细胞化学染色2009-2-25.ppt

第二节细胞化学染色 cytochemicalstain 临床检验与输血学系胡嘉波 概述 细胞化学 组织化学 组化 染色以形态学为基础并结合化学或生物化学技术 对细胞内各种化学成分 代谢产物作定位 定性和半定量检查的一门科学 可弥补单纯细胞形态学检查识别的不足 细胞化学染色临床意义 1 辅助判断急性白血病的类型 仅从细胞形态学观察白血病的诊断正确率约50 70 如结合细胞化学染色则可提到90 以上 2 辅助血液系统等疾病的诊断和鉴别诊断 不同细胞化学染色 染色步骤不同 但基本步骤为固定 有色沉淀反应及复染 1 固定为了保持细胞结构及化学成分的不变 需对细胞进行固定 根据染色的成分不同 选择合适的固定液 使细胞内的蛋白质 酶类 糖类等变成不溶性物质 固定的方法有物理法和化学法 临床上常用的是化学法固定 物理法包括干燥和火焰固定 化学法包括蒸汽固定和液体固定 如甲醛 乙醇 甲醇 丙酮等 2 有色沉淀反应 通过不同化学反应 使被检测的化学物质最终形成稳定的有色沉淀 列举以下三种化学反应 1 偶氮偶联法 含萘酚的底物 在相应酶的作用下释放出萘酚 萘酚与重氮盐 如坚牢蓝紫酱GBC 坚牢蓝B 六偶氮付品红等 结合 偶氮偶联形成有色沉淀 如NAP染色 特异性酯酶染色 非特异性酯酶染色 ACP染色等 2 普鲁士蓝反应 铁与酸性亚铁氰化钾作用 形成如亚铁氰化铁蓝色沉淀 如铁染色 3 雪夫反应 过碘酸氧化细胞内糖类中的乙二醇基形成乙二醛基 醛基与雪夫试剂作用 使无色品红形成红色沉淀物 如过碘酸 雪夫反应 3 复染 目的在于使各种细胞能显示出来便于观察 选择复染液的颜色应与有色沉淀的颜色有明显的对比度 即能使细胞结构显示又能清楚地看出细胞化学染色结果 如铁染色复染常用中性红 过碘酸 雪夫反应常用甲基绿 对核着色效果较好的有中性红 甲基绿 苏木精 核固红 沙黄等 使浆着色较好的有伊红 刚果红 光绿等 一 过氧化物酶染色 POX 原理 粒细胞和单核细胞的胞浆中含有髓过氧化物酶 myeloperoxidase MPO 能将底物H2O2分解 产生新生态氧 它能够将四甲基联苯胺氧化为联苯胺蓝 联苯胺蓝自我脱氢氧化 则显棕色四甲基苯醌二胺 若加入亚硝基铁氰化钠与联苯胺蓝结合 可形成稳定的蓝色颗粒 定位于细胞浆酶所在部位 骨髓片POX染色 骨髓片POX染色 APL 呈强阳性反应 AML M4 部分呈阳性反应 部分成弱阳性反应 AML M5 呈弱阳性 ALL 呈阴性 3 正常血细胞的染色反应 过氧化物酶主要存在于粒细胞和单核细胞中 原粒大多呈阴性反应 部分可出现少量阳性颗粒 自早幼粒细胞起至成熟中性粒细胞均呈阳性反应 并随着细胞的发育成熟阳性反应程度逐渐递增 中性分叶核粒细胞呈强阳性反应 淋巴细胞 幼红细胞 巨核等均呈阴性反应 POX染色临床意义 主要有助于急性白血病类型的鉴别 1 急粒其白血病性原粒细胞可呈弱阳性反应 颗粒粗大 呈局灶性分布 急淋其原淋细胞和幼淋均呈阴性反应 急单时白血病性原单呈阴性反应或弱阳性反应 颗粒细小 呈弥散分布 2 急单与恶性组织细胞白血病鉴别 异常组织细胞POX染色呈阴性反应 急单白血病细胞呈弱阳性反应 二 苏丹黑B染色 原理 苏丹黑B SudanblackB SBB 是一种脂溶性重氮染料 能溶解细胞内的含脂结构 如中性脂肪 磷脂 糖脂和类固醇 中 而使脂类物质显示出来 呈棕黑色或深黑色 脂类物质在粒细胞中丰富 单核细胞中也有少量 正常血细胞的染色反应 结果与POX染色基本一致 临床意义 本染色临床意义与POX染色基本相似 方法评价 过氧化物酶染色要求涂片新鲜 保持酶活性 才能得出正确结果 而苏丹黑B染色则无此要求 虽然SB染色临床意义基本同POX染色 但其灵敏度及特异性两者有所不同 SB染色的特异性低于POX染色 POX阳性见于髓系细胞 而SB阳性也可见于淋系细胞 但SB染色的敏感性高于POX染色 例如急性粒细胞白血病POX染色阴性的患者 其SB染色可阳性 三 中性粒细胞NAP染色 原理 中性粒细胞胞浆中的碱性磷酸酶能水解磷酸萘酚钠 释放出萘酚 后者与重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀定位于酶活性处 中性粒细胞碱性磷酸酶染色 NAP 嗜酸粒细胞 NAP积分油镜下计数100个中性杆状核 分叶核粒细胞 分别记录其分级情况 全部阳性细胞之和即为阳性率 将得出各种积分的百分率乘以该积分数 再相加即为积分值 例 4分占20 4x20 80分3分占40 3x40 120分2分占18 2x18 36分1分占10 1x10 10分0分占12 0 x12 0分阳性率88 积分 246分 NAP临床意义 1 细菌与病毒性感染的鉴别 前者增高 后者降低 2 类白与慢粒的鉴别 前者增高 后者降低 3 急性白血病类型鉴别 急粒NAP积分值减低 急淋NAP积分值增高 4 PNH与再障鉴别 前者减低 后者增高 5 真红增多症与继发性红细胞增多症鉴别 前者增高 后者无明显变化 6 白血病前期与增生性再障的鉴别 前者NAP积分减低 后者增高 四 酸性磷酸酶染色 原理 酸性磷酸酶 ACP 存在于细胞的溶酶体颗粒中 有些细胞中的酸性磷酸酶耐酒石酸 故抗酒石酸酸性磷酸酶染色有助于某些疾病的诊断及鉴别诊断 染色方法有偶氮偶联法和Gomori硫化铅法 以前者为常用 偶氮偶联法血细胞内的酸性磷酸酶在酸性 pH5 0 条件下水解基质液中的磷酸萘酚AS BI 释放出萘酚AS BI 后者与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀 定位于细胞质内酶所在的部位 本试验常用的重氮盐为六偶氮付品红 形成红色的沉淀 抗酒石酸酸性磷酸酶染色用相同方法制备两份基质液 一份再加入适量的L 酒石酸 tartaricacid 另一份不加酒石酸 取两张相同标本的涂片 分别用这两种不同的基质液做酸性磷酸酶染色 如果血细胞内的酸性磷酸酶耐L 酒石酸 两张均呈阳性 如不耐L 酒石酸 不加L 酒石酸呈阳性反应 而加L 酒石酸呈阴性反应 阳性反应为鲜红色或深红色颗粒 定位于胞浆 所有血细胞的酸性磷酸酶染色均为阳性 但是单核细胞 组织细胞 巨核细胞和毛细胞反应较强 抗酒石酸酸性磷酸酶染色 毛细胞白血病的毛细胞出现强阳性反应 除少数淋巴细胞表现弱阳性反应外 粒细胞 单核细胞和巨核细胞皆为阴性 临床意义 帮助诊断多毛细胞白血病 毛细胞呈阳性 常呈强阳性 阳性反应不被L 酒石酸抑制 慢性淋巴细胞白血病的淋巴细胞和恶性淋巴瘤细胞ACP染色也可呈阳性 但可被L 酒石酸抑制 但ACP阴性者 并不能排除多毛细胞白血病的可能性 帮助鉴别T细胞与B细胞 TL BL 帮助鉴别Gaucher病与Niemanm Pick病 单核 组织 网状 巨核细胞ACP染色均呈阳性反应 五 过碘酸 雪夫反应 原理 细胞内含有乙二醇基的糖基在高碘酸的氧化作用下产生双醛基 后者与雪夫 Schiff 染料作用 使无色品红变为紫红色染料沉积 定位于含有多糖成分的部位 根据胞质中糖原含量多少 可呈现粗细不等红色颗粒 块状物或均匀红色 在高碘酸氧化前 用麦芽糖淀粉酶或唾液淀粉酶处理标本 再作PAS染色 可鉴别是糖原还是其它多糖类物质 如被消化则是糖原 如不被消化则为其它多糖类物质 亦称糖原染色 PAS临床意义 1 红血病 红白血病及贫血类型的鉴别 红血病 红白血病 重型地贫及缺铁贫以及MDS时幼红细胞呈强阳性 但极少数红白血病可呈阴性 溶贫时幼红细胞呈阴性或弱阳性 再障 巨幼贫时幼红细胞呈阴性 2 白血病类型的鉴别 急粒时原粒呈阴性或弱阳性 以弥漫性为主 急淋时原 幼淋多呈块状阳性反应 少数呈阴性反应 急单时原 幼单核细胞呈阳性反应 其颗粒细小 弥散分布 3 巨核细胞与里斯 Reed Sternberg 细胞的鉴别 前者呈强阳性 后者呈阴性或弱阳性 4 Gaucher细胞与Niemanm Pick细胞的鉴别 前者为强阳性 后者为阴性或弱阳性 Sternberg 六 酯酶染色 不同血细胞中所含酯酶的成分不同 根据酯酶特异性高低分为特异性酯酶 SE 和非特异性酯酶 NSE 特异性酯酶就是指氯乙酸AS D萘酚酯酶染色 非特异性酯酶的种类有多种 根据pH值不同分为酸性 中性和碱性酯酶 包括了酸性非特异性酯酶 即酸性 醋酸萘酚酯酶 碱性非特异性酯酶 即 丁酸萘酚酯酶 和中性非特异性酯酶 后者包括 醋酸萘酚酯酶 醋酸AS D萘酚酯酶等 目前显示血细胞中酯酶的方法均采用偶氮偶联法 一 氯乙酸AS D萘酚酯酶染色 原理 血细胞内的氯乙酸AS D萘酚酯酶 naphytholAS Dchloroacetateesterase NAS DCE 水解基质液中的氯乙酸AS D萘酚 产生AS D萘酚 进而与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀 定位于细胞质内酶所在的部位 本试验常用的重氮盐为坚牢紫酱GBC 形成的有色沉淀为红色 NAS DCE几乎仅出现在粒细胞 其特异性高 因此又称为 粒细胞酯酶 1中性成熟粒细胞 呈强阳性 2淋巴细胞 呈阴性 4单核细胞 呈阴性 5幼红细胞 呈阴性 急粒M1氯乙酸AS D萘酚酯酶染色图1原粒呈阳性 其他原始粒细胞均呈阴性 正常血细胞的染色反应 1 粒系分化差的原粒呈阴性 分化好的原粒呈阳性 自早幼粒至成熟中性粒均呈阳性 但酶活性并不随着细胞的成熟而增强 嗜酸性粒细胞呈阴性或弱阳性 嗜碱性粒细胞呈阳性 2 单核系绝大多数为阴性 仅个别单核系细胞呈弱阳性 3 其他细胞如淋巴细胞 浆细胞 巨核细胞 有核红细胞 血小板等均呈阴性 肥大细胞阳性 临床意义 主要用于辅助鉴别急性白血病细胞类型 是急性白血病的常规细胞化学染色 急粒时原粒呈阳性或阴性 所以染色结果为阴性者不能排除急粒可能性 M3时早幼粒细胞呈强阳性 急单时原单及幼单细胞几乎均呈阴性 个别细胞弱阳性 M4时原粒及早幼粒呈阳性 原单及幼单细胞呈阴性 急淋和急性巨核细胞白血病均呈阴性 二 醋酸萘酚酯酶染色 NAE 原理 该酶主要存在于单核细胞 粒细胞和淋巴细胞中 是一种中性非特异性的酯酶 血细胞内的 NAE在pH中性条件下 水解基质液中的 醋酸萘酚并释放出 萘酚 进而与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性有色沉淀 定位于细胞质内酶所在的部位 本试验常用的重氮盐为坚牢蓝B 形成的有色沉淀为棕黑色或灰黑色 单核细胞系统的阳性可被氟化钠抑制 所以做 NAE染色时 通常同时做氟化钠抑制试验 正常血细胞的染色反应 1 单核系分化差的原单呈阴性 分化好的原单呈阳性 常较强 幼单及单核也呈阳性 阳性反应能被氟化钠抑制 所谓抑制是指氟化钠试验的抑制率大于50 2 粒系阴性或阳性 但阳性反应不能被氟化钠抑制 3 淋系多数阴性 少数弱阳性 不能被氟化钠抑制 4 其他细胞巨核细胞和血小板呈阳性 阳性反应不能被氟化钠抑制 少数有核红细胞呈弱阳性 阳性反应不能被氟化钠抑制 浆细胞呈阴性 NAE临床意义 1 有助于急性白血病类型鉴别 急性单核细胞白血病时白血病细胞呈强阳性反应 且能被氟化钠抑制 故在染色时要同时做氟化钠抑制试验 急性粒细胞白血病时呈阴性反应或弱阳性反应 阳性反应不被氟化钠抑制 2 红血病和红白血病时异常幼红细胞可呈阳性反应 3 巨幼红细胞性贫血时巨幼红细胞也可呈阳性反应 10 铁染色 原理 正常人骨髓中的贮存铁主要存在于骨髓小粒和幼红细胞中 骨髓中的铁在酸性环境下与亚铁氰化钾作用 形成普鲁士蓝色的亚铁氰化铁沉淀 定位于含铁的部位 铁染色 ferricstain 化学反应过程如下 酸性4Fe3 3K4 Fe CN 6 Fe4 Fe CN 6 3 12K 含铁物质 亚铁氰化钾 亚铁氰化铁 结果 幼红细胞核呈鲜红色 浆呈淡黄红色 铁粒呈蓝绿色 细胞外铁用低倍镜观察涂片 特别是涂片尾部和髓粒附近 注意翠蓝色颗粒的存在 可分五级标准 无颗粒 有少数铁颗粒或偶见铁小珠 颗粒体积大于嗜酸性粒细胞的颗粒者称为铁珠 有较多的铁颗粒和小珠 有很多的铁颗粒 小珠和少数小块状 有极多铁颗粒 小珠 有很多的小块 密集成堆 细胞内铁用油镜计数100个中 晚幼红细胞 记录胞浆中含有蓝色铁粒的红细胞 铁粒幼红细胞 的百分率 根据细胞内铁颗粒的数目 大小 染色深浅和颗粒分布的情况 将铁粒幼红细胞分为四型 型 幼红细胞内含铁粒1 2个 型 幼红细胞内含铁粒3 5个 型 幼红细胞内含铁粒6 10个 型 幼红细胞内含铁粒11个以上 环形铁粒幼红细胞环形铁粒幼红细胞的标准为含铁粒在6个以上 围绕核周1 2以上者 有时成熟红细胞中也出现铁颗粒称为铁粒红细胞 铁染色的临床意义 1 鉴别缺铁性贫血 铁粒幼细胞性贫血及某些溶血性贫血缺铁性贫血时骨髓细胞外铁和内铁显著减少或消失 经铁剂治疗后细胞外铁及内铁可迅速增多 此检查是诊断缺铁性贫血及指导铁剂治疗的一种辅助方法 非缺铁性贫血 如溶血性贫血 巨幼红细胞性贫血等病人的细胞外铁可以增高 因此有助于鉴别缺铁性贫血与非缺铁性贫血 2 用于诊断铁粒幼细胞性贫血能找到数量不等的环形铁粒幼细胞 多见粗颗粒的 型与 型铁粒幼细胞 表4 2 10几种常见急性白血病的细胞化学染色结果 第三节骨髓活体组织检查 概述 骨髓活体组织检查 bonemarrowbiopsy BMB 简称骨髓活检 是观察骨髓组织结构和空间定位 补充骨髓涂片检查的一有效方法 能有效反映骨髓组织结构及间质成分的变化 了解骨髓造血组织的结构和细胞之间和组织之间的相互关系 对很多血液系统疾病的诊断都具有重要意义 一 骨髓活检适应症 1 骨髓穿刺多次失败 怀疑骨纤 骨髓转移癌 MM 毛白 某些急 慢白及骨髓