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慢病毒的应用 主要内容 慢病毒的原理慢病毒的特点慢病毒的应用慢病毒载体的构建稳定细胞株的建立 实验流程 慢病毒的原理 慢病毒属于逆转录病毒科 为RNA病毒 慢病毒 Lentivirus 载体是以HIV 1 人类免疫缺陷I型病毒 为基础发展起来的基因治疗载体 慢病毒载体的改造 去除了vif vpr vpu nef等致病基因 将编码病毒衣壳和包膜结构的基因分别克隆于另外两个质粒中 通过三个质粒共同转染包装细胞产生完整的病毒颗粒 慢病毒载体系统 转移质粒 包含我们感兴趣的外源基因 同时还保留了病毒的LTR区和其他对病毒的整合复制起重要作用的元件 辅助质粒 整合进入包装细胞后表达蛋白多聚体gag 编码病毒的衣壳蛋白及病毒的其他模序结构 同时表达蛋白pol pol蛋白具有逆转录酶及整合酶的活性 负责对病毒载体基因的结构元件进行切割 促使载体基因整合入宿主细胞基因组中 包膜表达质粒 用口腔炎疱疹病毒的包膜蛋白基因 VSV G 取代了HIV 1型病毒的env基因 由于VSV G受体广泛存在于多种细胞表面 使慢病毒载体的宿主细胞倾向性大大增加 Lentivirusvector WTHIV I Lentivirusvectorsystem 慢病毒的特点 1 慢病毒载体既可以感染处于有丝分裂活跃期的细胞 又可以感染分裂缓慢及处于分裂终末期的细胞 包括造血干细胞 神经干细胞 处于分化终末的神经元 肝实质细胞等 2 由慢病毒载体携带整合入宿主基因组的目的基因对转录沉默作用有较强的抵抗能力 在体外培养细胞实验和体内移植实验中 由慢病毒载体携带导入的目的基因可以在宿主细胞中得到长期而稳定的表达 3 慢病毒载体可以兼容多个转录启动子 包括细胞特异性启动子和在基因组中普遍存在的管家基因的启动子 4 经过改建后的慢病毒载体可以容纳约10kb左右的外源基因 因此大多数的cDNA都能被克隆入慢病毒载体 几种病毒载体的比较 慢病毒的应用 用于Promoter调控研究 可以将适合大小的promoter克隆于luciferase上游 通过检测细胞中luciferase的表达研究基因的表达调控用于基因过表达研究 可以将特定基因克隆于不同的promoter下 实现长时间基因表达或组织特异性的基因表达用于RNA干扰研究 可以使用慢病毒载体构建表达shRNA或miRNA的载体 慢病毒载体的构建 启动子的选择 CMVEF1UbC筛选标记的选择 荧光蛋白 GFP RFP抗药性 blasticidin puromycin hygromycin 三类慢病毒载体 1 基因表达plenti MCS PGK GFPplenti MCS IRES GFP PGK blastplenti MCS SV40 GFP2 shRNACMV GFP U6 shRNAU6 shRNA CPT PGK GFP CPT3 miRNAplenti CMV GFP miRNAplenti CMV RFP miRNA 稳定细胞株的建立 实验流程 第一天 铺包装细胞第二天 慢病毒载体系统三种质粒共同转染包装细胞第三天 铺靶细胞第四天 收集病毒感染靶细胞 第五天 第二次收集病毒感染靶细胞第六天以后 开始筛选稳定细胞株 转染 293LTCellLineDMEM 10 FBS 转染 ConditionAmountTissuecultureplatesize10cm oneperlentiviralconstruct Numberof293LTcellstotransfect6x106cellsAmountofPackagingMix 3vectors 9 g 9 lof1 g lstock AmountofpLentiexpressionplasmid3 g ConditionAmountTissuecultureplatesizeT75Numberof293FTcellstotransfect6x106cellsAmountofpLentiexpressionplasmid10ugpVSVG 5ugdelta8 91 7 5ug 转染 磷酸钙Lipofectamine 2000FuGENE 磷酸钙法 Dish 3 5cmddw 105ulplasmid 2ug 如0 5ug ul 即用4ul 2MCaCl2 16 5ul2XHBS 125ul按上述顺序 往eppendorf管中依次加入上述四种试剂 先将前三者混匀 最后加2XHBS 一种方法是 加2XHBS时要逐滴加入 吹打至微现乳白色 立即均匀滴入培养皿 轻轻摇匀后置于培养箱中 6 8h后换液 另一种方法是 加入2XHBS后立即吹打约40下 FuGENE 做脂转complex OptiMEM需在37度水浴中预热 Fugene转染试剂需恢复至室温方可使用 使用前需摇匀 转染每瓶T75的complex成分如下 含cDNA的lv质粒 10ugpVSVG 5ugdelta8 91 7 5ugoptiMEM补足至1mL后 用1mL枪混匀 正常吹打5 6次 加入56ulFugene转染试剂 加至optiMEM液面之下 吹打3 4次 再用1mL枪混匀 正常吹打5 6次 室温放置15min 即可加入T75瓶中 晃匀后 隔2 4h后再晃匀一次即可 收集病毒 转染后12 24h 将培养基弃去 加入10 FBS DMEM 即开始收集病毒 收集48 72h病毒上清 收集后置于4度冰箱保存 测病毒滴度 此时即可用病毒上清测病毒滴度 悬浮感染 在24孔板中测定病毒滴度 先用明胶包被24孔板10min以上 消化293LT细胞 24孔板每孔15万细胞 可将细胞做mix 体积扩大到15万细胞 500ul 加入1 1000polybrene 混匀 每孔加入500ul15万细胞即可 将病毒上清4000rpm离心5min 将细胞碎片离至管底 取5ul病毒上清至上述步骤中传入15万每孔的24孔板一孔中 摇匀 48h后即可在荧光显微镜下观察其滴度 病毒滴度确定 15万293LT细胞48h即可刚好长至90 100 满 此时即可固定细胞 计数确定病毒滴度DAPI染色病毒滴度 IU mL 荧光细胞占总细胞数的百分比 5 1 5 104 103 感染 病毒在感染目的细胞前用0 45um滤膜过滤polybrene 使其终浓度为10ug mL 安全 停