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文档简介

葡聚糖凝胶层析 实验目的 实验目的 1 掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理 2 学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术 葡聚糖凝胶层析原理 凝胶过滤层析也称分子筛层析 排阻层析 是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用 根据被分离物质的分子大小不同来进行分离 凝胶层析 反筛效应 大分子在前 小分子在后 凝胶类型 葡聚糖凝胶 Sephadex 和琼脂糖凝胶 Sepharose 葡聚糖凝胶 直链的葡聚糖分子和交联剂3 氯1 2 环氧丙烷交联而成 葡聚糖凝胶G 25作为固定相载体 来分离蓝色葡聚糖 2000和溴酚蓝 蓝色葡聚糖 2000分子量接近2 106 而溴酚蓝分子量为670 二者分子量相差较大 前者完全排阻 而后者则可完全进入凝胶颗粒网孔内 二者通过层析柱的时间不同而分开 实验材料 1 实验器材 层析柱 1 20cm 附有一小段乳胶管及螺旋夹 洗脱液瓶 带下口的三角瓶 250m1 试管及试管架 量筒10m1 721型分光光度计2 实验试剂Tris 醋酸缓冲液 pH7 0 溴酚蓝与葡聚糖 2000混合样品 葡聚糖凝胶G 25 Sephadex G 25 实验操作 1 实验凝胶的处理 用洗脱液把杂质漂洗干净 2 装柱 A 将层析柱洗净 垂直固定在铁支架上 选择有薄膜端作为层析柱下口 将下口接上乳胶管并用螺旋夹夹紧 B 层析柱中加入洗脱液 打开下口螺旋夹 让溶液流出 排除残留气泡 最后保留约2厘米高度的洗脱液 拧紧螺旋夹 C 将凝胶轻轻搅动均匀 用玻璃棒沿层析柱内壁缓缓注入柱中 待凝胶沉积到柱床下已超过l厘米时 打开下口螺旋夹 继续装柱至柱床高度达到12厘米 关闭出口 再用洗脱液平衡l至2个柱床体积 凝胶面上始终保持有一定的洗脱液 平衡后 拧紧下端螺旋夹 注意事项 装柱过程中严禁产生气泡 尽可能一次装完 避免出现分层 3 加样品 打开螺旋夹使柱面上的洗脱液流出 直至床面与液面刚好平齐为止 关闭下端出口 取溴酚蓝及蓝色葡聚糖 2000混合液0 3毫升 小心地加于凝胶表面上 切勿搅动层析柱床表面 打开下端出口 使样品溶液进入凝胶内 并开始收集流出液 当样品溶液恰好流至与凝胶表面平齐时 关闭下端出口 用少量洗脱液清洗层析柱加样区 共洗涤三次 每次清洗液应完全进入凝胶柱内后 再进行下一次洗涤 最后在凝胶表面上加入洗脱液 保持高度为3 4cm 4 洗脱与收集 连接好凝胶柱层析系统 调节洗脱液流速为每分钟1毫升 进行洗脱 仔细观察样品在层析柱内的分离现象 收集洗脱液 每收集3毫升即换一支收集管 试管预先编号 收集约20管左右 样品即可完全被洗脱下来 将各收集管中的洗脱液分别用721型分光光度计在波长540nm处测定其光密度 5 凝胶回收处理方法 将样品完全洗脱下来后 继续用三倍柱床体积的洗脱液冲洗凝胶后 将柱下口放在小烧杯中 慢慢打开 再将上口慢慢松开
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