干细胞标志物ppt课件

干细胞标志物 如何鉴定各种类型的干细胞 间充质干细胞 胚胎干细胞的鉴定 1人胚胎干细胞表面标志物鉴定和基因表达 是否表达SSEA 3 SSEA 4 TRA1 60 TRA1 81 碱性磷酸酶等 检测是否表达OCT 4 Sox2 Fgf4 Rex1等的基因 2人胚胎干细胞体内分化能力 注射至免疫缺陷小鼠观察是否产生畸胎瘤 若畸胎瘤含有3个胚层来源的细胞 可基本证明具有体内分化的潜能 3人胚胎干细胞体外分化能力 用特异抗体检测4人胚胎干细胞核型 是否为两倍体的正常核型5类胚体形成法6端粒酶的高表达 造血干细胞的鉴定 1自我更新能力 增殖潜能检测细胞所生成的总细胞数2多向分化潜能在所生成的所有细胞中不同系的细胞数量3表型特征是否表达CD34 CD133 Sca 1等4细胞周期的特性如绝大多数干细胞是否处于静止期5排出染料的特性如对活体染料罗丹明123拒染或染色较轻 神经干细胞的鉴定 1自我更新能力2多向分化潜能3Nestin NCAM的表达 间充质干细胞的鉴定 1一般生物学特性2细胞表面标记SH2 CD105 内皮糖蛋白 SH3 CD166 白细胞活化黏附分子 等3多系分化潜能 成骨 成软骨 成脂肪 4支持造血功能5低免疫原性和免疫调节功能 干细胞鉴定 干细胞标志物有哪些 细胞膜表面分子 又被称为膜抗原或者表面标记分子 surfacemarker 大多数为跨膜 糖 蛋白 结构上分为膜外区 跨膜区和胞质区 胞质区执行信号转导功能 少数膜分子并非跨膜蛋白 而是以糖基磷脂酰肌醇 GPI 方式连接锚固在细胞膜上 根据膜分子氨基酸序列和结构同源性 将膜分子分为不同的家族和超家族 包括免疫球蛋白超家族 细胞因子受体家族 C型凝集素超家族 整合素家族和肿瘤坏死因子受体超家族 细胞表面分子分类 白细胞分化抗原 leukocytedifferentiationantigen LDA 定义 白细胞分化抗原是指白细胞 血小板 血管内皮细胞等在分化发育不同阶段以及活化过程中 出现或消失的细胞表面标志 多是跨膜蛋白或糖蛋白 少数为碳水化合物半抗原 举例 如T细胞分化1 最早期前体T细胞在胸腺上检测到的特异标志是CD1和TdT2 成熟T细胞则不表达这两种抗原 3 当胸腺前体细胞进入下一分化阶段 这两种标志消失 而HLA 1类抗原和CD2分子在I细胞膜上表达4 在分化的第三阶段T细胞上开始出现CD4和CD8抗原 CD clusterofdifferentiation CD 应用以单克隆抗体鉴定为主的方法 将来自不同实验室的单克隆抗体所识别的同一分化抗原称CD 多克隆抗体 单克隆抗体 1975 Kohle和Milstein 不同实验室获得相同抗体但命名为不同 IWHLDA统一名称IWHLDA 人类白细胞分化抗原的国际协作组会议 Internationalworkshoponhumanleukocytedifferentiationantigens 至2010年已被确定人类CD抗原共363群 CD1 CD363 许多群中还包括若干个亚群 根据分布的细胞系分为T细胞 B细胞 髓细胞 NK细胞 血小板 活化细胞 粘附分子 内皮细胞 细胞因子受体 红细胞 树突状细胞 干细胞 祖细胞 碳水化合 凝集素等CD抗原 共13组 动物的白细胞分化抗原也逐渐地采用CD命名法 与人类CD相同的 加上与人类相同的编号 为了与人的CD相区别 在CD前加上动物种类的的缩写 例如BoCD 表示牛的白细胞分化抗原 绵羊 山羊 马的分别表示为OvCD CpCD EpCD 一些常见的CD分子及其分布和主要功能 注 Thy 胸腺细胞 DC 树突状细胞 FDC 滤泡树突状细胞 B B细胞 Bsub B亚群 Pre B 前B细胞 Bm 成熟B细胞 Ba 活化B细胞 T T细胞 Tsub T亚群 Ta 活化T细胞 M Ma 活化单核细胞 Mac 巨噬细胞 Mas 肥大细胞 PC 浆细胞 G 粒细胞 PMN 多形核细胞 My 髓样细胞 NK 自然杀伤细胞 NKsub NK亚群 LHC 表皮 罕氏细胞 RS Reed Srtenterg细胞 NEC 神经内分泌细胞 RBC 细细胞 Pt 血小板 Eo 嗜酸性粒细胞 BM 骨髓细胞 Meg 巨核细胞 Fb 成纤维细胞 En 内皮细胞 Leu 白细胞 gp 糖蛋白 p 蛋白质 VLA 很晚出现在抗原 CALLA 共同型急性淋巴母细胞白血病抗原 LAMP 溶酶体相关膜蛋白 MCP 膜辅蛋白 MAC 膜攻击单位 LFA 淋巴细胞功能相关抗原 CR 补体受体 3FAL 3 fucosyl N acetyl lactosamine PECAM 血小板内皮细胞粘附分子 ECMR 细胞外基质受体 LCA 淋巴细胞共同抗原 PTPase 磷酸酪氨酸磷酸酯酶 ICAM 细胞间粘附分子 N CAM 神经细胞粘附分子 TAP T细胞活化蛋白 Tyr P 磷酸化酪氨酸 VCAM 血管细胞粘附分子 GPI 糖基磷脂酰肌醇 AIM 活化诱导分子 LIF 白血病抑制因子 OSM 抑瘤素 M CNTF 睫状神经营养因子 CA 胶原蛋白 LM 层粘连蛋白 FN 纤粘连蛋白 FB 血纤维蛋白原 vWF vonWillbrand因子 TM 4 四次跨膜家族 黏附分子AdhesionMolecules 定义 是介导细胞与细胞之间 细胞与细胞外基质间相互接触 识别 结合和激活等分子的统称 特点 位于细胞表面或细胞基质中的糖蛋白 以配体 受体结合的形式发挥作用 参与细胞的识别 活化和信号转导等 命名 以功能命名 如细胞间黏附分子 ICAM 血管细胞黏附分子 VCAM LFA 1等以CD命名 统称为CD抗原 分子 大部分黏附分子已有CD编号 分类 1 整合素家族 integrinfamily 包括LFA 1 LFA 2 LFA 3 ICAM 1 ICAM 2和一些补体受体等 2 选择素家族 selectinfamily 主要包括白细胞 选择素 血小板 选择素和内皮细胞 选择素3种 即CD62L CD62P和CD63E 3 免疫球蛋白超家族 Igsuperfamily 共15个 主要有主要有CD2 CD4 CD8 CD28 CD31 CD54 CD58 CD80 CD86 4 钙黏蛋白家族 cadherinfamily 指在Ca2 参与下使细胞间相互聚集的细胞粘附分子 又称钙粘着蛋白 C adherin 已知该家族有3个成员 分布在上皮组织的P 钙粘着蛋白 主要分布在神经组织的N 钙粘着蛋白 分布在胎盘和间皮组织的P 钙粘着蛋白 5 未归类的黏附分子作用 1 参与细胞间的识别 细胞的活化和信号转导 细胞的增殖与分化 细胞的伸展与移动2 免疫应答 炎症发生 凝血 肿瘤转移 创伤愈合 细胞膜受体 受体 receptor 是一种能够识别和选择性结合某种配体 信号分子 的大分子物质 配体 ligand 指细胞外的信号分子 包括激素 神经递质 抗原 药物以及其他有生物活性的化学物质 细胞膜受体 membranereceptor 是存在于细胞膜上的一类特殊的膜内在蛋白 能与配体特异性结合 并在细胞内引起特定的生物学效应 细胞因子受体 细胞因子 cytokine 指由免疫细胞和某些非免疫细胞 如血管内皮细胞 表皮细胞和成纤维细胞等 经刺激而合成分泌的一类生物活性分子 它们介导免疫细胞之间的信息交换与相互调节 参与免疫应答和炎症反应过程 国际细胞因子学会 InternationalCytokineSociety ICS 根据功能能分为 促炎因子 趋化因子 生长因子 Th1细胞因子 Th2细胞因子 白细胞介素 interleukin IL 干扰素 interferon IFN 肿瘤坏死因子 tumornecrosisfactor TNF 集落刺激因子 colonystimulatingfactor CSF 趋化性细胞因子 chemokine 生长因子 growthfactor GF 细胞因子受体的分类 I型细胞因子受体家族 红细胞生成素受体超家族 II型细胞因子受体家族 型肿瘤坏死因子受体超家族 型趋化性细胞因子受体家族 G 蛋白偶联受体 MHC 在诱导移植排斥反应过程中发挥主要作用的组织抗原被称为主要组织相容性抗原 majorhistocompatibilityantigen 主要组织相容性抗原高表达于白细胞 主要是淋巴细胞和单核 巨噬细胞 因此又被成为白细胞抗原 Leukocyteantigen LA 编码主要组织相容性抗原的基因是主要组织相容性 基因 复合体 majorhistocompatibility litycomplex MHC 因此主要组织相容性抗原通常又被称为MHC分子 根据血清学 抗原 和生物化学 分子结构 特点 将MHC分子分为I类 II类 MHC通常代表基因 而MHC分子或主要组织相容性抗原是基因编码产物 MHC的分布 主要内容 干细胞标志物作用 分离鉴定干细胞的参考依据干细胞内分类的依据各种肿瘤干细胞均具有不同的肿瘤干细胞标志物 如CD34CD38Thy是白血病干细胞的表面标志 LinESAB38 1CD44CD24被认为是乳腺癌干细胞的特征 Singh等分离出了具CD133的脑肿瘤干细胞等等参与干细胞的分化调控维持干细胞的自我更新和多能性参与机体重要的生理和病理过程 干细胞标志物检测的方法 荧光标记细胞分选 FACS 免疫磁珠分离 MACS 亲和吸附柱分离 CEPRATE 探针技术生物素 亲和素系统的ABC法酶免疫法 各种干细胞的筛选标志汇总 常见的干细胞标志物 Oct 4SSEAAKPTRA CD34CD133 或AC133 Sca 1KDRc kitThy STRO 1CD105CD166CD44CD29 ABCG 2Nestin ABCG2 ATP bindingcassettesuperfamilyGmember2 ABCG2是ABC转运体家族的成员 广泛存在于各种干细胞上 其特异性表达决定了SP sidepopulation 细胞的Hoechst阴性染色表型 ABCG2是首先定位在乳腺癌细胞系上 ABCG2在CD34阴性细胞上出现的几率最大 但细胞表达CD34后 ABCG2下调 ABCG2的下调也表现在很多造血祖细胞上 因此在原始HSC的分离鉴定上 ABCG2比CD34更有希望做为较好的标志物 ABCG2在SP细胞上的专一表达提示ABCG2可能成为是成体多能干细胞阳性筛选的潜在标志物 ABCG2在干细胞发育生物学里也扮演着一定的功能上的角色 Oct 4 Oct 4 也叫Oct 3或Oct3 4 属POU转录因子一员 由Pou5fl基因编码产生 目前被广泛的应用于鉴定ES细胞是否处于未分化状态 最初鉴定为DNA结合蛋白 可通过顺式元件活化基因转录 它在全能胚胎干细胞 ES 和生殖细胞表达 ES的分化导致Oct 4的下调 Oct 4可能是所有哺乳动物体内多能细胞发育阶段的调节分子 因此也成为检测细胞是否具有多能行的一个标志分子 SSEAs stage specificembryonicantigens SSEAs即阶段特异性胚胎抗原 是一种糖蛋白 常表达于胚胎发育早期 在未分化的多能干细胞中SSEA也常为阳性 在鼠和人的ES细胞之间它的表达存在种属差异性 小鼠ES SSEA 1 SSEA3 SSEA4 源于IPM的人ES SSEA 1 SSEA3 SSEA4 源于PGC的人ES SSEA 1 SSEA3 SSEA4 输卵管上皮 子宫内膜 附睾 成年鼠脑和肾小管区域也发现和SSEA 1抗体反应 SSEA 3和4在卵子发生时合成 在卵母细胞 受精卵和早期卵裂球细胞膜上存在 碱性磷酸酶 alkalinephosphatase AKP 一种单脂磷酸水解酶 能在碱性条件下水解磷酸单脂释放出磷酸 AKP的高表达与未分化的多能干细胞相关 如在桑葚胚和胚泡中均有AKP的表达 未分化的ES细胞中也表达丰富的AKP 而在已分化的ES细胞中AKP则呈弱阳性或阴性 CD34 细胞表面的唾液粘蛋白 CD34分子是I型跨膜糖蛋白 选择性地表达于早期造血干细胞 HSCs 造血祖细胞 小血管内皮细胞和胚胎纤维母细胞表面 从骨髓和外周血来源的CD34阳性富集的细胞群体显出大部分的造血活性 CD34被认为是造血干 祖细胞的标志物 CD34在原始细胞分化为成熟细胞后表达下降 这点也发现在克隆的祖细胞和一些细胞系的干细胞 CD34随着细胞的分化逐渐减少直至消失 尽管CD34功能未知 但现在认为它参与早期造血 CD34是HSCs标志物 质疑1 Osawa等人首先证明拥有完全的再建能力的小鼠HSCs可以是CD34阴性 质疑2 人的CD34阴性细胞也有低水平的嫁接和造血能力 总的说来 HSCs可能是CD34 或CD34 CD133 120kDa糖基化蛋白 包括5个跨膜结构域 最初是通过AC133单抗鉴定的 它能识别人HSCs的CD34 亚类 一种CD133异构体AC133 2 最近已经被克隆并鉴定为可被AC133抗体识别的原始表面抗原 CD133可以作为用CD34筛选HSC和体外扩增的补充 CD133 富集的亚群与CD34 富集的亚群扩增方式相似 可保留多系增殖的能力 最近的研究为CD133的表达不限于原始血细胞提供了证据 同时也确定了非造血组织中一类独特的细胞群体 来源于外周血的CD133 祖细胞可被体外诱导分化为内皮细胞 Sca 1 stemcellantigen1 Ly 6A E 即干细胞抗原1 是18kDa磷脂酰肌醇锚定蛋白 属Ly 6抗原家族成员 Sca 1被广泛认为和Ly 6半抗原一起 是小鼠HSC标志分子 它在多能HSCs上表达 一种抗Sca 1抗体经常和一些细胞表面标志分子表达的阴性选择一起用来鉴定和分离小鼠HSCs Sca 1 HSCs可在成年骨髓 胎儿肝脏 成年动物流动的外周血和脾脏中被找到 Sca 1在几种非造血组织中也被发现 可用来富集HSCs之外的祖细胞 Sca 1可能参与调节B细胞和T细胞活化 c kit 即CD117 为一原癌基因 可编码一种穿膜酪氨酸激酶受体分子 应用单克隆抗体证明此分子可存在于造血干细胞膜上 其后证明它的配体分子是造血干细胞因子 stemcellfactor SCF 它是信号传导分子 对造血干细胞的分化具有重要作用 分化相关的标志 I 型胶原 碱性磷酸酶 骨桥接素 典型的造血干细胞标志 CD3 T3 CD7 sp40 CDll CDl4 CD30 CD34 CD45 淋巴细胞共有抗原 CDll7 c kit CDl35 基质受体 CD31 PECAM一1 CD62E L S HLA DR 共刺激分子 B7 1 CD80 B7 2 CD86 其他 CD4 CD6 CDl0 CDl8 CD21 CD25 CD33 P67 CD36 CD38 CD50 CD95 MSCs不表达的抗原主要有以下几类 1991年 Simmoms首次鉴别了BMSC的抗体STRO 1SH2 CD105 内皮糖蛋白 SH3 CD166 白细胞活化黏附分子ALCAM SH4 CD73 CD13 CD29 CD44 CD105 CD166不表达内皮细胞特征性的标志分子CD31 造血细胞的表面标志分子CD34 CD45 CD14 不表达MHC 分子和FasL 或极低水平表达MHC 分子 也不表达B7 1 B7 2 CD40及其配体 不同来源的间充质干细胞表型不同 脐带MSC 表达CD29 CD44 CD51 CD105 SH2 SH3 不表达CD34 CD45胎盘MSC 表达CD105 SH2 SH3 SH4 SSEA 4 TRA 1 61 TRA 1 80 不表达造血细胞 内皮细胞及滋养层细胞的特殊标志物脂肪MSC 表达CD29 CD44 CD105 CD166 CD49等 不表达CD31 CD106 CD3 CD4 CD8 CD14等骨髓MSC 表达CD105 CD106 不表达CD49 STRO 1 Stro 1 细胞是MSC中更原始的亚群 含量极少 但在体外却具有更强的免疫抑制作用 用CD34阳性骨髓细胞进行免疫产生的小鼠IgM单抗STRO 1 能识别一种人骨髓基质成分表达的表面抗原 在骨髓细胞中 STRO 1 血型糖蛋白A 细胞群中的纤维母细胞集落形成细胞富集的频率约100倍于STRO1 GlycophorinA 群体 STRO 1 富集的骨髓细胞亚群有能力分化为各间质细胞系 包括带有血管平滑肌样表型的支持造血的基质细胞 脂肪细胞 成骨细胞和软骨细胞 有研究证明人Stro 1 MSC在小鼠体内有着较Stro 1 MSC明显增强的组织器官归巢能力 而Stro 1 MSC造血支持能力更强 在体外扩增MSC前首先筛选其中的Stro一1十MSC再行体内输注 仅以少量细胞便可发挥更为显著的免疫调节作用 特别适合应用于GVHD发生率较高的移植类型 如无关供体移植 半相合移植等 STRO 1作为一种有价值的抗体 可用来鉴定 分离和功能检测人骨髓基质祖细胞 这些细胞和原始的HSCs有明显区别 CD105 SH2 endoglin 同型二聚体细胞膜糖蛋白 CD105 是内皮细胞表面与增殖相关的膜抗原 同时又是转化生长因子 TGF 受体复合物成分之一 1999年Barry与Haynesworth首次利用SH2单克隆抗体 确定识别抗原为endoglin CDl05 CDl05主要分布在内皮细胞中 与血管的发育有关 MSCs特征性表达此抗原说明MSCs与内皮细胞存在一定的内在联系 CD105高表达于BMSC 在细胞表面为TGF 的受体 与配体TGF 转化生长因子 transfergrowthfactor 结合可诱导成骨作用 促进胞质和一些细胞外基质的合成并促进间质细胞的生长 分化 CD166 ALCAM CD166 白细胞活化黏附分子 是免疫球蛋白基因超家族成员 主要表达于造血细胞 内皮