法医dna提取方法

法医DNA提取方法 一 血液DNA的提取 Chelex 100法酚 氯仿 异戊醇法盐析法磁珠法硅珠法FTA技术 Chelex 100法 原理 Chelex是一种以亚氨二乙酸为吸附因子的苯乙烯与二乙基苯的共聚物 对多价金属离子有螯合作用 可防止DNA在煮沸加热前被降解 同时在高温低离子强度下还有催化DNA释放的作用 这样既可减少DNA的损失 又可削除扩增中的一些抑制因素 Chelex 100法 优点 快速 方便 且仅在一个管内进行 减少污染缺点 DNA提取的浓度小 对检材条件要求较高 对被泥土 石灰粉 染料污染的检材效果不佳 常导致扩增效率下降或失败 Chelex 100法 所取全血与DNA含量之间的关系 全血 ul 理论DNA产量 ug 10 04 0 06100 2 0 41002 42004 64008 10 Chelex 100法 注意事项 A 核膜和其它试剂一起保留下来了 DNA纯度比有机溶剂提取法低 B chelex 100法将DNA双螺旋打开 不能用像EB染料插入方法进行定量 只能用杂交方法定量 C 由于沸水浴8min和快速振荡使DNA片段受到损害而断裂 对于大于500bp的片段扩增成功率低 D chelex 100在配置数小时后螯合能力就有下降趋势 将会导致提取的DNA溶液中有各种金属离子或抑制剂 对PCR反应可能有影响 酚 氯仿 异戊醇法 原理 通过酚 氯仿混合物萃取DNA溶液中的蛋白质类有机物质 而保留DNA于水相溶液中 优点 适用所有生物检材 提取DNA分子结构完整 特别适合RFLP 测序等需要大分子DNA分析技术 酚 氯仿 异戊醇法 缺点 操作步骤复杂 需要多次更换离心管 容易交叉污染 注意事项 a 操作中注意避免交叉污染 b DNA得率较低 不适合微量DNA检材 c 操作的误差所可能残留的成分可能抑制PCR反应 各种成分对PCR的抑制作用如下 几种盐类对PCR的抑制浓度 盐析法 原理 利用6M的NaCl或醋酸钠沉淀蛋白质代替有机酚 氯仿抽提步骤去除蛋白质 其他过程同有机溶剂提取法 优点 操作简单 步骤少 不使用有毒害的化学试剂酚和氯仿缺点 得到的DNA盐浓度较高 对下游的PCR反应影响较大 磁珠法 原理 利用磁性硅胶吸附白细胞 用细胞裂解液裂解细胞 从细胞中游离出来的DNA分子被吸附到磁性颗粒表面 蛋白质等分子不被吸附而留在溶液中 在磁场作用下 磁性颗粒与液体分开 回收颗粒 再用纯水或TE洗脱吸附的DNA 磁珠法 优点 不需要离心 操作简单 在同一个反应管内提取 没有样品的损失 更适合于自动化提取 与chelex 100提取法相比 磁珠法回收率高 即使是0 5 l血仍能得到DNA分型而用chelex 100提取同样量的血DNA有时不能得到分型 硅珠法 原理 在高浓度的硫氰酸胍的存在下 DNA被二氧化硅特异性的吸附 被吸附的DNA在没有硫氰酸胍存在下 DNA又从二氧化硅释放出来 硫氰酸胍是高性能的蛋白变性剂 可以使蛋白质与DNA分离 在硅珠吸附前高速离心可以将变性的蛋白质等不溶物除去 吸附后的漂洗可将溶液中的PCR抑制物除去 硅珠法 优点 提取的DNA比较纯 回收率高 可以从0 5 l的血液中提取到足以进行PCR反应的DNA FTA技术 FTA技术的核心是一种专利化合物 FTA卡片预先被此种化合物浸透 当血液与FTA卡接触后 细胞膜被裂解 蛋白质发生变性 DNA分子则被捕获并与载体牢固结合 而且FTA卡片上的DNA可在室温下长时间稳定保存 FTA卡可保护其上的DNA免受核酸酶 氧化作用 紫外线 细菌和真菌的影响 生物检材中可能存在的病原体与FTA卡接触后也将失活 保存的DNA可以方便快捷的进行纯化和洗脱 FTA技术 注意事项 直接使用固定在FTA载体上的全血DNA进行STR复合扩增 可以得到稳定的分型结果 但是相比用洗脱下来的DNA溶液 分型图谱不是很理想 同颜色各基因座的峰均衡性不算很好 峰高差异比较大 基线不够平 二 血痕DNA提取 chelex 100法酚 氯仿法碱裂解法改良方法采用磁珠法手工批量提取PCR模板DNA 苏勇 江苏省公安厅物证鉴定中心 Chelex 100法 注意事项 对于大量血痕 如血纱布 剪取约1 1cm2大小 不可过多 否则会抑制PCR反应 如果血痕属微量血痕 可直接用进样器吸取20 40ul灭菌去离子水 然后在血痕处反复吹打 将血痕尽可能的洗下来并装入离心管中 2 对部分陈旧 或污染有多量泥沙 载体吸附力强或色素深的血痕检材 经一次chelex 100的处理 仍不能扩增成功 这可能是由于以下几个原因 血痕过于陈旧 血色素无法溶解下来 使血色素对扩增的抑制增强 导致扩增失败 血痕受泥沙或载体色素的影响 使扩增受到抑制 血痕载体吸附力强 导致DNA提取率降低 血痕量太少 超出检验灵敏度 针对以上几种影响因素 进行一些改良处理 对难于溶解的陈旧血痕 可加入1 10体积的10 SDS 促进血色素的溶解 易于洗涤 减少血色素对扩增的抑制 对受泥沙或载体色素影响的血痕 可对首次DNA提取液进行二次提取 使模板被稀释 减少载体的干扰 进一步去除模板中的扩增抑制物 对载体吸附力强的血痕 可增加浸泡时间 同时也可结合上述方法 对于量少而受污染的血痕 经上述处理后 再经超滤柱过柱浓缩 使模板DNA浓度达到可检测范围 在检案过程中 检材经常是受多种因素的影响 因此可综合利用上述几种处理方法 碱裂解法 原理 在强碱作用下 使构成细胞的蛋白质成分谷氨酸 天冬氨酸 半胱氨酸 酪氨酸残基等迅速发生电离 从而快速破坏蛋白质的一级结构 正因为强碱对蛋白质有强烈的变性乃至裂解作用 所以 检材在强碱性pH条件及一定温度状况下能迅速破碎细胞膜及核膜 使核酸酶变性及DNA释放 此时 DNA的一级结构是相对完整的 碱裂解法 优点 耗时少 一般只需5min 提取DNA所耗检材少 灵敏度高 所需试剂 仪器成本极低 由于所用试剂中含有强碱 可以有效抑止Tag酶抑制剂的作用 所以对于相同的位点 可以取得跟chelex 100相似的扩增效果 碱裂解法 注意事项 血痕要求在75 80 之间保温5min 若检材为陈旧性 尚应适当延长保温时间5 10min 一种改良方法 将chelex 100法或碱性裂解法处理的血痕 用等体积的饱和酚 氯仿