色谱定量方法讲稿.ppt

色谱定量方法 马育松河北检验检疫局检验检疫技术中心 内容 定量分析基础定量方法影响定量分析结果准确性的因素色谱定量分析结果数据处理 定量分析基础 定量分析定义定量分析就是要确定样品中某一组分的准确含量 色谱定量分析是一种相对定量方法 是根据检测器的响应值与被测组分的量 在某些条件限定下成正比的关系来进行定量分析的 色谱定量分析的基本公式 Wi ci fiAi hi Wi 组分的质量 ci 组分的浓度 fi 组分的校正因子 Ai 组分的峰面积 hi 组分的峰高 想得到可靠的定量分析结果 需要准确测定fi Ai或hi 峰面积和峰高 峰面积 色谱峰与峰底 或基线 所围成的面积 峰高 色谱峰峰尖至峰底 或基线 的距离 峰底 从峰的起点与峰的终点之间的一条连接直线 基线 在正常操作条件下 仅有流动相通过检测器时所产生的响应信号曲线 一个完全分离的峰 峰底和基线是重合的 峰面积和峰高的测定 使用积分仪和色谱工作站测量峰面积和峰高仪器根据设定的积分参数 半峰宽 斜率 最小峰面积或峰高等 和基线的设定来计算每个色谱峰的峰面积和峰高使用记录仪记录色谱峰需要手工测量的方法计算色谱峰的峰面积和峰高 定量校正因子的测定 绝对校正因子前述公式中 fi为i组分的校正因子 其物理意义是单位峰面积 峰高 所代表的i组分的量 是一个与i组分的物理化学性质和检测器性质有关的常数 对同一个检测器 等量的不同物质其响应值是不同的 但对于同一种物质其响应值只与该物质的量 或浓度 有关 绝对校正因子 计算公式fi mi ci Ai hi mi ci i组分的质量 浓度 Ai hi i组分的峰面积 峰高 由上式计算出的校正因子称为绝对校正因子 它只适用于这一个检测器 相对校正因子 相对校正因子 f 是某物质 i 与基准物质 s 的绝对校正因子之比 计算公式f fi fs mi ci As hs ms cs Ai hi 常用的基准物质对不同检测器是不同的热导检测器 苯氢火焰离子化检测器 正庚烷 定量方法 色谱中常用的定量方法归一化法标准曲线法内标法标准加入法按测量参数分为峰面积法和峰高法 峰面积法和峰高法的选择 如何选用主要决定于在检测器的线性范围内 峰高和峰面积测量的准确性和重复性 在分离度较好 色谱峰形较好 峰面积可以准确测量时 特别是气相程序升温和液相梯度洗脱时 适宜用峰面积法定量 反之 如分离不好 峰形不佳时 用峰高法定量较好 保留时间短峰形较尖的色谱峰 峰高法比峰面积法更准确 保留时间长峰形较宽的色谱峰 峰面积法比峰高法更准确 归一化法 定义 把所有出峰的组分含量之和按100 计的定量方法 当样品中的所有组分均能流出色谱柱 并在检测器上都能产生信号的样品 可用归一化法定量 计算公式 归一化法 优点简便 准确 特别是进样量不容易准确控制时 进样量的变化对定量结果的影响很小 其它操作条件 如流速 柱温等变化对定量结果的影响也很小 缺点校正因子的测定较为麻烦主要用于GC的定量测定 标准曲线法 也称为外标法 是色谱定量分析中比较常用的方法 具体做法 1 配制不同浓度的标准系列 在规定的色谱条件下进样 测量色谱峰的峰面积或峰高 用峰面积或峰高对样品浓度绘制标准工作曲线 2 在与绘制标准工作曲线完全相同的色谱条件下进行样品的测定 测量色谱峰的峰面积或峰高 然后根据峰面积或峰高在工作曲线上查出样品组分的浓度 3 根据样品处理条件 计算原样品中组分的含量 标准曲线法 单点校正法 当待测组分含量变化不大 且已知这一组分的大概含量时 也可不必绘制标准工作曲线 而是选取和待测组分会含量相近的已知浓度的标准溶液 与待测样品溶液在相同色谱条件下分别进样 测量待测组分和标准样品的峰面积或峰高 由下式计算样品溶液中待测组分的含量 单点校正法实际上是利用原点作为标准曲线上的另一点 因此 当方法存在系统误差 标准工作曲线不通过原点 单点校正法的误差较大 标准曲线法 优点绘制好标准工作曲线后测定工作就很简单了 适合大量样品的分析 缺点1 每次样品分析的色谱条件很难完全相同 容易出现误差 2 绘制标准工作曲线一般使用待测组分的标准样品 对样品前处理过程中待测组分的变化无法进行补偿 内标法 内标法 选择适宜的物质作为欲测组分的参比物 定量加到样品中去 依据欲测组分和参比物在检测器上的响应值 峰面积或峰高 之比和参比物加入的量进行定量分析的方法 内标法与标准曲线法相比 有利于消除色谱条件不完全重现 进样量不准确等所带来的误差 内标法 内标法的关键是选择合适的内标物 内标物的选择条件 1 内标物应是原样品中不存在的纯物质 该物质的性质应尽可能与待测组分相近 不与被测样品起化学反应 同时要能完全溶于被测样品中 2 内标物的峰应尽可能接近待测组分的峰 或位于几个待测组分的峰中间 但必须与样品中所有峰不重叠 完全分开 3 内标物的加入量应与待测组分相近 内标法 内标标准曲线法 为使内标法适用于大量样品分析 可将内标法与标准曲线法结合 具体做法1 配制待测组分的一系列标准溶液 分别加入同样量的内标物 2 在相同色谱条件下分别测定加入内标的一系列标准溶液 3 以待测组分与内标物的响应值之比为纵坐标 标准溶液浓度为横坐标作图 绘制内标标准工作曲线 4 分析样品时 取和绘制内标标准工作曲线相同体积的样品和相同量的内标物 在相同的色谱条件下测定 5 得到样品溶液中待测组分和内标物的响应值之比 由此值在内标标准工作曲线上查出样品中待测组分的浓度 进而算出待测组分在样品中的含量 内标法 优点进样量变化 色谱条件的微小变化对内标法定量结果影响不大 在样品前处理前加入内标物 再进行样品前处理 可不分补偿待测组分在样品前处理时的损失 缺点选择适当的内标物很困难 使用内标物的操作比较麻烦 内标法定量比标准曲线法定量的准确度和精密度都要好 标准加入法 标准加入法 实际上是一种特殊的内标法 是在选择不到合适的内标物时 以待测组分的纯物质作为内标物 加入到待测样品中 然后在相同的色谱条件下 测定加入待测组分纯物质前后待测组分的峰面积 或峰高 从而计算待测组分在样品中的含量 标准加入法 优点1 不需要另外的标准物质作内标物 2 如在样品前处理前就加入已知准确量的待测组分 则可完全补偿待测组分在前处理过程中的损失 缺点要求两次测定的色谱条件 进样量完全相同 影响定量分析结果准确性的因素 样品制备1 干扰物质尽可能的分离出去 2 样品中的待测组分能否尽可能多的转入制备好的样品溶液中 3 样品制备和储存过程中防止损失和被玷污4 采用衍生化技术时 反应一定是定量的 影响定量分析结果准确性的因素 进样技术1 采用归一化法 内标法和标准加入法时 进样的误差可以被这些方法的本身的特性所消除 2 进样对标准曲线法定量分析的影响主要有以下两个因素 a 进样装置的准确性和精度b 分析人员对进样技术掌握的熟练程度 影响定量分析结果准确性的因素 色谱条件的选择1 在分离度良好的条件下 柱效的变化对峰面积定量没有影响 对峰高定量会产生影响 2 流动相流速变化对归一化法 内标法和标准加入法定量结果无影响 但对标准曲线法的定量结果有影响 而且其对峰面积定量结果的影响比对峰高影响大 因此 在流动相流速不易控制时 如采用标准曲线法定量 宜采用峰高法定量 3 气相色谱中 柱温会影响保留时间和峰高 且其对峰高的影响随分子量的增加而增大 但柱温对峰面积大小影响较小 所以在气相色谱中多采用峰面积定量 影响定量分析结果准确性的因素 检测器特性检测器工作的稳定性和线性范围将直接影响色谱定量分析结果的准确性和重复性 1 进样量不能使待测组分的响应值超出检测器的线性范围 选用的进样量最好能使检测器的响应值落到其线性范围的中间部分 此时误差最小 2 选择适当的检测器和检测器的工作参数 使定量分析结果由检测器引起的误差降到最低 色谱定量分析结果数据处理 误差和准确度误差 绝对误差和相对误差 是用来表示定量分析结果准确度的量度 即定量分析结果与真值的符合程度 评价定量分析结果准确度的常用方法1 利用标准样品 标准物质 来评价定量分析结果的准确度 2 利用测定回收率的方法来评价定量分析结果的准确度 色谱定量分析结果数据处理 偏差和精密度偏差是用来评价定量分析结果精密度的量度 是对同一样品的多次测定结果的重复性和再现性的评价 偏差的表示方法很多 包括平均偏差 相对偏差 标准偏差和相对标准偏差等 目前较多使用的是标准偏差和相对标准偏差 因为它对一组分析测定中的极值反应比较灵敏 能更好的表征多次测定结果的精密度 色谱定量分析结果数据处理 准确度和精密度的关系理想的定量分析结果应该是准确度和精密度都好的分析结果 定量分析结果的精密度高 偏差小 只能说明实验中的随机误差小 系统误差的大小只能通过准确度来衡量 准确度不好则是由于实验中存在较大的系统误差 色谱定量分析结果数据处理 标准工作曲线的绘制 线性回归在色谱定量分析中检测器的响应值与待测组分浓度应呈线性关系 如无误差存在 所有的点都应在一条直线上 实际上 由于随机误差不可避免 特别是误差较大 实验点较多时 要得到一条使所有实验点误差都最小的直线 最佳回归线 采用的方法是对数据进行回归分析 求出回归方程 再配线作图 当自变量为一个时称为一元回归 色谱定量分析中绘制标准工作曲线的过程就是一元线性回归方程的求解和配线过程 色谱定量分析结果数据处理 线性回归方程y ax bb称回归系数 是标准工作曲线的斜率 a是常数项 是回归直线的截距 此项应很小接近零 a值过大说明实验过程中有系统误差 回归直线就是在所有直线中使差方和 各数据点的误差的平方的加和 最小的那条直线 即回归直线的系数b和常数项a应使差方和达到极小值 此求回归直线的方法通常被称为最小二乘法 色谱定量分析结果数据处理 相关系数 用来表示线性关系的好坏程度相关系数越接近1 说明线性关系越好色谱定量分析绘制标准工作曲线时需要计算相关系数 只有当相关系数大于某个限定值 才能说明配出的回归直线是有意义的 绘制标准工作曲线时一般选取3 6个不同浓度的标准样品 相关系数起码应在0 95以上 如达不到要求 可能存在以下原因 1 所选浓度范围使检测器的响应值超