.doc

Electrophoresis and Staining SOPSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳实验目的:测定蛋白质亚基的分子量及纯度实验原理：在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的点泳迁移率主要取决于亚及分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。当蛋白质的分子量在15KD到200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系，可以用来测定蛋白质亚基的分子量。基本过程：制胶、电泳、检测试剂：（储液由专业人员配置）30%丙烯酰胺单体储液、10%过硫酸铵、TEMED、1.5mol/L Tris-HCl, pH8.8、1.0mol/L Tris-HCl, pH6.8、10%SDS、10XTris-甘氨酸系统的电泳缓冲液、2Xloading buffer、水饱和正丁醇器材：灌胶支架、玻璃板、梳子、电源、加热器、电泳槽、扫描仪实验操作程序：1 安装灌胶模具，依照说明书进行2 按照配方配置一定量（7cm模具配置1mm厚的胶配置5ml）的分离胶溶液和浓缩胶溶液（2ml），过硫酸铵和TEMED在用前加入。3 分离胶溶液充分混匀后从一侧加入灌胶模具，上方留约1.5-2cm用于加浓缩胶，小心的在分离胶的表面加一层水饱和正丁醇（或水饱和的异丙醇、水），封住胶面，以促使聚合并保持胶面平整。4 室温放置40分钟到1小时后，可以看到一个界面，去掉上层覆盖液，用浓缩胶缓冲液淋洗胶面，然后灌制浓缩胶，并插入与模具大小相同，凝胶厚度相当的梳子。5 静止放置40-60分钟使凝胶聚合，电泳液清洗样品孔。6 制备好的蛋白质样品用2Xloading buffer 1：1混合，与分子量marker 一起100煮3-5min, 12000rpm离心5-10min，（7cm模具、1mm厚度、10孔、考染上样量30ug）7 加入下槽液，把夹有凝胶的玻板转移到电泳槽，加入上槽液，上样。 8 连接电源，5-10mA/胶开始电泳，待溴酚蓝前沿到达分离胶后加大电流到10-15mA/胶，9 溴酚蓝前沿到达玻璃板底部时停止电泳，取出凝胶，做好标记，准备染色。10 染色。见考马斯亮蓝染色操作规程及银染色操作规程。11 扫描。扫描操作见扫描仪的使用说明。注意事项1 在加过硫酸铵和TEMED之前溶液最好抽气，防止溶解在溶液里的分子氧在聚合时产生气泡使胶不均一。2 过硫酸铵和TEMED的量应根据室温和聚合情况而定。3 分离胶聚合后最好在4放置12小时后再使用，以使凝胶充分聚合，改善电泳时的分辨率。4 为防止气泡陷入，梳子应倾斜插入。5 如果带着梳子过夜可能会影响分辨率，所以浓缩胶最好在使用前再灌制。6 如果没有足够数目的样品，应在加样孔中加样品缓冲液，不要留有空孔，以防止电泳时邻近的带扩展。7 对样品浓度不确定的情况下，加样时使用梯度加样法，能大致估计出样品的浓度。参考文献：1蛋白质电泳实验技术郭尧君编著固相pH梯度-SDS双向凝胶电泳实验操作程序实验目的：分离蛋白质混合物，将样品进行电泳后，为了不同目的在它的直角方向再进行一次电泳。常说的双向电泳是根据蛋白质所带的电荷和分子大小对蛋白质混合物进行分离。实验原理：第一向等电聚焦的基本原理是利用蛋白质分子或其他两性分子的等电点不同，在一个稳定的、连续的、线性的pH梯度中进行蛋白质的分离和分析。第二向运用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳根据分子量大小对蛋白质进行分离。基本过程：等电聚焦、平衡及转移到二向、SDS-PAGE试剂或储液：IPG buffer、矿物油、DTT、碘代乙酰胺、过硫酸铵、TEMED、1M DTT、rehydration buffer、平衡液储液、30%丙烯酰胺单体储液、1.5M Tris-HCl、10% SDS、10X Tris-甘氨酸系统的电泳缓冲液、0.5%琼脂糖、水饱和正丁醇、占位液实验操作程序：等点聚焦部分1 根据选用的胶条的长度计算上样体积（见附1），加1M DTT到终浓度50mM需要的体积，补加IPG buffer到终浓度0.2%或者0.5%的体积，加rehydration buffer到该胶条的上样体积。2 把各种溶液按计算的体积加入到eppendorf管中，充分混匀，（或者超声5-10min）14000rpm,10离心5min。3 取出胶条室温放置10min，平衡胶条的温度。4 沿着聚焦盘中槽的边缘从左至右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不要产生气泡，否则影响到胶条中蛋白质的分布。5 当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘中后，用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。6 分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘中样品溶液上，使得胶条的正极（标有+，安玛西亚胶条为尖端）对应于聚焦盘的正极（安玛西亚为尖端）。确保胶条与电极紧密接触。不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上，因为这些溶液不会被胶条吸收。同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡。如果已经产生气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶到胶条以外。7 在每根胶条上覆盖1-3ml矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发析出尿素。需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。8 对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序（见附2）。9 聚焦结束的胶条立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳，否则将胶条吸干矿物油置于平衡管中，-80冰箱保存。注意事项：参见“双向电泳培训班讲义（定稿）”中等电聚焦注意事项部分。附1：胶条长度、上样量、上样体积、等点聚焦的伏小时数的设置及说明胶条长度7cm11cm13cm17cm18cm24cm上样体积125ul185ul250ul300ul350ul450ul银染上样量范围 pH3-10L(ug)5-10015-20025-25030-30040-40050-500推荐使用量（ug）50100125150200250银染VHrs120002000024000300003600052000考染上样量范围 pH3-10L(mg)0.05-0.50.15-1.20.25-1.50.25-2.50.75-31-4推荐使用量（ug）25050065075010001250考染VHrs220003000034000400004600062000说明：1pH3-10NL, pH4-7, pH6-11的上样量与pH 3-10相比增加1.5-2倍，聚焦伏小时数延长约10000VHr2按照推荐量上预实验，根据预实验结果调整上样量，样品中蛋白质分布均匀按推荐量使用，如果有高丰度的蛋白质适当降低上样量，如果显得少则适当加大上样量。聚焦的伏小时数可以根据聚焦的情况进行调整。附2：等电聚焦程序的设置及说明rehydration at 20 4-8HrS1 50V 8-4Hr 快速S2 500V 1Hr 快速S3 1000V 1Hr 快速S4 8000V 1-2Hr 线性S5 8000V 见附1 快速说明:1 一般无电压泡胀与低电压50V泡胀的时间加起来为12Hrs，无电压泡胀能够使小分子蛋白进入胶内，低电压泡胀能够使大分子量蛋白容易进入胶内。依据感兴趣的蛋白质的分子量范围进行调节。2 样品含盐量高时，最好把S4设置的时间再延长一些，或者在电极上加湿润滤纸条搭盐桥，避免烧胶。37cm的胶使用最高电压4000V来进行等电聚焦，如果某些样品达不到设置的8000V/Hr，总伏小时数能够达到设置值也表明等电聚焦已经完成。4 如果等电聚焦完成与转二向之间有几个小时的间隔，可以设置500V的电压来保持蛋白在胶里保持溶解状态。平衡及SDS-PAGE1 安装灌胶模具，配置SDS凝胶。具体操作见SDS-PAGE、ETTAN DALT II System 以及ETTAN DALT SIX 操作规程。2 拿出适量平衡液融化平分到平衡管中，一半加入1% DTT，一半加入2.5%碘代乙酰胺，充分溶解。3 等电聚焦完成后，关掉电源，用镊子夹出胶条，胶面朝上放在湿润的滤纸上。另外一张湿润的滤纸覆盖在胶面上，轻轻吸去上面的油。4 胶条支持膜紧贴平衡管壁放进含DTT的平衡液中进行还原，低速摇床上放置15min，把胶条取出来转入含碘代乙酰胺的平衡管中，烷基化打开的二硫键, 低速摇床上放置15min。5 小心将已平衡好的第一向胶条放置在胶面上，支持膜紧贴长玻板，轻轻压紧，胶条与胶面之间不要有气泡，胶条一端（一般为碱端）加入分子量marker，覆盖一层0.5%琼脂糖固定胶条。6 电泳及染色。见SDS-PAGE、ETTAN DALT II System 以及ETTAN DALT SIX 操作规程。注意事项：剥胶后要注意切角以方便辨别。常见问题及解决方案：1. 参考文献1 p37-412. 参考文献2 p42-443. 参考文献3 p283-2864. 参考文献5 p4-6,p7,p8参考文献：(参考文献1-3在/bpi-server publicreferencesNEWreferenceby project双向电泳文件夹下)1. 2-D Electrophoresis using Immobilized pH gradients, principles and methods，安玛西亚公司操作手册2. 2-D Electrophoresis for Proteomics：A Methods and Product Manual. bio-rad公司操作手册3. Proteomics in Practice. Dr. Reiner Westermeier, Dr. Tom Naven。 Wiley-VCH Verlag GmbH4肿瘤蛋白质组学陈主初、梁宋平主编 湖南科学技术出版社5 双向电泳培训班讲义（定稿）6 蛋白质电泳实验技术郭尧君编著Western blotting Protocol一、 试剂配方：1X TBS: Tris-base 12.11gNacl 8.775g用HCl 调pH7.4，用纯水稀释至1L5X Transfer buffer: Tris-base 15.1gGlycine 72.0gTo 1 L10X碱性磷酸酶缓冲液： 1 mol/L Tris-HCl pH 9.51 mol/L Nacl50mmol/L MgCl2TTBS：1XTBS +TWEEN20（1000：1）碱性磷酸酶显色液：2.5mL 1X碱性磷酸酶缓冲液+16.5L NBT混匀, 再加8.25L BCIP混匀。辣根过氧化物酶显色液：10 mL 0.01 mol/L pH 7.6 Tris-HCl 溶解 6mg DAB，滤纸过滤（-20保存），显色时加10L 30%H2O2（即按1000：1加）。二、实验操作：1、 SDS-PAGE，胶在电转液：1 X Transfer buffer + 20%甲醇+ 0.01%SDS (800mL/800L 10% SDS) 平衡10min。2、 处理尼龙膜：100%甲醇浸泡5min,再加4倍体积的双蒸水，使甲醇终浓度为20%，浸泡5min。1 X Transfer buffer+20%甲醇（无SDS）浸泡10min。3、 转膜：按黑（极）海绵滤纸胶膜滤纸海绵白夹子（+极），（在电转液：1 X Transfer buffer+20%甲醇+0.01%SDS(800mL/800L 10% SDS)中进行）夹好三明志夹，用冰包裹电泳槽，100V 或350mA转70 min。（注意底部靠其下槽，排除气泡，转完后切角作标记）。4、 封闭：电转后膜用1XTBS漂洗1次，置于5%脱脂奶粉中（1XTBS+1000：1 TWEEN20），封闭过夜，或者37，30 min 90 min。5、 一抗：抗体（抗体稀释比例根据自身实验具体确定，推荐比例：抗血清常用1：1001：5000 5%牛奶，培养液上清1：21：100，腹水1：2001：10000 5%牛奶，），震荡孵育1或2小时。（一抗可回收冷冻保存）6、 TTBS洗三次，10 min/次。7、 二抗：1：10005000 TTBS稀释（常用1：3000），室温震荡孵育1小时。8、 TTBS洗三次，10 min/次。9、 显色：将膜放在PARAFILM膜上，滴加显色液5rpm（一般显色1 min即可，注意控制好时间，否则显色背景过深）。10、纯水终止显色，晾干或滤纸吸干保存。考马斯亮蓝染色操作规程实验目的：聚丙烯酰胺凝胶上蛋白质的显色实验原理：考马斯亮蓝染料能与蛋白质的碱性氨基酸结合形成较稳定的复合物形式从而使蛋白质显色。试剂：固定液、染色液、脱色液实验操作程序：1 聚丙烯酰胺凝胶取下来后放置到盛有固定液的盘子里，摇床上轻摇固定30min；2 倒掉固定液，加入染色液，摇床上轻摇染色过夜或者37保温2-3Hrs；3 到掉染色液，加入脱色液脱色至点或条带清晰明亮，背景干净。银染操作规程实验目的：检测聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质。实验原理：在碱性条件下，用甲醛将蛋白带上的硝酸银（银离子）还原成金属银，以使银颗粒沉积在蛋白带上。染色的程度与蛋白中的一些特殊的基团有关，不含或者很少含半胱氨酸残基的蛋白质有时候呈负染。银染的详细机制还不是非常清楚。试剂：乙醇、冰醋酸、乙酸钠、硫代硫酸钠、硝酸银、碳酸钠、甘氨酸或EDTA.Na2.2H2O、甲醛实验操作程序： 固定：30min或者更长时间o 100ml 乙醇 40% 乙醇 o 25ml冰醋酸 10% 冰醋酸 o 加水到250ml 致敏：30mino 75ml 乙醇 30% 乙醇o 17g 乙酸钠 28.2g 三水乙酸钠o 0.5g硫代硫酸钠o 加水到终体积250ml 水洗：3 x 10min 银染：20mino 0.625g AgNO3 o 10