提RNA反转录的详细流程.doc

SMART 技术制备 GS FLX 样品cDNA详细流程第一天一 RNA的提取1. 用QiagenRneasy Mini Kit 提取组织总RNA(详见Handbook)：1） 在1.5 ml管中加入600ulRLT和6ul B-巯基乙醇2） 取1030mg组织样品放入管中，用剪刀或电动匀浆机破碎， 35min3） 12000rpm/3min,取上清移入新管4） 加入1倍体积70%乙醇，轻柔混匀（吸打），不能离心，并立即转入收集柱，10000rpm/30s,弃废液。(分两次移吸附柱，离心弃废液后，打开盖子让酒精挥发一下再操作)5） 加入700ulRW1, 10000rpm/30s,弃废液6） 加入500ulRPE, 10000rpm/30s,弃废液7） 加入500ulRPE, 10000rpm/2min,弃废液，换新收集管，空转12000rpm/1min8） 将收集柱移入1.5mlRnase-free管中，加3050ulRnase-free water,静置1min,10000rpm/1min.(由于下步用Dnase去除DNA,需用87.5ul RNA溶液，因此用45ul Rnase-free water洗两次)9）定量，跑胶2. 用Tiangen Rnase-Free Dnase I 去除DNA 污染1） 反应体系：共100ul87.5ul RNA 溶液10ul buffer RDD2.5ul Dnase I储存液（配制：干粉溶于550ul的Rnase-Free ddH20中，分装，-20保存）2）2025孕育10min3. 用Qiagen Rnwasy Mini Kit 纯化1）100ul除DNA后的RNA+350ulRLT,混匀2）加入250ul无水乙醇，轻柔混匀，不能离心，并立即移入收集柱，10000rpm/30s，弃废液3）加入500ulRPE, 10000rpm/30s,弃废液4）加入500ulRPE, 10000rpm/2min,弃废液，换新的收集管，空转1min5) 换1.5ml管，加3050ulRnase-free water，置1min,10000rpm/1min6）定量，跑胶第二天二 反转录（SMART Kit,详见Manual）1.做逆转录之前对RNA的处理：浓缩RNA1）在所提取的RNA里（大约为10ug），加无水乙醇（2倍体积），醋酸钠（3M. PH=15.2 0.1倍体积）2）-70, 酝酿40min或过夜. 3）取出溶液，3000g/1min; 换个方向，12000rpm/5min4）弃上清，用70%的乙醇洗两次。即加1ml 70%乙醇，把沉淀弹起，12000rpm/5min.5）弃上清，37干燥。6）加Rnase free water 30-40ul, 分装。-70保存！1. 反转录合成1链cDNA需要1ng-2ug总RNA或0.5ng1ug polyA RNA1) 13.5ulRNA+1ul改进的3primer(12uM),( 3primer用时需稀释到12uM，离心)，总反应体积必为4.5ul，混匀2) 72,3min; 42,2min3) 加入以下反应液（4.5ul sample + 5.5ul反应液，总反应体积为10ul）：2ul 5xFirst-Strand Buffer 0.25ul DTT(100mM)1ul dNTP Mix (10mM)1ul SMARTer II A Oligonucleotide (12uM)0.25ul Rnase Inhibitor1ul SMARTScribe Reverse Transcriptase (100u)4) 42,60min; 45,15min;72,10min.得到第一链cDNA5) 加入TE稀释（-20c保存3个月）总RNA + 40ul TE起始量0.2ug polyA RNA + 190ul TE起始量0.2ug polyA RNA + 90ul TE2. 合成双链DNA 反应液：（总反应体积：90ul反应液+10ul稀释的1链cDNA） 74ul 去离子水 10ul 10XPCR buffer2ul 50XdNTP Mix (10mM)2ul 5PCR primer IIA (12uM)2ul Polymerase (Extaq 酶) 反应体系: 95 1min 95 15s 65 30s 1520 cycles 68 3min 3. 反应完后，每管加2ul0.5M EDTA ,静置10min,终止反应4. 用 QIAquick 纯化试剂盒纯化（此步骤在双链合成了以后）1) 加5倍体积的buffer PB, 混匀。（颠倒，瞬离）2) 移入吸附柱中，12000rpm/1min3) 弃废液，加750ul buffer PE（新开的要加乙醇），12000rpm/1min，弃废液。4) 吸附柱放入新的收集管中，空转12000rpm/1min（注意改变收集管的方向离心）5) 弃空收集管，柱放入新的1.5MLEP管中。6) 加入25ul buffer EB，洗柱子，静置1min,37. 12000rpm/1min7) 重复步骤6，得约50ul（下步用约45ul）溶液移入新管中，便于下步操作。三用BsgI酶（NEB）去除polyA1. 50ul的反应体系10X NEB缓冲液 5ulDNA 3ng 用切胶回收琼脂糖凝胶浓度1.21.5% 1.8g琼脂+ 150TB 溶解四分钟（中摇匀） 50微升的CDNA一般加5微升颜料，胶孔内尽量不加水 ，缓冲液与胶面平行待跑出孔后补满1) 用干净的刀片切胶 （切胶尽可能小）2) 加入三倍体积的QG buffer（例如：0.1g胶加300微升QG）3) 50度溶解10分钟 保证琼脂完全溶解（颜色呈黄色）或者37度溶解完全4) 加入与胶同体积的异丙醇 例：0.1g胶加100微升异丙醇isopropanol5) 不要离心，转入到收集柱 离心 ： 13000 rpm 1min (可以分两次转入收集柱)6) 加500微升QG 离心： 13000 rpm 1min7)