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肿瘤病理概述 （一）总论1.肿瘤的定义、分类与命名。2.肿瘤病理学常用术语。3.肿瘤的组织发生及基本形态特征。4.肿瘤临床病理诊断规范及注意事项。5.现代技术在肿瘤病理学中的应用 （二）专题：恶性肿瘤侵袭转移分子病理学机理研究进展。（三）各论：消化系统肿瘤及乳腺癌的病理学特点 恶性淋巴瘤概述。 其它系统常见肿瘤介绍世界卫生组织报告 2000年 全球各种原因死亡人数为5600万 恶性肿瘤患者占1000万，其中有 620万人死于癌症 预计2020年 新增 2000 万 死亡 1200 万 我国每年130多万死于恶性肿瘤，其中有 80万人死于癌症 我国恶性肿瘤死亡前十位 胃癌、肝癌、肺癌、食管癌 大肠癌、白血病和淋巴瘤、 宫颈癌 、 鼻咽癌、乳腺癌 地域不同，肿瘤发病不一中国常见癌瘤分布乳腺癌散发分布 鼻咽广东、广西、湖南、福建、江西食管癌河南、河北、山西 胃癌西北及沿海各省（甘肃、青海、宁夏、江苏、浙江等）肝癌东南沿海（上海、广西、福建、江苏、广东） 肺癌京、沪、津、辽宁、吉林、河北等宫颈癌山西、内蒙、陕西、湖北、江西等 大肠癌浙江和长江下游流行病学人群分布 年龄 性别：男女,但乳腺癌、胆囊癌、甲癌却相反 职业：扫烟囱工人阴囊癌(Pott,1775年 苯胺染料工人膀胱癌(Rehn,1895年) 种族：鼻咽癌 广东人 皮肤癌 白种人 口腔癌 印度人 胃癌 日本人对肿瘤的初步认识 常 见 危害大 投入多 进展慢对肿瘤大致印象 肿块、多年 生长慢、快 压迫、破坏 转移、死亡一、肿瘤的定义、分类和命名（1） 机体在各种致瘤因素的作用下，局部组织的细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致克隆性增生而形成的新生物，常形成肿块。肿瘤的特性概念中的共性 特殊的细胞增生性病变 过度增生，与机体不协调 伴异常分化，失去分化成熟能力 常形成局部肿块 具异常形态结构及功能代谢 相对自主性，无限制性 各种致病因子长期协同作用肿瘤与发育异常的区别l 一般为成熟组织l 结构与原来正常成熟器官一致 l 达到一定成熟程度即停止生长一、肿瘤的定义、分类和命名（2）（二）肿瘤的分类依据：（1）生物学特性： 良性肿瘤 交界性肿瘤 恶性肿瘤 （2）组织 来 源： 癌 肉瘤 （3）功能： 按淋巴细胞亚群分类： B细胞性、 T细胞性（抑制/辅助）、内分泌性肿瘤 （4）分 化程 度： 分化型、未分化型 （三）、肿瘤的命名原则（一）规则命名 1、良性肿瘤 部位组织来源瘤 2、恶性肿瘤A 癌 来源于上皮组织的统称为癌 （carcinoma） 部位组织来源癌B 肉瘤间叶组织（包括纤维结缔组织、脂肪、肌肉、脉管、骨、软骨组织等）发生的恶性肿瘤统称为肉瘤（sarcoma）如股骨骨肉瘤C 转移性肿瘤命名 部位转移性原发瘤 如肺转移性肝癌D 一个肿瘤中既有癌的结构又有肉瘤的结构，则称为癌肉瘤（carcinosarcoma） 1、结合形态命名： 如乳头状囊腺瘤、透明细胞癌。4、以恶性+ 瘤命名恶性肿瘤 如恶性神经鞘瘤，恶性脑膜瘤5、以瘤病”命名 如纤维瘤病、软骨瘤病6、习惯命名白血病、精原细胞瘤7、来源三个胚层的肿瘤：畸胎瘤 肉瘤样癌：上皮发生的恶性肿瘤，由于其间变或异质性发育，形成肉瘤样组织学形态 错构瘤：指机体某一器官内局部原有成熟组织或细胞过度生长，异常组合构成的肿块。 迷芽瘤：又称迷离瘤，在胚胎发育过程中，体内某些组织可离开其正常部位，而到一些不该存在的部位，称组织异位或迷芽，该迷芽组织形成的肿块称迷芽瘤。 蝾螈瘤：恶性外周神经鞘瘤伴横纹肌肉瘤分化。二、肿瘤的组织发生及基本形态特点1 部位 ： 广泛性2 肉眼形态：主要有以下几方面 肿瘤的数目Number 多发或单发 肿瘤的大小Size 悬殊很大 肿瘤的形状Shape 多种多样 肿瘤的颜色Color 五光十色 肿瘤的硬度Hardness不一 （肿瘤硬度不一：纤维间质与细胞的比例 a.纤维间质多质地较硬 b.细胞丰富 质地较软）继发改变 出血囊性变 变软，夹杂红色 感染坏死变软，多彩色 钙化、骨质形成 变硬肿瘤的间质有以下成分：纤维结缔组织纤维母细胞、肌纤维母细胞，可作为肿瘤的支持组织，后者尚有延缓瘤细胞浸润，限制瘤细胞活动作用。血管组织营养肿瘤细胞。炎性细胞浸润可杀伤肿瘤细胞、或有助于肿瘤细胞扩散。 血 管l在肿瘤血管生成因子作用下增生而成lTAF由Folkman（1971）发现，包括 血管内皮生长因子（VEGF）、纤维母细胞生长因子（FGF）、 转化生长因子（TGF）、表皮生长因子（EGF）、肿瘤坏死因子（TNF）、 血小板源性内皮细胞生长因子（PDECGF）、肌成纤维细胞 (myofibroblast)作用：产生胶原纤维，具收缩功能、抑制瘤细胞的浸润和扩散、遏止瘤细胞侵入血管、淋巴管内、有大量纤维间质的癌组织中多、解释乳腺硬癌乳头回缩、消化道硬癌管腔狭窄二、肿瘤的组织发生及基本形态特征异型性表现肿瘤的异型性-Atypia：在细胞形态和组织结构上，与发源的正常组织不同程度的差异性反映成熟程度-分化程度，相似程度诊断肿瘤及确定良恶性的主要依据differentiation 胚胎学-幼稚原始的细胞发育为成熟细胞的过程 肿瘤学-肿瘤细胞和组织与其来源者在形态和功能上的相似程度1.异型性反映成熟程度-诊断肿瘤及确定其良恶性的主要组织学依据分化与异型性关系成熟度（分化程度） 异型性 恶性程度 高 小 低 中 较大 中 低 大 高 未分化 显著 很高A 组织结构的异型性-指肿瘤组织在空间排列方 式上，与其来源组织之间的差异 表现以下几方面： a肿瘤细胞排列异常 b肿瘤细胞层次异常 c实质与间质组合异常良性肿瘤的异型性不明显： 与其发源组织相似 排列与正常起源组织不同恶性肿瘤的组织结构异型性明显：与正常组织结构相距甚远 排列更为紊乱 失去正常的结构、层次、极性B 肿瘤细胞细胞的异型2、瘤细胞核的多形性1.核体积增大、核浆比例增大2.核大小、形状、染色不一3.核染色深、染色质呈粗颗粒状4.核仁肥大、数目增多5.核分裂像增多、可出现病理性核分裂像（不对称、多极、顿挫性核分裂像） MF的意义 是细胞正常生长繁殖的表现 出现与否及数量多少反映组织的生长活跃程度 MF多不能直接诊断恶性肿瘤 有些恶性肿瘤MF少见或罕见 腺样囊性癌 腺泡状软组织肉瘤 脂肪肉瘤（粘液型） 软骨肉瘤 粘液肉瘤 恶性卵黄曩瘤 ！MF少不能排除恶性肿瘤 MF出现的部位 鳞状上皮 棘层、表皮层MF较基底层MF意义大 淋巴结 滤泡外MF较滤泡内MF意义大 不同肿瘤意义不同 纤维肉瘤，隆突性纤维肉瘤 MF1/10HPF（恶性） 平滑肌肉瘤MF5/10PHF（恶性） 结节性筋膜炎MF 多 （良性） 病理性MF：意义重大，高度异型 多极性 三极（三岔形） 四极（十字架形） 五极（海星状） 不对称性 分裂后期染色体被分割成不均匀两组 顿挫性（流产型） 进程障碍，染色体退化、崩解 部分与血供不足有关3、瘤细胞胞浆的改变： a.胞浆多呈嗜碱性染色b.胞浆内可出现粘液、糖原、脂质、角蛋白、色素等分泌或代谢产物c.有助于判断肿瘤的来源l 实质细胞产生的分泌物或代谢产物-判断来源;骨肉瘤骨基质软骨母细胞瘤软骨基质肝细胞癌胆汁B-C淋巴瘤Ig 胃肠道腺上皮肿瘤粘液（印戒细胞） 4、肿瘤细胞的超微结构的改变: 可提示肿瘤来源或分化方向 对良恶肿瘤区别无帮助v 特殊结构: 黑色素小体/黑色素前体恶黑 Birbeck颗粒组织细胞增生症X（Langerhans cell） 二、肿瘤的组织发生及基本形态特点（4） $ 间叶组织源性组织结构:a实质与间质分界不清 b不形成癌巢，无网纤包绕 c无细胞间连接，瘤细胞弥漫分布（七）肿瘤病理分期原则：三、与肿瘤有关病变（1）（一）、上皮组织的癌前病变:1、粘膜白斑2、慢性子宫颈炎伴宫颈糜烂3、纤维囊性乳腺病4、结肠、直肠的腺瘤性息肉5、慢性萎缩性胃炎及胃溃疡6、慢性溃疡性结肠炎7、皮肤慢性溃疡8、肝硬化绒毛状腺瘤（2cm）:癌变率40炎症与肿瘤的关系 慢性炎症和癌症有明显的关联。患有大肠炎的个体终生都有罹患结肠癌的危险性，最高达40，而消炎药能把这种危险性降低至少3/15。 许多科学家怀疑一种名为核转录因子-NF-B在这一过程中发挥了不可忽视的作用 加州大学，圣地亚哥的分子生物学家 Michael Karin和他的同事们制作了一个鼠大肠炎模型。动物们被喂食一种常常会导致结肠癌的致癌物。 这个 研究组制作一组IKK酶缺乏的鼠，IKK酶可以激活 结肠上皮细胞中的NF-B，这正是结肠癌发生的地方。这些鼠只有25发展成结肠癌。（二） 淋巴组织的病变 血管成免疫细胞性淋巴结病、单核细胞增多症。（三） 神经外胚叶的病变 交界痣四、肿瘤病理学常用术语（1） 尸检世界性医学误区 国内外的尸体解剖率呈明显下降趋势 大幅度下降的原因主要有两点：一是政府官员、医生和民众都陷进了同样的误区：那么多的高科技诊断手段都做了，尸体解剖已属多余。二是尸体解剖对医院来说，不但没收入，反而要贴钱。 尸体解剖仍然是疾病诊断的“金标准 活检 活体组织检查(biopsy)简称“活检”，亦称外科病理学检查，简称“外检”，是指应诊断、治疗的需要，从患者体内切取、钳取或穿刺等取出病变组织，进行病理学检查的技术。对绝大多数送检病例都能做出明确的组织病理学诊断，被作为临床的最后诊断。HE切片制片过程 取材(2*2*0.3) 酒精 二甲苯浸蜡 包埋 蜡块 切片染色 苏木素染核兰色伊红染胞浆红色金光闪闪的HE 病理诊断是金标准，HE为金标准的金标准 病理医生绝大多数时间用于对HE组织和细胞图像的辨认，不任古今中外 免疫组化等技术对病理诊断只能起参考和辅助作用活检分类 术前活检，是指在治疗性手术前或在其它治疗(如放疗、化疗)前所做的活检。 术中活检，是指在治疗性手术或探查性手术进行当中所做的活检，一般在20-30分钟内完成定性诊断，以便指导手术如何进行。快速冷冻、快速石蜡 术后活检 ，是指对治疗性手术切除的病变及相关的组织、器官进行较全面的病理学检查四、肿瘤病理学常用术语（4） 基本特征： 1）介于畸形与真性肿瘤之间，不同程度兼有两者特征； 2）瘤中各种组织虽增生过度，但细胞分化成熟，一般无异常分化表现，只是结构紊乱；3）生长缓慢，到一定程度即停止生长，与机体生长相协调。四、肿瘤病理学常用术语（5）非典型增生分级根据累积的范围和异型性的程度轻度（I 级） 累及上皮层 下部的1/3中度（II 级） 累及上皮层下部的2/3重度（III级） 累及上皮层2/3以上。四、肿瘤病理学常用术语原位癌:一般指粘膜上皮层内或皮肤表皮层内的非典型增生（重度）累及上皮的全层，但尚未侵破基底膜向下浸润生长者。例如子宫颈、食管及皮肤的原位癌 上皮内瘤变（Intraepithelial neoplasia， IN） 是指基底膜以上上皮内的浸润性癌前的一种肿瘤性改变，形态上表现为结构和细胞学的异常，呈克隆性生长，易进展为浸润性癌并发生转移。 复层上皮器官 宫颈 CIN 外阴 VIN 阴道 VAIN 腺上皮器官 前列腺 PIN 乳腺 DIN 胃肠 GIINCIN 三级分类子宫颈上皮内瘤变（Cervical Intraepithelial Neoplasia） CIN 123宫颈上皮内瘤变 轻度非典型增生 中度非典型增生 重度非典型增生和原位癌CIN 2 vs Normal CIN 3 CIN3/累及腺体乳腺导管上皮内瘤变不典型增生与异型增生 有些学者将异型增生表示肿瘤性增生,而不典型性表示反应性病变 WHO 分类第二版中仍将不典型性/ 异型性增生作为同义词，但是引入了“上皮内瘤”这一术语,用来表示上皮浸润前的肿瘤性改变。 异型增生则可看作上皮内瘤的同义词,但异型增生侧重于形态学改变,上皮内瘤变更强调肿瘤演进的过程 总之，更多的倾向是，不典型性常用于反应性增生,异型性增生用于肿瘤性增生。 四、肿瘤病理学常用术语（6） 肿瘤的异型性（atypia）。 肿瘤细胞无论在细胞形态及组织结构上都与其发源的正常组织有不同程度的差异差异的大小与细胞的分化有关分化与异型性关系成熟度（分化程度） 异型性 恶性程度 高 小 低 中 较大 中 低 大 高 未分化 显著 很高四、肿瘤病理学常用术语 一点癌：内窥镜检查时粘膜疑癌病变处钳取活检，病理确诊为癌，而手术标本检查无癌。 注意点: 癌变及恶变： 良性肿瘤或癌前病变演变成恶性的过程。 癌变与恶变同意词。 1）明确有良性病变 2)局灶小范围。上皮癌变，间叶肉瘤变。五、良性肿瘤和恶性肿瘤 区别distinguish benign and malignant tumors注意 1、上述区别是相对的，需要结合临床综合考虑。如血管瘤，呈浸润性生长，无包膜，但为良性肿瘤。2、良性肿瘤在一定的条件下可以恶性转化。结肠腺瘤性息肉，可变为腺癌。3、某些肿瘤在生物学行为、形态结构上，介于良恶性肿瘤之间，称为 交界性肿瘤（borderline tumor）。 如卵巢的乳头状浆液性囊腺瘤有可能异型增生而癌变。 间叶组织良性瘤的恶变肉瘤变v 在良性瘤结构中出现明显的细胞异型v 核分裂象增多，尤其是出现病理性MFv 肿瘤中明显的细胞密集区或坏死区 上皮性肿瘤的恶变癌变 乳头状瘤或腺瘤结构中出现：a小片细胞的明显异型 b排列紊乱，细胞极性消失 c腺管共壁或出芽提示浸润性生长l d核分裂象增多，尤其是出现病理性MF e部分瘤细胞侵入间质/血管/淋巴管/包膜六、癌与肉瘤的比较七、肿瘤病理学诊断规范及注意事项（一）肿瘤的病理学诊断规范（1）肿瘤病理诊断的作用1.为临床提供明确的病理诊断 2.为肿瘤患者临床治疗提供进一步依据 包括肿瘤起源、详细的分类、分型、分化、侵袭程度、有无转移及转移淋巴结的数目、结构、激素受体表达、特异性酶活性、核分裂像及前哨淋巴结等 3.提供肿瘤患者预后信息 检测P53蛋白、PCNA、PTEN、P16缺失nm23基因与肿瘤转移4病理诊断与临床的联系 （1）年龄 （2）性别 （3）部位（4）病史与临床症状 人体所有离体组织都必须做病理检查 举证倒置强调了病理检查的重要性。呈堂证供。病理诊断报告 病理诊断报告是重要的医疗文件，应及时、准确、简练，不仅需要尽可能完整而简要地描述一个病例全部有关的大体和镜下特征及标本的所有检查结果，而且要向临床医师解释它们的重要性 四类病理诊断 明确肯定病变部分及疾病的诊断， 如：胃小弯溃疡型管状腺癌，侵及浆膜层；幽门淋巴结4枚，其中1枚有管状腺癌转移；不能完全肯定或有所保留的诊断。 一般是由于病变不够典型，性质难定；或虽能确定为恶性，但其组织来源难定。此类报告中，会出现“考虑为”、“倾向于”、“可能为”等字样。 如：（喉部）鳞状上皮中重度不典型增生，局部癌变可能。描述性诊断， 如：（右小腿）送检组织部分坏死，边缘见鳞状上皮增生伴大量慢性炎细胞浸润。不能病理诊断， 如：送检小块组织，严重挤压变形，不能诊断。病理的难度 手术越来越细，病理难度越来越大 活检标本越来越小，越来越碎，越来越煳 病人的维权意识越来越强，病理报告的法律作用越来越大，病理诊断的准确性要求越来越高刀刃上的舞者 没有鲜花，没有掌声，甚至没有感谢，没有观众，他们在舞蹈，为自己的责任与良知，为追求内心中的真理，在舞蹈； 而这样的舞蹈，一旦失误，除了顺着刀片低落的鲜血，更让他们难以理解的恐怕还是患者的不解与谩骂，甚至拳脚相加。 临床出错像开汽车车祸多而轻，病理出错像开飞机失事少却重一脚在医院一脚在法院 人命关天：病理医生的诊断错误危害大 没完没了：切片、蜡块、资料保存30年 铁证如山:镜下视野不变，诊断标准随时代而变，但大的原则不能变 铁打的切片，流水的医生 要想富，做手术，做完手术告大夫，赢了就是万元户正确对待病理诊断错误 世界上不犯错误的病理医生还没有出生 世界上没有哪家医院的病理诊断的准确率达到100%。 美国医院对其所有的病理科都有严格的质量控制，所以绝大部分医院病理科诊断准确率能达到95 有些错误是难免的，而另外有些错误又不是难免的，我们怎么来判定该不该容忍它 八。影响肿瘤患者预后的形态学因素九、现代技术在肿瘤病理诊断中的应用 (一）电镜技术在肿瘤病理诊断中的应用（二）显微切割技术 显微切割技术是90年代出现的一项新技术 ，该技术能够在显微镜下，从组织切片上切下小片组织或单个细胞，用这些切下的材料进行PCR扩增，能够得到同类细胞，甚至单个细胞的基因，这样研究结果更为准确。 （三）组织芯片组织芯片又称组织微阵列（tissue microarray）, 是1998年在cDNA微阵列的基础上发明的一种特殊的生物芯片，是继基因芯片和蛋白芯片之后生物芯片家族的又一新成员。 组织芯片一般是指将数十个至上千个组织整齐地排放在一张载玻片上而制成组织切片，其特点有：体积小、信息量大，一次性实验可获得大量结果，提高工作效率，节省大量材料和试剂。（四 ）原位分子杂交（In situ hybridization）（五）免疫组化的应用开始于70年代，发展高峰是80年代， 90年代已在国外病理科列入病理技术室的常规工作。国内病理科约晚10年的进程，90年代开始在诊断病理工作中普及。免疫组织化学的工作原理 MSA +显示肌上皮免疫组织化学在诊断中的应用(1)提高病理诊断准确性(2)对疾病的预后和治疗的意义(3)对肿瘤增生程度的评价 (4)微小病灶的发现微小癌，微小病灶 (5)指导肿瘤的治疗(6)恶性淋巴瘤及白血病的诊断及分型恶性肿瘤的性质?提高诊断的准确性 如软组织梭形细胞肿瘤，是神经源性、肌源性、纤维源性等， 可做s-100、DES、MSA MyoD1、 Vim等鉴别不明起源癌的免疫组织化学应用器官特异性标记物 甲状腺： TG甲状腺球蛋白 （在100% 滤泡和乳头状癌+） TTF-1 CT 降钙素（在90% 髓样癌+） 前列腺: PSA微小癌的发现 有些活检（如支气管活检）显示人为挤压或烧灼（小细胞癌常见）：不能确认失常的细胞是否为癌细胞 若 CK 阳性的非正常上皮细胞存在于一定的部位（如间质）或以某种组织结构（如浸润性条索）存在则可诊断为癌 不需再次活检就可作出诊断乳腺：导管增生或导管原位癌? 导管增生与DCIS很难鉴别-这对病人的治疗非常关键 在芯针穿刺中更加困难 免疫组化方法： 高分子量 CK（如 34E12）在良性病变强阳性表达，但在 DCIS 通常阴性 ER 在良性病变中通常呈局灶性阳性表达，而在低度DCIS 呈弥漫强阳性表达，提示为克隆（肿瘤）性过程淋巴瘤分类重要标记物 T细胞淋巴瘤 CD3、CD45RO B 细胞淋巴瘤：CD20, CD79a 滤泡性淋巴瘤：bcl-2 间变性大细胞性淋巴瘤：CD30, ALK肿瘤的预后判断：预后因子 激素受体，如 ER/PR+ 在乳腺癌中提示良好预后 增殖标记物（Ki67）是某些类型肿瘤的预后因子 癌基因及抑癌基因产物，c-erbB2, Rb, p16, p21, p27, ALK1确定治疗的靶分子 乳腺癌：激素受体（ER, PR） 激素（如 Tamoxifen）用于乳腺癌治疗已有相当长的时间了 ER/PR阳性表达的肿瘤比阴性更敏感确定治疗的靶分子 STI-571（Gleevec, Imatinib），是酪胺酸激酶受体抑制剂，对胃肠间质瘤治疗有效 显然在进行治疗前须确证c-kit/CD117的阳性表达 肿瘤学家常要求病理学家对各种肉瘤进行 c-kit 染色，希望对阳性病例进行 STI-571 治疗上皮性肿瘤标记物(1)共同的标记物角蛋白*(cytokeratin/keratin, CK)(2)存在于大部分上皮细胞内的标记物 上皮膜抗原(epithelial membranous antigen, EMA)*大多数上皮性肿瘤 (3)选择性存在于某些上皮细胞内的标记物 a.甲胎蛋白(-fetoprotein,AFP) 肝细胞癌，生殖细胞性肿瘤b.前列腺特异性抗原(prostatic specific antigen，PSA) 前列腺上皮及其来源的肿瘤 c.卵巢癌抗原(CA125) 卵巢、子宫、乳腺癌 间叶源性肿瘤标记物(1)间叶细胞及肿瘤共同标记物 波形蛋白*(vimentin, VIM) 间叶组织、良、恶性肿瘤(2)肌细胞，肌上皮及肿瘤标记物 结蛋白(desmin，) 肌细胞及其肿瘤(横纹肌肉瘤/平滑肌肉瘤) 肌红蛋白(myoglobin) 横纹肌，心肌细胞及其肿瘤平滑肌肌动蛋白(SM-actin/SMA) 对平滑肌较特异(3)内皮细胞及肿瘤标记物 CD31 、CD34 内皮细胞，血管良恶性肿瘤，淋巴造血组织标记物(1) 共同标记物 白细胞共同抗原 (leukocyte common antigen, LCA)CD45 全白细胞标记，血白细胞，单核细胞，肥大细胞，各种淋巴瘤； (2) T淋巴细胞标记物 CD45RO(UCHL-1)、CD3、CD43 (L60/Leu-27) T细胞淋巴瘤(3) B淋巴细胞标记物 CD20(L26)、CD79a B细胞淋巴瘤(4) 霍奇金R-S细胞标记物 CD15+(Leu-M1)、CD30*(BerH2)+ 霍奇金淋巴瘤(非淋巴细胞为主型)(5)组织细胞原性淋巴瘤标记物 CD68、神经源性肿瘤标记物(1)胶质细胞标记物 胶质纤维酸性蛋白(GFAP) 星形细胞瘤，各种胶质瘤，室管膜瘤(2)神经细胞及神经内分泌细胞标记 神经微丝(neurofilament, NF) 神经细胞及其肿瘤，如神经母细胞瘤、嗜铬细胞瘤神经特异性烯醇化酶( NSE)*嗜铬粒(CgA)突触素(syn)(3)黑色素细胞标记物 人类黑色素瘤抗体HMB45 S-100蛋白内分泌肿瘤标记物 a.甲状腺球蛋白(TG) 甲状腺上皮肿瘤 b.降钙素(CT) 甲状腺髓样癌及C细胞增生 c.人类绒毛膜促性腺激素(hCG)、人类胎盘泌乳素(hPL)： 滋养细胞肿瘤及具有滋养叶成分的生殖细胞源性肿瘤举例说明癌：Cytokeratin+，Vimentin-， LCA- 1、神经内分泌癌：CgA+，Syn+ 2、鳞癌：Cytokeratin+（高分子量）3、腺癌：Cytokeratin+（低分子量）肉瘤：Vimentin+ Cytokeratin- LCA-1、恶黑：HMB45+，S-100+ 2、肌源性肉瘤：HHF35（Actin）+，Desmin+ 3、横纹肌肉瘤：Myoglobin+，Myosin+ 4、血管肉瘤：F8+，CD34+， CD31+ 5、恶纤组：CD68+ 淋巴瘤： LCA+，Vimentin,Cytokeratin-1、CD20（B细胞）、CD3（T细胞）、LCA为一线抗体；2、有大的异型肿瘤细胞时 a.有大异型淋巴细胞时加CD30+（何杰金细胞或间变大细胞淋巴瘤）、ALK+（间变大细胞淋巴瘤）； b.有大异型上皮样细胞巢时，加CK+（癌）、HMB45+（恶黑）；目前免疫组化工作中存在的问题：免疫组化诊断的重要原则 单单免疫组化染色结果无任何诊断价值！ 免疫组化诊断时结合HE形态十分重要：抗体的选择及结果的判断都要以HE形态为依据。当免疫组化最后结果出乎意料之外，与HE预期结果差别很大时首先要核查免疫组化染色中存在的问题； 若确实免疫组化染色无误，要进一步核实（查阅文献/上网, 产品目录？）是否有不了解的交叉反应或异常表达。 免疫组化诊断的重要原则 如果免疫组化染色结果确定可信，则不能不考虑另外的诊断，并要结合临床、影像学等检查结果综合分析后才能否定原来的HE诊断。 出现这样的情况可能是新文献了解不全面，对某些肿瘤特殊的HE形态表现尚未了解， 如印戒细胞型滤泡淋巴瘤，梭形细胞的淋巴瘤，小细胞型的大细胞间变型淋巴瘤，肉瘤型的大细胞间变型淋巴瘤，免疫组化诊断的重要原则 观念不断更新 a.及时更新抗体（组织细胞标记，myoglobin， vimentin等）b.新应用抗体（p63，calponin，E-Cadherin, TTF-1, et al)c.新反应（CD10, CD34, CD99，et al) d.新pattern 不断地学习，使这项技术得以正确的应用，达到确诊的目的。7、流式细胞技术（Flow Cytometry ，FCM)FCM提供的肿瘤细胞生物学信息：免疫组织化学的应用（Immunohistochemistry） 用已知的抗原或者抗体去检测待检组织中的抗原或抗体，根据其结合后经一系列方法的处理，呈色反应，在光镜下确定组织的来源属性和部位。1发展简史1941年 Coons 首先用荧光素标记抗体检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功。60年代 Nakane建立酶标抗体技术铁蛋白标记Ab技术。70年代 Stemberger 改良上述技术，建辣根过氧化物酶抗体过氧化物酶（PAP）技术，使免疫细胞化学得到广泛应用。2.优 点 特异性强 抗原与抗体是“一对一”的特异结合 敏感性高 抗体稀释上千倍、上万倍仍可在组织细胞中与抗原结合。 定位准确、形态与功能相结合可在组织和细胞中进行抗原准确定位，同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察。抗原：凡能刺激机体产生相应抗体或致敏淋巴细胞，并能与抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合的物质称为抗原。 （1）全抗原 它兼有免疫原性和反应原性。全抗原具有较大的分子量，并具有较复杂的化学组成。 （2）半抗原 只具有反应原性而没有免疫原性。它是一种低分子量的决定基团。抗体：是机体受抗原刺激后，在体液中出现的一种能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白。*多克隆抗体 多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物（大多数为兔），并从该动物血中所获得的免疫血清。它是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。*单克隆抗体 单克隆抗体是针对一种抗原决定簇的一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体。它是应用细胞融合杂交瘤技术通过免疫动物（大多数为小鼠）而制备的。3免疫组织化学的技术分类 （1）根据AgAb结合方式分成： 直接法 间接法 多层法4.标记物（1）必要性：组织细胞内AgAb结合反应一般是不可见的，若在镜下检测，则必须具有可视性标记物。（2）常用标记物荧光素：最常用的是异硫一氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate ， FITC） 荧光显微镜下呈绿色荧光 四乙基罗达明（rhodamine RB200）荧光显微镜下发橙红色荧光 酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。 生物素：（Biotin） 铁蛋白金等：主要应用于免疫电镜。 其他：如同位素（因涉及污染和防护难一般不用）5应用 凡是组织细胞内具有抗原性的物质，如肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、表面抗原等等均可用免疫组织化学方法显示，因而目前在基础与临床科研中被广泛应用。最近几年，分子生物学研究异常活跃，但最终还要归到形态上来。用免疫组织化学方法对所研究的大分子分子进行定位，进而深入研究其功能。一、免疫荧光技术 染色方法-直接法 荧光素直接标记特异性抗体（抗）上，标记抗体与抗原结合（在切片上）荧光显微镜下观察检测抗原。 酶标抗体要显示后镜检。二、免疫酶组织化学技术1PAP法（过氧化物酶抗过氧化物酶法Peroxidase antiperoxidase method， PAP法） 是桥法的改良，既先形成PAP复合物抗原抗体抗IgG抗体PAP复合物。存在问题： 第一抗体和第三抗体必须为同种种属动物。如第一抗为小鼠的，则第三抗体就一定要用小鼠的。 抗体孵育时间过长。第一抗体的孵育时要求放于4冰箱中过夜，时间可达十几小时。长时间的孵育可产生几种不良后果：一是容易产生背景染色；二是影响染色的成功率，常可导致切片脱离载玻片等。 复合物分子较大，移动缓慢，对组织的渗透力不强。 可产生背景染色，影响阳性结果。 整个过程需时过长，约20小时。2、ABC法（亲和素/卵白素生物素过氧化物酶复合物法，AvidinbiotinperoxidaseComplex method，ABC法） Avidin： 亲和素，一种糖蛋白，其上有4个 与生物素相结合的位点。 Biotin ： 生物素维生素H，两者亲和力巨大，牢不可破。（1）ABC复合物的制备 （2）ABC法反应原理 存在的问题： 需要预先形成复合物，即卵白素和生物素，在加于切片前的30分钟，先将两者混合起来，形成复合物。该复合物为三维结构，在结合了其它物质后，就会使自身体积增大，行动缓慢，活动受限。 卵白素中含有约7%的糖类，它可与组织中含糖基的物质起反应，造成背景的染色。 卵白素的等电点10左右，可带较多的负电荷，纤维组织可带较多的正电荷，这两种电荷可互相吸引，造成背景的染色。 卵白素中有4个结合点，其中一半与连接抗体结合，另一半与复合物结合，如此可降低其敏感性。3.SP或SAP法（过氧化物酶标记的链霉卵白素或过氧化物酶标记的碱性磷酸酶染色）Streptavidin/peroxidase or strepta-vidin/alkaline phosphatase）在ABC法基础上进一步改良，使链霉卵白素代替卵白素-它有4个亚基可与生物素结合，灵敏特异，背景低，成本低。 不需预先形成复合物，分子体积小，行动灵活，对组织参透性强。 链卵蛋白素等电点5.5-6.7，接近中性，所带负电荷少，不容易与组织中的正电荷发生相互吸引，因而可降低背景的染色。 链卵蛋白素不含糖基，不存在与组织中含糖基类的物质起反应的现象。 链卵蛋白素有4个与生物素结合的点，它们可以全部地和2抗上的生物素结合，从而增加其敏感性，从某种意义上讲，它比ABC法的敏感性起码增加一倍以上。 节省时间，每种抗体的孵育时间都在10-30分钟左右。 抗体可以高度稀释，增加标记病例，降低成本。 背景清晰，无非特异性染色，阳性物突出，明显易辨。 染色时间短，提高了染色的成功率，经几千例的实验证明，染色成功率几近100%，减少了反复制作的机会，保证了病理报告的及时发出，为病人的治疗和诊断赢得了时间。 多个抗鼠和抗兔IgG分子与辣要过氧物酶聚合，当形成复合物后，可直接与抗原抗体的复合物聚合在一起，经DAB显色即可完成染色。1、固定10中性缓冲福尔马林 甲醛 100ml 蒸馏水 900ml NaH2PO4H2O 4g Na2HPO4 ( 无水) 6.5g 该固定液是当今流行的固定液, 因它对组织固定较好, 损伤较少, 因对其后的各方面的研究都较好, 尤其是对免疫组化的染色 2 、玻片的处理 3 、烤片 Ab滴片技术 所滴的抗体应与切片上的组织刚好吻合。注意 滴抗体前需把切片上的水弄干，但不能干片。 要领：甩净组织周围的水。PBS洗涤技术（1）洗涤的目的 保证离子浓度和PH值。 减少非特异反应（平时Ab不可靠很纯）（2）温度与时间 4：过液， 16 37：1 h or 参考说明书光镜控制显色方法（1）室内操作：注意温度与时间的关系，室温最宜5分钟。（2）染色稍浅亦可拿出，脱水，封片后颜色 加深。（五）对照组和染色结果的评价阳性对照：用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫细胞化学染色。对照切片呈阳性结果，标为阳性对照。阴性对照：用确证不含已知抗原的标本作对照，应呈阴性结果，称阴性对照。其实这只是阴性对照中的一种，阴性对照还应包括空白、替代、吸收和抑制实验。实际工作中的抗原恢复a.酶消化 b.热修复 酶消化 甲醛固定可引起蛋白侧链的交联，掩盖抗原决定簇位点，蛋白酶消化可以去除，暴露抗原决定簇。酶消化应注意的问题 酶的种类 浓度 pH值 时间 温度预实验 热修复 甲醛固定组织后会使蛋白质的结构发生改变，从而使原来暴露的抗原决定簇位点被掩盖，高温后自然冷却可使蛋白质的结构舒展并基本复原，从而暴露抗原决定簇的位点。热修复应注意的问题 热处理后应注意自然冷却。 修复液不要让其煮干。 是否任何抗原的检测都使用（有争议）。如果在常用的修复液中无法实现抗原修复，或抗原定位发生改变，可改用其它修复液。 内源性HRP*分布: 脑, 脾, 中性WBC, 巨噬细胞 血红蛋白和肌红蛋白含有铁卟 啉具有内源性HRP活性内源性HRP的消除:3% H2O2, 5 0.3% H2O2甲醇溶液, 150.1% HCl 酒精溶液, 30 0.2% 醋酸甲醇溶液, 300.01% 过碘酸 5-10, 0.1% 硼酸钠 10内源性生物素:研究显示 （1）冰冻组织中存在内源性生物素。（2）经福马林固定石蜡包埋后生物素被封闭。（3）加热抗原修复可造成内源性生物素暴露。（4）内源性生物素暴露的强度各不相同，从弱阳性（+）到强阳性（+）。（5）内源性生物素在组织中的分布形式，既有散在分布也有弥漫分布，主要以颗粒状形式存在于胞浆中。（6）内源性生物素广泛存在于上皮源性组织，特别是腺上皮组织，亦存在部分非上皮组织。（7）内源性生物素不仅存在人体组织，也存在大鼠组织。（9）热抗原修复暴露的内源性生物素可被鸡蛋清封闭。（8）内源性生物素暴露的强弱与修复液有关，其强度增加依次为：柠檬酸、EDTA、EGTA。建议 为了避免免疫组化中内源性生物素的干扰，凡采用冰冻切片或石蜡切片加热抗原修复和生物素检测系统：1、进行内源性生物素封闭，并成为常规。可采用蛋清或 卵白素作为封闭剂。2、或采用非生物素检测系统，如EnVision等。3、应坚持使用阴性对照。免疫组织化学在诊断中的应用(1)提高病理诊断准确性(2)对疾病的预后和治疗的意义(3)对肿瘤增生程度的评价 (4)微小病灶的发现微小癌，微小病灶 (5)指导肿瘤的治疗(6)恶性淋巴瘤及白血病的诊断及分型 恶性肿瘤的性质?提高诊断的准确性不明起源癌的免疫组织化学应用器官特异性标记物 甲状腺： 1.TG甲状腺球蛋白（在100% 滤泡和乳头状癌+） 2.TTF-1 3.CT 降钙素（在90% 髓样癌+） 前列腺: PSA微小癌的发现 有些活检（如支气管活检）显示人为挤压或烧灼（小细胞癌常见）：不能确认失常的细胞是否为癌细胞 若 CK 阳性的非正常上皮细胞存在于一定的部位（如间质）或以某种组织结构（如浸润性条索）存在则可诊断为癌 不需再次活检就可作出诊断骨髓微小癌转移灶乳腺：导管增生或导管原位癌? 导管增生与DCIS很难鉴别-这对病人的治疗非常关键 在芯针穿刺中更加困难 免疫组化方法： 高分子量 CK（如 34E12）在良性病变强阳性表达，但在 DCIS 通常阴性 ER 在良性病变中通常呈局灶性阳性表达，而在低度DCIS 呈弥漫强阳性表达，提示为克隆（肿瘤）性过程淋巴瘤分类重要标记物 T细胞淋巴瘤 CD3、CD45RO B 细胞淋巴瘤：CD20, CD79a 滤泡性淋巴瘤：bcl-2 间变性大细胞性淋巴瘤：CD30, ALK肿瘤的预后判断：预后因子 激素受体，如 ER/PR+ 在乳腺癌中提示良好预后 增殖标记物（Ki67）是某些类型肿瘤的预后因子 癌基因及抑癌基因产物，c-erbB2, Rb, p16, p21, p27, ALK1确定治疗的靶分子 乳腺癌：激素受体（ER, PR） 激素（如 Tamoxifen）用于乳腺癌治疗已有相当长的时间了 ER/PR阳性表达的肿瘤比阴性更敏感确定治疗的靶分子 STI-571（Gleevec, Imatinib），是酪胺酸激酶受体抑制剂，对胃肠间质瘤治疗有效 显然在进行治疗前须确证c-kit/CD117的阳性表达 肿瘤学家常要求病理学家对各种肉瘤进行 c-kit 染色，希望对阳性病例进行 STI-571 治疗免疫组化在肿瘤鉴别诊断中的价值 上皮源性肿瘤标志 间叶源性肿瘤标志 神经源性肿瘤标志 淋巴造血细胞肿瘤标志 上皮源性肿瘤标志 广谱上皮细胞标志 选择性上皮肿瘤标志 广谱上皮细胞标志：细胞角蛋白（CK） 上皮膜抗原（EMA） 上皮特异抗原（ESA） 癌胚抗原（CEA）上皮肿瘤相关抗原（CA199、CA242 、 CA153）谷胱甘肽S转移酶（GST）细胞角蛋白（CK）广谱CK可标记几乎所有类型的上皮细胞及其