椎间盘退变基因治疗进展 current advances in gene therapy课件

椎间盘退变基因治疗进展CurrentAdvancesinGeneTherapyforDiscDegeneration 胡有谷陈伯华刘勇马学晓青岛大学医学院附属医院脊柱外科山东省创伤骨科研究所 引言 腰椎间盘退变为腰背痛重要原因腰椎间盘退变始于18 20岁 随年龄增加而加重腰椎间盘退变疾病椎间盘源性腰痛腰椎间盘突出症腰椎间盘狭窄症腰椎滑脱腰椎侧凸 引言 VitD多形核细胞受体基因IX型胶原等位基因MMP 3基因聚集蛋白多糖基因24新基因聚集蛋白多糖基因 ECM生物化学 生物力学 II型胶原聚集蛋白多糖 细胞功能减退细胞凋亡 VidemanT etal Mostofthe28studiedcandidategeneswereassociatedwiththedegenerativeMRIfindingsintheintervertevraldiscs ISSLS Bergen Norway 2006 21 腰椎间盘退变的因素 基因学 细胞学 椎间盘退变的生物学治疗基因治疗细胞治疗组织工程 基因治疗概念 基因治疗将缺陷性或缺失性RNA和DNA 改变其蛋白质的表达治疗疾病基因治疗原理外源性基因RNA或DNA转染至靶细胞引起外源基因表达加强对靶细胞中降低或缺乏的有利的蛋白质合成恢复靶细胞的正常功能和形态 NIH2000年初 300个项目 3500例临床I期基因治疗疾病的基因治疗癌症的基因治疗神经系统疾病的基因治疗Alzheimer sdiseaseParkinson sdisease血管疾病的基因治疗内分泌疾病的基因治疗特殊感觉器官障碍的基因治疗 骨科疾病基因治疗 1993年类风湿性关节炎回体基因治疗体内基因治疗质粒DNA反义脱氧寡核苷酸RoesslerB etal Adenovirus mediatedgenetransfertorabbitsynoviuminvivo JClinInvest1993 92 1085ChemajovskyY etal Genetherapyforrheumatoidarthritis Drugs12 29 411996年骨折骨不连BMP 4质粒和甲状旁腺激素质粒DNA片段双质粒基因活化基质 geneactivatedmatrix GAM 填充骨缺损新骨形成FangJ etal Stimulationofnewboneformationbydirecttransferofosteogenicplasmidgenes ProcNatlAcadSci1996 93 5753 1997年成骨不全Marini和Gerber脂质微胶 lipidoligomicelle 将脱氧寡核苷酸 oligodeoxynucleotides ODN 转入OI患者的培养细胞 靶向突变的mRNA有50 受到抑制MariniJC GerberNL OsteogenesisimperfectaRehabilitationandprospectsofgenetherapy JAMA1997 277 746 骨科疾病基因治疗 椎间盘退变基因治疗1992年Lettice等狗退变椎间盘注入EGF和FGF1997年日本Nishida等腺病毒介导hTGF 1cDNA转染体内椎间盘髓核细胞1997年Wehling等逆转录病毒介导IL IracDNA转染体外培育的牛椎间盘软骨终板的软骨细胞1999年至今山东省创伤骨科研究所开展椎间盘退变基因治疗 WehlingPetal Transferofgenestochondrocyticcellsofthelurnbarspine Proposalforatreatmentstrategyofspinaldisordersbylocalgenetherapy spine1997 22 1092NishidaKetal Adenovirusmediatedgenetransfertonucleuspulposuscells Tmpicationsforthetreatmentofintervertebraldiscdegeneration Spine1998 23 2437 基因治疗慨念 基因治疗实验研究程序靶细胞的确定目的基因的选择载体的选择基因的表达转基因后生物学效应的验证 椎间盘退变基因治疗进展 目的基因应用趋向病毒类载体应用进展基因表达调控椎间盘退变动物模型建立和观察基因治疗的安全性 椎间盘退变基因治疗进展 目的基因应用趋向 细胞因子分类抗分解代谢细胞因子基质金属蛋白酶抑制剂 TIMPs 白细胞介素 l IL I 受体拮抗剂促细胞分裂素胰岛素生长因子 IGF 1 生长分化因子 5 GDF 5 血管内皮生长因子 VEGF 结缔组织生长因子 CTGF 骨诱导形成素转化生长因子 TGF 家族 骨形态发生蛋白 BMP家族 细胞内调节因子骨诱导蛋白 I LMP 1 SOX 9基因 椎间盘退变基因治疗进展 目的基因应用趋向 上述4类细胞因子为椎间盘退变基因治疗所选用的目的基因目前亦有新入选的细胞凋亡抑制因子survivin各类细胞因子对细胞外基质影响不同TGF 蛋白多糖和II型胶原均能发挥上调作用SOX9为转换因子 其增加II型胶原表达 Survivin可抑制IL 3 TNF BAX FAS等引致细胞凋亡的细胞因子 正向调控因子基质合成因子TGF BMPCTGFbFGF TGF CTGF 椎间盘退变基因治疗进展 目的基因应用趋向 多细胞因子基因转染2004年以前为单细胞因子目的基因应用双细胞因子基因转染本研究所TGF 1和TGF 3双正向调控细胞因子TGF 1和VEGF双正向调控细胞因子OP 1和SOX 9双正向调控细胞因子TGF 1和TIMP 1单正向调控细胞因子 MMP抑制因子本研究所双正向调控细胞因子转染优于单细胞因子转染的效果Leckie等AAV BMP2和TIMP1体内试验显示能延缓椎间盘退变Haschtmann等BMP 2和TGF 3不能阻止椎间盘退变 LeckieSK BecharaBP HartmanRA etal SpineJ2012 12 7 20HaschtmannDFergusonSJStoyanovJV EurSpine201221 1724 1733 椎间盘退变基因治疗进展 目的基因应用趋向 三细胞因子基因转染2008年Moon和Nishida提出基因治疗多细胞因子转染鸡尾酒式治疗性基因转染 cocktail therapeuticgenetransfer 体外试验Ad TGF 1 Ad IGF 1 Ad BMP 2蛋白多糖含量双细胞因子转染较对照组增高3 2to3 9倍三细胞因子转染较对照组增高4 7倍MoonSH NishidaK GilbertsonLG etal Spine2008 33 1850 52011年本研究所体外试验HIV hTGF 3 CTGF TIMP 1三细胞因子转染较双细胞因子转染蛋白多糖含量增高1 5倍HIV hsurvivin TGF 3 TIMP 1三细胞因子转染较双细胞因子转染不增加细胞外基质蛋白多糖含量 型胶原 椎间盘退变基因治疗进展 病毒类载体应用进展 裸露的目的基因DNA不能直接导入细胞内细胞的目的基因转染需要通过载体外源性基因真核表达载体非病毒类病毒类逆转录病毒腺病毒腺相关病毒上述病毒类携带细胞因子目的基因容量有限目的基因表达时间短转基因后的生物学效应随时间延长而下降 椎间盘退变基因治疗进展 病毒类载体应用进展 慢病毒 Lentiviralvector LV 慢病毒染色体组载体特点可用于各种组织的靶细胞能承载更多的基因载荷 可携带较大基因组可将目的基因高效整合至基因组DNA而稳定表达高效感染分裂期及非分裂期细胞利于靶细胞的基因表达调节不易诱发宿主免疫反应 属于低毒性病毒载体KimY TewariM PajerowskiJD etalJControlRelease2009 134 13CaoF XieX GollanT etalMolImagingBiol2009 Epubaheadofprint DullaersM BreckpotK VanMeirvenneS etalMolTher2004 10 768 779 椎间盘退变基因治疗进展 病毒类载体应用进展 当前应用的慢病毒主要为HIV HumanImmunodeficiencyVirus 较其它病毒类载体和非病毒类载体更适于转染非分化 分化缓慢和静止期的细胞动物模型中成功地用于治疗各种基因缺陷性疾病和生理性疾病本研究所应用慢病毒HIV构建多目的基因质粒转染椎间盘HIV survivinTGF 3TIMP 1HIV hTGF 3CTGFTIMP 1临床应用前的研究结果显示人类基因治疗可应用慢病毒HIV载体HIV病毒可作为安全性的转基因载体PlutaK KacprzakMMActaBiochimicaPolonica2009 56 531近年来神经系统退行性疾病和血液病等应用慢病毒载体基因治疗NanouA AzzouzMProgBrainRes2009175 187NeschadimA McCartJA KeatingA etal BiolBloodMarrowTransplant200713 1407 1416 椎间盘退变基因治疗进展 基因表达调控 RNA干扰技术 RNAinterference RNAi 椎间盘退变的延缓和逆转提髙细胞外基质合成下调蛋白降解酶活性RNAi技术原理导入与内源性基因同源的双链RNA序列 siRNA siRNA与靶基因的mRNA的特异序列结合 抑制mRNA的翻译 增强内源mRNA的降解下调某些特殊基因表达或高效阻抑基因表达达到阻止目的基因表达和基因沉默 椎间盘退变基因治疗进展 基因表达调控 RNAi基因沉默特点高特异性最显著特征仅引起与dsRNA同源的mRNA降解其他mRNA的表达不受影响高效性显著抑制基因表达 几个siRNA即能有效抑制靶基因表达可传播性siRNA具有强烈的跨越细胞界限的能力能在不同细胞间长距离传递和维持RNAi扩散到整个机体并可传代可遗传性RNAi的基因沉默在低等动物中可遗传 ChitwoodDH TimmermansMC Nature 2010 467 7314 15 9 椎间盘退变基因治疗进展 基因表达调控 椎间盘退变RNAi技术下调蛋白降解酶基因表达将椎间盘组织细胞内分解代谢基因如MMPs ILs ADMATs作为靶基因通过siRNA介导调节椎间盘内靶基因阻止分解代谢基因mRNA翻译使分解代谢基因沉默终止病理性靶基因表达BernsteinE CaudyAA Nature200118 409 6818 363 6椎间盘基因治疗开创了新途径和新策略 椎间盘退变基因治疗进展 椎间盘退变动物模型建立和观察 椎间盘退变基因治疗体内实验是过渡到临床应用的必要论证椎间盘退变动物模型所选择的动物公认为灵长类动物退变椎间盘造模方法尚无确切的生理性椎盘退变方法目前通用的造模方法为椎间盘针刺损伤法 此法因穿剌针直径不同而致椎间盘退变出现的时间和严重度不一 椎间盘退变基因治疗进展 椎间盘退变动物模型建立和观察 本研究所恒河猴CT引导20号针经皮穿剌椎间盘获得了早期椎间盘退变并延长了观察时间 椎间盘退变基因治疗进展 椎间盘退变动物模型建立和观察 椎间盘退变基因治疗体内实验生物学效应观察定期椎间盘观察转基因椎间盘观察退变椎间盘自身对照椎间盘兼或对照组影像学X线MRI观察椎间盘由正常至不同级别退变的进程和形态转基因后退变级别和形态的变化组织学生物化学测定细胞外基质II型胶原和蛋白聚糖组织标本获取动物处死方式获取椎间盘组织动物用量增加和長期随访观察受限 椎间盘退变基因治疗进展 椎间盘退变动物模型建立和观察 MRI成像技术进展MRI设备3 0Tesla7 0Tesla功能性磁共振成像技木磁共振弥散张量成像技术 MagneticResonanceDiffusionTensorImaging 磁共振波谱成像技术 MagneticResonanceSpectroscopicImaging 磁共振弥散定量成像技术 Diffusionquantitativeimaging HaughtonV ImagingintervertebraldiscdegenerationJBJSAm 2006 88 15放射性核素成像技术 Radio nucleotideimaging 椎间盘退变基因治疗进展 椎间盘退变动物模型建立和观察 功能性磁共振成像技木无创性获得活体生理及病理物质代谢的检查方法将影像学检查深入到生物化学甚至基因水平称为 虚拟活检 virtualBiopsy SchaeffterTDahnkeH HandbExpPharmacol 2008 185 75LotzJC HaughtonV BodenSDRadiology 2012264 6 19为基因治疗试验应用的有效性 具备影像学和细胞基质含量变化的客观评价 椎间盘退变基因治疗进展 基因治疗的安全性 椎间盘退变基因治疗的安全性椎间盘退变基因治疗的安全性为临床应用主要障碍将由病毒作为载体 携带正向调控的目的基因质粒 注入相对封闭无血液循环的椎间盘髓核内病毒载体不在椎间盘髓核内的结果蛛网膜下腔Wallach等Ad TGF 1注入新西兰大白兔蛛网膜下腔内 造成瘫痪和严重的组织学改变WallachCJ KimJS SobajimaS etal SpineJ2006 6 107 12 硬膜外腔腺病毒载体基因质粒并发症80 以上腺相关病