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肿瘤标志物及临床应用 肿瘤标志物TumorMarker是指由肿瘤细胞产生 反映肿瘤存在和生长的一类物质 在恶性肿瘤发生和增殖过程中 由肿瘤细胞的基因表达而合成分泌的或是由机体对肿瘤反应而异常产生和 或升高的物质 包括蛋白质 激素 酶 同工酶 及癌基因产物等 一 基本概念 肿瘤标记物的特点1 存在于肿瘤细胞的胞核 胞质和胞膜上或分泌在体液中 2 有些不存在于正常成人组织而见于胚胎组织 3 有些在肿瘤组织中的含量超过正常组织的含量 肿瘤标志物的存在或含量的变化可以提示肿瘤的性质并有助于了解肿瘤的组织起源和细胞分化 从而可以帮助肿瘤的病理诊断 组织学分类 判断预后及指导临床治疗 早在1845年 英国的Maclntire首先发现了肿瘤标志物 并于1847年由BenceJones称之为 白蛋白样物质 Albumin likesubstance 1889年 Kahler将其分类为 复合骨髓瘤 的一种分解产物 1929年 Hirszfeld报道在肿瘤组织中发现了胚胎性特殊物质 1943年 Gross论证了关于肿瘤组织的抗原性 1952年 Bjorklund将56种肿瘤组织的提取液混合后注入马体内 产生了抗血清 从而进一步发现了肿瘤组织比正常组织具有更强的抗原性 1957年 他将这些最初广泛应用的肿瘤标志物定义为组织多肽抗原 二 肿瘤标志物的发展简史 Ziler 1958年 在胎儿组织中发现了甲胎蛋白 AFP Goldt和Freedman 1965年 从结肠癌的提取液中发现了癌胚抗原 CEA 1975年 Kohler和Milstein用细胞融合法成功地制备了单克隆抗体 这就为研究肿瘤标志物提供了更有意义的手段 80年代以后 用于肿瘤细胞抗原分析的单克隆抗体 Mab 大量涌现 高敏感的免疫组化技术 IH 应运而生 生物化学 免疫学及分子生物学等方法的建立加速了肿瘤标志物研究的发展 三 肿瘤标志物检测的意义 1 确定肿瘤的组织发生2 异位肿瘤和转移性肿瘤的鉴别3 辅助识别肿瘤的良恶性 癌前病变与癌4 对肿瘤细胞增生程度的评价5 辅助肿瘤分期 在判断肿瘤是原位还是有浸润发生以及有无血管 淋巴管的侵袭是与肿瘤分期密切相关的 例如用层粘连蛋白 laminin 和 型胶原的单克隆抗体可清楚显示基底膜的主要成分 一旦证实癌细胞突破了基底膜 就不是原位癌 而是浸润癌了 其预后意义是不同的 1 肿瘤免疫组织化学标记阳性标记色度特征肿瘤免疫组织化学标记着色程度取决于抗原含量 分布密度和标记方法及其敏感性 淡黄色 提示为弱抗原 棕黄色 提示为中等度抗原 棕黑色 提示为强抗原 四 检测方法 胞膜型胞核型胞质型微绒毛型抗原颗粒主要分布于腺癌细胞的微绒毛 复合型在常规免疫组化标记中 同一种抗原可以同时表达于胞膜和胞质 胞核和胞质 微绒毛和胞质 但很少发现胞膜和胞核同时表达 免疫组化结果的判断原则 必须设染色对照 抗原表达必须在特定部位不在抗原所在部位的阳性表达一概不能视为阳性 阴性结果不能视为抗原不表达 对免疫组化标记结果的意义不能绝对化 假阴性结果的原因主要是 抗体已失活或浓度不当或抗体本身达不到应有的敏感度 由于组织自溶 抗原扩散而导致抗原消失 特别在长期固定的标本中因抗原漏出而致假阴性 因此多用新鲜固定之标本 操作步骤不当 如反应时间不够或过久 洗脱不够或温度过高 组织或细胞中抗原的含量过低 所用方法难以检测到 如用直接法检测为阴性 但改用间接法时则为阳性 假阳性结果的主要原因是 所用的抗体与其他无关的抗原有交叉反应 特异性差 特别在应用多克隆抗血清时更易出现 所用的抗体浓度过高或染色过程中切片干燥导致抗体与组织产生非特异性结合 组织或细胞中有内源性过氧化物酶 碱性磷酸酶及生物素等产生非特异性显色 组织中含有残存的正常组织 如软组织肿瘤浸润至骨骼肌或神经组织 当用抗myoglobin抗体或抗S 100蛋白抗体时 易误诊为横纹肌肉瘤或来源于神经的肿瘤 由于肿瘤侵犯正常组织与细胞 导致其胞质内可溶性蛋白质释放于组织间隙中 并为肿瘤细胞非特异性吸收或吞噬 2 PAP法和APAAP法过氧化物酶 抗过氧化物酶法 PAP 和碱性磷酸酶 抗碱性磷酸酶法 APAAP 的原理是 应用抗酶抗体与酶结合 形成可溶性的 稳定的酶 抗酶抗体复合物 3 ABC法将亲合素 A 与生物素 B 标记的过氧化物酶结合 形成可溶性的亲合素 生物素化酶复合物 avidin biotin peroxidasecomplex ABC 当其与生物素标记的抗体 直接法 或抗抗体 间接法 作用时 ABC中亲合素尚未饱和的位点可与抗体分子上标记的生物素结合 从而形成一个多级放大体系 有效提高了酶反应的敏感性 4 分子生物学方法PCRPAGE 五 有关肿瘤标志物 角蛋白来源及分布角蛋白 keratin 属中间丝细胞骨架蛋白 是存在于上皮细胞内 分子量为40 70kD的一组蛋白质 主要用途角蛋白是上皮细胞及其肿瘤的最佳标记物之一 综合肿瘤组织形态学 可用于癌与其他恶性肿瘤如未分化癌与淋巴瘤 上皮性肿瘤与恶性黑色素瘤 胸腺瘤与胸腺淋巴瘤及转移肿瘤等的鉴别 一 上皮组织及其标记物 上皮膜抗原来源及分布上皮膜抗原 epithelialmembraneantigen EMA 是上皮细胞分泌的一种人乳中脂肪球膜上提纯的一种糖蛋白 它广泛存在于各种上皮细胞膜系结构 其分布与细胞角蛋白极为相似 但对内脏腺上皮优于细胞角蛋白 上皮膜抗原广泛存在于正常上皮细胞及其肿瘤组织中 也存在于间皮细胞 浆细胞 组织细胞和T细胞淋巴瘤中 尤其是分化较差的癌上皮膜抗原有时可呈强阳性表达 主要用途EMA可作为上皮源性肿瘤的常用标记物 EMA阳性表达的肿瘤有鳞状细胞癌 胃肠道腺癌 乳腺癌 前列腺癌 卵巢癌 间皮瘤 滑膜肉瘤 甲状腺乳头状腺癌 上皮样肉瘤等 甲胎蛋白 alpha fetoprotein AFP 来源甲胎蛋白是由胚胎卵黄囊细胞 胚胎肝细胞和胎儿肠道细胞所合成的一种糖蛋白 分子量为69kD 在妊娠5个月时达高峰 出生时下降 胎儿出生后1年 血清AFP应降至正常成人水平 正常成人血清中的含量极低 为5 8 g L以下 男性略高于女性 恶性肿瘤的成人 妊娠第2 3个月或患有肝硬化 肝坏死患者血清中AFP水平可升高 AFP是原发性肝癌的最灵敏 最特异的肿瘤标志 血清AFP测定结果大于500 g L以上 或含量有不断增高者 更应高度警惕 主要用途AFP主要用于原发性肝细胞癌和性腺或性腺外某些生殖细胞肿瘤 如内胚窦瘤 的诊断和鉴别诊断 值得注意的是AFP在肝癌组织中的阳性表达只占60 左右 部分病例则为阴性 而一些非肿瘤性肝病变 如肝硬化和肝炎 肝细胞以及肝转移性肿瘤的癌旁肝细胞亦有AFP表达 后者AFP的来源有三种可能性 一是癌旁肝细胞自己合成 二是癌旁肝细胞从癌灶内吸收AFP 三是上述两种情况都有 应用中的注意事项AFP阴性不能排除肝细胞癌的诊断 应进一步作丙氨酸转氨酶 alannineaminotransferase ATT 免疫组化或结合血清学检查结果加以判断 发生在骶尾部 腹膜后 纵隔或松果体的一些生殖细胞肿瘤 在常规HE染色中常常诊断为未分化癌 因此有必要作AFP或人绒毛膜促性腺激素 humanchorionicgonatotropin HCG 免疫组化染色 以排除其他类型的肿瘤 一些非肝性肿瘤如肺癌 乳腺癌和胃肠癌 尤其是胃肝样腺癌 AFP可呈阳性反应 AFU L岩藻糖苷酶 L fucosidase AFU 是一种溶酶体酸性水解酶 是原发性肝癌的一种新的诊断标志物 广泛分布于人体组织细胞 血液和体液中 参与体内糖蛋白 糖脂和寡糖的代谢 原发性肝癌患者血清AFU活力显著高于其它各类疾患 包括良 恶性肿瘤 癌胚蛋白 carcinoembryonicantigen CEA 来源及分布癌胚蛋白是从结肠癌中分离出来的一组酸性糖蛋白 由胆管上皮细胞合成 该蛋白在胚胎期含量较高 而成人则含量较低 小于2 5 g L CEA在正常组织中的表达包括有结肠 胃 小肠和胆囊的上皮细胞 免疫组化染色阳性表达部位均位于表面上皮细胞的刷状缘 呈线状分布 内外分泌腺的腺泡细胞和导管上皮细胞及其分泌物均见有CEA表达 而皮脂腺 皮肤鳞状上皮细胞和宫颈 食管及鼻咽粘膜的鳞状上皮细胞不含CEA CEA偶见于良性上皮性肿瘤及癌前病变组织中 而在许多癌组织中则有大量表达 如胃肠道及胰腺癌 肺癌及甲状腺髓样癌 主要用途CEA与EMA一样均可作为上皮性肿瘤的重要标记 尤其是它不受肿瘤分化程度的影响 即使是低分化腺癌亦可呈阳性反应 这一点与CK不同 因此在转移癌的鉴别诊断上可与EMA CK联合使用 以提高诊断正确率 由于CEA是一种分泌性抗原 该抗原可由肿瘤细胞分泌于血液中 可以在血清中测得其抗原水平 故临床可用于 胃肠道癌的粗筛普查 术前术后的CEA水平动态观察 及时发现癌肿的复发与转移 应用时的注意事项 CEA阳性不能作为确认肿瘤的组织来源标记 CEA不能用作良 恶性上皮性肿瘤的鉴别诊断 不论是单克隆还是多克隆抗CEA抗体 在某些肿瘤组织中可表现有非特异性染色 应注意鉴别 当CEA高于20 g L时 则意味着可能有消化道肿瘤 肿瘤抗原 carcinomicantigen CA 也可以写作cancerantigen 是肿瘤细胞膜的结构成分 各不相同 为糖蛋白或糖脂 也叫糖类抗原 carbohydrateantigen CA 这类抗原是用单克隆抗体技术从肿瘤细胞系 株 中鉴定出来的 所以在特定肿瘤的诊断方面具有较高的准确性 CA242CA242是一种唾液酸化的黏蛋白类型的糖抗原 其单克隆抗体是Lindholm等于1985年通过杂交瘤技术用人结肠癌细胞株COLO205免疫鼠而得 免疫组化研究发现CA242在恶性组织如胰腺癌和结肠癌中有明显表达 而在其他器官的腺癌中亦有轻度表达 CEA与糖类抗原242 CA242 联合应用目前被认为是对结肠癌的最佳标志搭配 CA15 3 CA15 3是1984年Hilkens等从人乳脂肪球膜上糖蛋白MAM 6制成的小鼠单克隆抗体 115 DB 1984年Kufu等自肝转移乳腺癌细胞膜制成单克隆抗体 DF 3 故命名CA15 3 由分泌性上皮细胞 如乳腺 肺 胃肠道 子宫的 分泌 正常人排泄物中也可检出 此抗原虽然没有器官和肿瘤特异性 在乳腺癌 肺癌 前列腺癌 卵巢癌和胃肠道癌中指标均有升高 大于30U ml 但可作为监测乳腺癌患者术后复发的最佳指标 在其它乳腺疾病和部分孕妇 约8 中CA15 3也有升高 CA19 9 CA19 9是1979年Koprowski等用结肠癌细胞免疫小鼠 并于骨髓瘤杂交所得116NS19 9单克隆抗体 CA19 9是一种糖脂 正常人血清中小于37U ml 85 95 的胰腺癌患者该项指标较高 手术切除肿瘤后 CA19 9浓度会下降 如再上升 则可表示复发 结直肠癌 胆囊癌 胆管癌 肝癌和胃癌的阳性率也会很高 若同时检测CEA和AFP可进一步提高阳性检测率 CA125 CA125是1983年Bast等从上皮性卵巢癌监测出可被单克隆抗体OC125结合的一种糖蛋白 CA125是上皮性卵巢癌和子宫内膜癌的标志物 正常人血清中小于35U ml 胰腺癌 肝癌 乳腺癌和子宫内膜炎 急性胰腺炎 腹膜炎 肝炎 肝硬化腹水也可使CA 125升高 CA 125升高还与肿瘤复发有关 CA50 CA50是1983年Lindholm等从抗人结肠癌 直肠癌Colo 205细胞株的一系列单克隆抗体中筛选出一株对结肠癌 直肠癌有强烈反应 但不与骨髓溜细胞及血淋巴细胞反映的单克隆抗体所能识别的抗原 CA50存在于细胞膜内 抗原决定簇为唾液酸Lea血型物质与唾液酸 N 四氧神经酰胺 正常人血清浓度小于20U ml 一般认为 CA50是胰腺癌和结肠癌 直肠癌的标志物 CA50广泛存在于胰腺 胆囊 肝 胃 结直肠 膀胱 子宫 当细胞恶变时由于糖基转化酶的失活或胚胎期才活跃的某些转化酶被激活 造成细胞表面糖类结构性质改变而形成CA50 因此 它是一种普遍的肿瘤标志相关抗原 在多种恶性肿瘤可检出不同的阳性率 组织多肽抗原 tissuepolypeptideantigen TPA 为人成熟角化上皮细胞所合成的一种非纤维丝状蛋白质 该抗原于胚胎期产生 与CEA AFP同属胚胎蛋白 但它们之间无交叉反应 成人常见于增生活跃的上皮细胞 免疫组化研究表明 多数上皮及其肿瘤为阳性 而非上皮组织为阴性反应 TPA在基底细胞中无表达 但可见于棘细胞中 因此TPA成为鳞状上皮细胞的标记物 前列腺特异性抗原 prostatespecificantigen PSA 来源及分布前列腺特异性抗原是一种由前列腺组织中提出的 分子量为33kD的蛋白质 它存在于正常 增生和肿瘤性前列腺上皮细胞中 PSA免疫组化染色阳性分布在正常前列腺腺泡和导管上皮细胞胞质及腔内分泌物中 但不同病例或同一切片上的不同区域在分布和表达强度上有所不同 良性前列腺增生有较强的PSA表达 但前列腺组织中的鳞状上皮化生和尿道周围腺体 输精管 精囊 膀胱移行上皮细胞均不表达PSA 主要用途PSA是前列腺及其肿瘤的特异性标记 特别对转移性前列腺癌的诊断有重要意义 由于PSA有较好的组织特异性 因此在男性病例的恶性肿瘤鉴别诊断中 尤其是骨髓和淋巴结转移癌的鉴别诊断中 在形态学上难以作出原发病的诊断时 作PSA免疫组化染色是十分必要的 以证实或排除前列腺癌转移 应用中的注意事项PSA不能作为良 恶性前列腺病变的诊断标记 少数前列腺癌PSA阴性 因此多与前列腺酸性磷酸酶 PAP 同时检测 可提高诊断准确率 前列腺酸性磷酸酶 prostateacidphosphatase PAP 前列腺酸性磷酸酶为酸性磷酸酶中的一种同工酶 是前列腺分泌的正常成分 具有水解酶的功能 在正常和增生的前列腺组织中 只有前列腺上皮和导管上皮细胞及其腔内分泌物呈PAP阳性表达 而尿道周围腺上皮 输卵管和输精管上皮细胞均为阴性 原发性和转移性前列腺癌均有较强的PAP阳性表达 但部分膀胱癌及有些部位的类癌中也有表达 PAP与PSA一样不能作为良 恶性前列腺病变的鉴别诊断 虽然PAP是一种前列腺特异性酶 但一些非前列腺组织亦可有阳性表达 因此最好与PSA同时应用 以提高诊断准确率 正常和增生的前列腺组织PAP阳性表达有时强于前列腺癌 甚至少数前列腺癌可以不表达PAP BCA 225全名为乳腺癌相关糖蛋白 breastcarcinomaassociatedglycoprotein BCA 225 为乳腺癌组织中分离出的分子量为225kD的糖蛋白 该蛋白与小鼠乳腺肿瘤病毒外壳糖蛋白gp52有交叉反应 绝大多数人乳腺癌组织中BCA 225阳性 此外 肺癌及宫颈癌中也有表达 二 间叶组织及其肿瘤标志物间叶组织系指中胚叶来源的组织 包括纤维 脂肪 骨 软骨及肌肉组织等 波形蛋白来源及分布波形蛋白 vimentin 为一种中间丝蛋白 最初从鸡胚纤维母细胞中发现 是一种分子量52 58kD的胞质蛋白 主要存在于间叶细胞 如血管内皮细胞 纤维母细胞 血管平滑肌细胞 软骨细胞 许旺细胞及胶质细胞之中 用免疫荧光法染色 vimentin结构似波纹状 故称之为波形蛋白 主要用途vimentin是正常间叶细胞及其肿瘤的特异性标志 常作为间叶组织肿瘤的标记物 广泛用于免疫病理诊断和科研工作中 胶质纤维酸性蛋白来源及分布胶质纤维酸性蛋白 glialfibrillaryacidicprotein GFAP 是从人脑胶质细胞中分离获得 它是一种分子量40 52kD的酸性蛋白 含有丰富的天门冬氨酸和谷氨酸 主要用途GFAP可作为星形胶质细胞及其肿瘤的标志物 三 神经和神经内分泌细胞及其肿瘤的标记物 S 100蛋白来源及分布S 100蛋白是从牛脑中提取的一种可溶性酸性蛋白 分子量20 25kD 因其能溶于100 的硫酸铵溶液而得名 它存在于人体内多种细胞如胶质细胞 如星形细胞 少突胶质细胞 室管膜细胞 但不存在于小胶质细胞 许旺细胞 脉络丛上皮细胞 脑膜上皮细胞 黑色素细胞 软骨细胞 脂肪细胞 肌上皮细胞以及眼视网膜细胞 腺垂体前叶与后叶细胞 肾上腺髓质嗜铬细胞 表皮郎格罕细胞 汗腺导管及腺泡上皮 淋巴结内指突状网织细胞 胎盘滋养叶细胞和上述细胞来源的肿瘤细胞之中 主要用途尽管S 100蛋白分布十分广泛 但在病理诊断上S 100蛋白还是被看作神经胚叶肿瘤的一种很有用的抗原 四 淋巴造血组织及其肿瘤标志物免疫球蛋白免疫球蛋白 immunoglobulins Ig 主要用来区分B淋巴细胞的反应性增生和肿瘤 前者常为 及 链多克隆表达 后者则为单克隆表达 铜蓝蛋白 Cerulopasmin CP CP是血清中一种含铜的具有氧化酶活性的2糖蛋白 分子量151000 目前认为肝脏是合成CP唯一的器官 作为一个与急性期有关蛋白 在许多病理情况下可升高 但许多学者认为血中CP增高是恶性肿瘤的共性 增高的原因可能是癌肿病人体内多胺含量增多 而CP能够氧化多胺 血清CP增高可能是对多胺水平增加的一种反应 或是与肝脏合成CP增加及分解代谢降低有关 正常值 392 72 g L 绒毛膜促性腺激素 humanchorionicgonadotropin HCG 是一种糖蛋白激素 由胎盘及其肿瘤或含有滋养叶细胞成分的生殖细胞肿瘤 如非妊娠性绒癌 胚胎性癌等 产生 由非滋养细胞肿瘤分泌的HCG称为异位HCG 目前发现几乎所有组织 尤其是肿瘤包括肺癌 乳腺癌 子宫颈癌和卵巢癌等均可产生异位HCG 五 其他 分泌异位HCG的肿瘤患者对化疗的敏感性降低 肿瘤容易复发 多数学者认为 肿瘤细胞产生HCG起源于多潜能的干细胞 非滋养细胞肿瘤分泌HCG 可看作是一种早期胚胎基因表达 是一种返祖现象 HCG基因未被完全抑制 乳酸脱氢酶 lactatedehydrogenase LDH LDH总活性在肿瘤患者血清中升高 但许多疾病如心肌梗塞 感染和恶性贫血均可见LDH升高 而在恶性淋巴瘤 白血病 卵巢癌患者血清中异常增高 经治疗病情好转时LDH下降 复发时又上升 LDH有5种同功酶 在恶性肿瘤时LDH4和LDH5增高 而LDH1和LDH2相对减少 原发性肝癌时LDH5 LDH4 而继发性肝癌时则LDH4 LDH5 六 肿瘤标志物变化的解释1 浓度下降到正常水平 提示肿瘤全部除去或病情缓解2 浓度明显下降但仍持续在正常水平以上 或短期下降到正常水平后又重新提高 提示有肿瘤残留和 或 肿瘤转移3 浓度下降到正常水平一段时间 数月 后 重新增加 提示复发或转移4 如化疗 放疗或手术后立即测定肿瘤标志物浓度 可能会有短暂的升高 这是由于肿瘤坏死所