做好毛细管电泳的意义.doc

做好毛细管电泳的意义随着生物化学与分子生物学及生物医学研究的日益深入，研究人员对与生命现象有关的分子的分离分析技术提出了愈来愈高的要求。本文就近年来发展的毛细管电泳及其在生命科学中的应用作些介绍。1.毛细管电泳仪简介毛细管电泳仪商品虽然外型各异，但不外乎由下列几个部分构成:1.毛细管;2.高压电源;3.电极及电极液;4.在线检测器;5.恒温装置;6.样品盘;7.数据收集和处理系统(记录仪、积分仪、电脑)。毛细管是由熔融石英加工制得，为克服石英极脆易断的缺点，在其外壁涂抹了一层聚亚胺酷以增加毛细管的柔性。检测器位于距样品盘约毛细管总长的三分之二至五分之四处，对毛细管壁内部分进行光学聚焦。在线检测器有紫外、荧光和激光等多种检测方式，目前较为常见的是紫外检测。此外，将毛细管电泳仪和质谱仪联用也已见报道。毛细管中充满具有一定离子强度的缓冲液后，在其两端加上高电压，被分析物除受电场力的作用外，还受电渗流作用。毛细管内壁的石英分子在一般水性环境中(pH2.0以上)因HZSIO3分子的解离，其表面形成一层负电荷，吸引缓冲液中的正离子，这一层正离子在电场的作用下趋向阴极，从而带动毛细管内整个溶液向阴极移动。此电渗现象在毛细管电泳中起着举足轻重的作用。虽然被分离的混合物中各分子在特定的电泳缓冲液中带有不同的净电荷，但在电渗作用下均向阴极方向泳动。其最终的迁移力由电渗、缓冲液条件及分子本身的泳动力决定。其中泳动力和分子的荷质比有关。内壁石英分子除能造成电渗流外，还具有吸附溶质中带正电荷分子的能力，从而会影响分离效果。为避免分析物被管壁吸附，可选用缓冲液的pH大于样品混合物中蛋白质和多肤的等电点，此时被分析物与管壁带同种电荷;或者选用pH接近pHZ.o，此时毛细管内壁无解离的负电荷，但此酸性环境易造成蛋白质变性失活，一般仅用于多肤分析。也可对毛细管内壁进行涂层，如中性共价涂层以消除电渗，或采用改变内壁电荷的极性的可逆涂层方法，适于等电点偏高的蛋白质的分离分析。与平板凝胶电泳手工上样方式不同，毛细管电泳采用两种自动进样方式:流体静力进样(通过压力推动或真空吸入)和电动进样。每次进样量为几纳升，一般仅可用于分析鉴定。如要收集分离产物并进行进一步研究，则需重复多次分析以富集分离到的产物。1992年Huang和Mathies等报道毛细管束电泳的实验结果，数十乃至上百根毛细管平行排列，分离得到的产品产量能提高二个数量级。2.毛细管电泳的几种分离模式毛细管电泳根据分离机理等不同，类似于液相色谱的归类，分成几种分离模式，主要为以下几种:2.1.自由溶液毛细管电泳(FSCE)或称毛细管区带电泳(CZE)毛细管中只充有电泳缓冲液，根据被分析物的荷质比差异进行分离。应用最广泛、已见报道的例子有多肤、蛋白质和核酸等生物大分子的分离以及无机离子、氨基酸、药类等小分子的分析。2.2.毛细管等电聚燕(CIEF)根据蛋白质和多肤的等电点进行分离。需选用内壁中性共价涂层的毛细管，阳极端至检测器有效分离部分(离检测窗口差几厘米)充满两性电解质溶液，样品溶液夹在其中以避免直接接触阳极液(H3P04)。毛细管其余部分(检测器至阴极)为阴极液(NaOH溶液)。毛细管两端分别插入阳极和阴极液中，其中毛细管中的溶液和H3PO溶液中均含一定浓度的可溶性甲基纤维素作为支持介质。两性电解质载体和样品在电场中聚焦至电流趋于零，通过压力或在正负极加盐等方式，不同等电点的样品逐一经过检测窗口。此方法除了能测定蛋白质和多肤的等电点外，还可鉴定蛋白质的纯度及分析不同变异体。毛细管等电聚焦具有比凝胶等电聚焦更高的分辨力，即使选用广范围的两性电解质(PH310)，也可分辨相差一个净电荷的天然蛋白质和其突变体。由于是直接在线检测，可分析多肤的等电点，而在传统凝胶等电聚焦中的固定、染色、脱色等步骤中小分子多肤易丢失。整个分析过程可自动化，通常仅需45分钟左右。2.3毛细管凝胶电泳(CGE)根据被分析物的荷质比分离，当凝胶中含有SDS等去垢剂时，则根据它们的分子大小进行分离。主要用于蛋白质、部分多肤和DNA分离。毛细管内的分离介质可以如平板电泳一样呈凝胶状，也可以是甲基纤维素溶液，后者便于清洗，可实现毛细管一管多用。溶液中的甲基纤维素分子在电子显微镜中呈现缠绕状，其作用机理类似于凝胶的筛网作用。2.4.微团电动毛细管色谱(MECC)在电泳缓冲液中加人一定浓度的去垢剂，如SDS及其类似物，这些分子一端为亲水基团，其余部分为疏水结构，在溶液中聚集成一个个微团，称为假固相，被分析的样品根据其在假固相和溶液相中的分配进行分离。此方式主要用于小分子(如氨基酸等)和多肤的分离。3.毛细管电泳在生命科学中的应用3.1.在多肤研究中的应用毛细管电泳可以分辨多肤的细微结构差异，如C一端的酞胺化与去酞胺化，单个氨基酸残基的替换，氨基酸组成相同而序列不同的多肤也能区别开，甚至表面电荷不同而一级结构相同的多肤也有可能分离开。另外用FSCE有时能帮助确定多肤内是否存在二硫键。3.2.在蛋白质研究中的应用毛细管电泳采用温和非变性条件，有利于分析蛋白质的细微结构差异并鉴定蛋白质的纯度。例如核糖核酸酶A、Bl和BZ一级结构相同，差别在于第34位天冬酞胺残基上糖基化程度不同。选择一定的电泳条件可将这三种异构体分开。已知不少遗传工程重组蛋白需含有与其天然蛋白一样的特定多糖，毛细管电泳可监控它们所结合多糖的均一性。毛细管电泳最近被用来研究细胞色素C的结构与功能。Albin等报道了用毛细管电泳研究其表面修饰的位点。他们监测了修饰反应过程，比较了修饰前后的胰蛋白酶酶解肤谱，并收集了含有被修饰残基的肤段，测定其序列，确定了修饰试剂钉复合物所结合的残基。由于毛细管电泳分析快速，可用来监测蛋白质化学反应的动力学过程。如分析RNase蛋白酶解产物中含糖肤段去糖昔化的动力学过程。我们实验室建立了用毛细管电泳测定蛋白激酶A活性的方法，其灵敏度、精确性和线性范围均不亚于经典的同位素法。除了自由溶液毛细管电泳外，毛细管等电聚焦和毛细管凝胶电泳在蛋白质研究方的应用例子也很多。Chen等报道了应用毛细管等电聚焦测定RNase几种变异体的等电点，它们都接近pH梯度的极端值，如RNaseA，Pl9.5;RNaseBa，pl9.0;RNaseTl，pl3.0，以往用凝胶IEF较难测准。图1为我们实验室应用CIEF测定重组人表皮生长因子(rhEGF)的等电点，经分析其pl为5.0。应用毛细管SDS凝胶电泳可以比较方便地分析糖蛋白的分子量。由于多糖基团不结合SDS，糖蛋白的荷质比相对于同样大小的蛋白质低，用经典的SDS一聚丙烯酞胺凝胶电泳估计的分子量偏大，通常必须在不同浓度的凝胶上进行分析，得到糖蛋白迁移率对数值相对于凝胶浓度的线性关系图(Ferguson图)，该直线的斜率称为此蛋白的排组系数Kr。Kr和蛋白质的半径的平方成正比，而蛋白质半径与其分子量的对数成线性，因此得到标准蛋白分子量的fog值相对于Kr平方根的线性关系图，测得糖蛋白的Kr值即可推测其分子量。运用传统的平板凝胶电泳需多次灌胶多次电泳，而毛细管凝胶电泳应用溶液状的分离介质只需对浓的含甲基纤维素的分离溶液进行一系列的稀释，按照设定的程序自动分析即可得到Ferguson图。3.3在核酸研究中的应用核酸分离主要是将不同大小片段分开，由于含有不同个数碱基对的DNA分子(即长度不同)其荷质比相同，因而用自由溶液毛细管电泳不能将它们分离。应用毛细管凝胶电泳模式可解决这一问题。目前作为核酸分离介质的分子筛填充料有两种:一种如同平板凝胶，呈共价交联固定状;另一种为可流动的、无交联的多聚物(如聚丙烯酞胺或甲基纤维素的衍生物)。应用第一种填料，可进行快速、高分辨力、有效、灵敏的DNA序列测定。Smith等在1990年报道了用毛细管电泳进行快速DNA测序的方法。它们在目前商品化的DNA序列仪的基础上进行改建，用灌注凝胶的毛细管代替平板凝胶，改进了光学部分，可同时检测四种波长的荧光，光束聚焦在毛细管5即m内径上。四种反应产物混合在一起上样至聚丙烯酸胺变性凝胶;通过测定不同荧光基团标记的DNA片段，通过检测窗口的次序决定DNA序列。平板凝胶电泳每天可分析lokb，毛细管凝胶电泳可达600kb，分析速度快了数十倍。用甲基纤维素衍生物作为分离介质适用于分离单碱基差异的DNA片段，因而可分析引物的纯度(用于DNA测序、扩增或点突变)，以及鉴定分离基因的探针和用于克隆的连接片段。应用嗅乙锭染料结合紫外检测或荧光染料花青素结合激光诱导的荧光检测，灵敏度可提高上千倍(nx10mol.，一5fg)，因而可以诊断遗传疾病，分析特殊染色体的基因谱图乃至法医学鉴定。但这一方法用来分离含几千以上碱基的DNA片段尚有困难。3.4.用于其它分子分析应用毛细管凝胶电泳结合激光诱导荧光检测分离经荧光标记的多聚糖混合物，具有较高的分辨力，可分离多聚半乳糖醛酸部分水解产生的含不同个数单糖的一系列聚合物。应用MECC可进行兴奋剂分析，在一次电泳中能将以下几种