Real time PCR.ppt

实时荧光定量PCRrealtime PCR CFX96实时定量PCR仪 实时荧光定量PCR技术是一种在PCR反应体系中加入荧光基团 利用荧光信号积累对整个PCR进程进行实时监测 进而实现对未知模板进行分析的方法 具有灵敏度高 特异性强 可靠性强 自动化程度高 无污染性 实时性 准确性等优点 定量与常规PCR的差别 常规PCR技术 对PCR扩增反应的终产物进行定量及定性分析 定量PCR技术 通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析 每经过一个循环 收集一个荧光强度信号 这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化 从而得到一条荧光扩增曲线 RealtimePCR原理 SYBRGreenI 非特异荧光标记 TaqMan探针 特异荧光标记 Molecularbeacon 特异荧光标记 SYBRGreenI工作原理 SYBRGreen1结合到双链DNA的小沟部位 只有和双链DNA结合后才发荧光 未结合SYBRGreen1dye 变性 无荧光信号 1 SYBRGreen只有和双链DNA结合后才发荧光2 变性时 DNA双链分开 无荧光3 复性和延伸时 形成双链DNA SYBRGreen发荧光 在此阶段采集荧光信号 TaqManProbes 探针完整 报告基团 R 所发射的荧光能量被淬灭基团 Q 吸收 无荧光 R与Q分开 发荧光 Taq酶有5 3 外切核酸酶活性 可水解探针 TaqManProbes工作原理 分子信标 发夹型杂交探针 分子信标工作原理 荧光基团 荧光扩增曲线分成三个阶段 1 荧光背景信号阶段2 荧光信号指数扩增阶段3 平台期 Baseline 基线 是背景曲线的一段 范围从反应开始不久荧光值开始变得稳定 直到所有反应管的荧光都将要 但是还未 超出背景 Threshold 荧光阈值 PCR扩增信号进入相对稳定的对数增长期时的荧光值 即荧光 Rn 超过本底时的临界数值 它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上 但一般我们将荧光域值的缺省设置是3 15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 CT cycleofthreshold 每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数 Ct与初始模板的关系 初始DNA量越多 荧光达到阈值时所需要的循环数 Ct值 越少 Ct与初始模板负相关起始模板的对数浓度与Ct呈线性关系 根据样品的Ct值就可计算出样品中所含的模板量 Quantificationmethods 分析方法 绝对定量和相对定量 绝对定量 已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线 主要针对样本间基因表达的差异 比如说经过处理的样本和未经处理的对照 因为不要做标准曲线 基因表达的相对变化分析比绝对定量的方法更省时 应用更广泛 需要内标基因做归一化处理 标准的看家基因一般都可被用作内标基因 如Actin GAPDH actin 2 microglobulin以及rRNA等 相对定量 几个概念 对照组 用作对照的样本 与实验组进行比较实验组 未知样本 用于研究目的基因 GOI 用于研究的基因内参基因 看家基因 基因表达量比较恒定的基因 用于校正起始上样量的区别参比样本 Calibrator 用于比较的样本 如未处理样本 正常组织 0时相样本等标准品 Standards 梯度稀释的已知浓度的样品 测定未知样品的浓度和反应效率Ct值 样品扩增产物的荧光信号达到所设定的荧光阈值时需要的循环数反应效率 E PCR扩增的速率 Actin STAT 21 对照 CPV 20 22 24 相对定量 2 Ct 相对定量 2 Ct 相对定量 荧光PCR实验设计 定量PCR反应体系 重复的样本间做一个Mix Primer与普通的PCR有区别 操作规则 1 全程佩戴一次性手套 皮肤经常带有细菌和霉菌 可能污染RNA的抽提并成为RNA酶的来源 培养良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染 2 使用灭菌的Ep管 枪头等 避免使用公共仪器所导致的RNA酶交叉污染 3 荧光探针要避光保存 加样完毕后立即进行PCR 4 注意移液枪枪使用时的精度 所有液态要缓慢的加到管底 不要用枪吹打 加样完毕后低速离心 避免气泡产生 5 实验操作过程中尽量少说话 不能直接用手接触8联管 防止试剂污染 RealtimePCR程序 参比荧光 管家荧光ROX 反应结束后 逐渐加温 和SyberGreen分子结合的PCR产物随温度升高逐渐变为单链 就不能在和SyberGreen结合 一般每加温一度 读一次信号 当温度到达PCR产物的Tm时 产物