药物定量分析样品与分析方法验证课件

第四章 药物定量分析样品与分析方法验证 第一节定量分析样品的前处理 一 概述研究对象 含金属或含卤素 硫 磷 硒等特殊元素药物分析前处理 二 不经有机破坏的分析方法三 经有机破坏的分析方法 一 概述 原料 不经特殊处理直接测定 原料 经有机破坏后测定 制剂 排除处方中干扰组分 药物 二 不经有机破坏的分析方法 一 直接测定法1 配位滴定法2 氧化还原法 二 经水解后测定法1 碱水解后测定法2 酸水解后测定法 三 经还原分解后测定 二 不经有机破坏的分析方法 一 直接测定法1 配位滴定法葡萄糖酸钙 含量测定 取本品0 5g 精密称定 加水100ml 微热使溶解 加氢氧化钠试液15ml与钙紫红素指示剂0 1g 用乙二胺四醋酸二钠滴定液 0 05mol L 滴定至溶液自紫色转变为纯蓝色 每1ml乙二胺四醋酸二钠滴定液 0 05mol L 相当于22 42mg的C12H22CaO14 H2O 二 不经有机破坏的分析方法 一 直接测定法2 氧化还原法葡萄糖酸锑钠 含量测定 取本品约0 3g 精密称定 置具塞锥形瓶中 加水100ml 盐酸15ml与碘化钾试液10ml 密塞 振摇后 在暗处静置10分钟 用硫代硫酸钠滴定液 0 1mol L 滴定 至近终点时 加淀粉指示液 继续滴定至蓝色消失 并将滴定的结果用空白试验校正 每1ml硫代硫酸钠滴定液 0 1mol L 相当于6 088mg的Sb 二 不经有机破坏的分析方法 二 经水解后测定法1 碱水解后测定法三氯叔丁醇 含量测定 取本品约0 1g 精密称定 加乙醇5ml 溶解后 加20 氢氧化钠溶液5ml 加热回流15分钟 放冷至室温 加水20ml与硝酸5ml 精密加硝酸银滴定液 0 1mol L 30ml 再加邻苯二甲酸二丁酯5ml 密塞 强力振摇后 加硫酸铁铵指示液2ml 用硫氰酸铵滴定液 0 1mol L 滴定 并将滴定的结果用空白试验校正 每1ml的硝酸银滴定液 0 1mol L 相当于6 216mg的C4H7Cl3O 1 2H2O 二 不经有机破坏的分析方法 二 经水解后测定法2 酸水解后测定法硬脂酸镁 含量测定 取本品约1g 精密称定 精密加硫酸滴定液 0 05mol L 50ml 煮沸至油层澄清 继续加热10分钟 放冷至室温 加甲基橙指示液1 2滴 用氢氧化钠滴定液 0 1mol L 滴定 每1ml硫酸滴定液 0 05mol L 相当于2 016mg的MgO 二 不经有机破坏的分析方法 三 经还原分解后测定法1 碱性还原后测定2 酸性还原后测定3 利用可游离的金属离子的氧化性测定含量 三 经有机破坏的分析方法 一 湿法破坏二 干法破坏1 高温炽灼法2 氧瓶燃烧法 三 经有机破坏的分析方法 一 湿法破坏凯氏定氮法 Kjeldahlnitrogendetermination 适用 含氨基或酰胺结构的药物原理 含氮药物与硫酸共热 将有机氮转变成无机氨 然后测定氮的含量 三 经有机破坏的分析方法 一 湿法破坏凯氏定氮法双氯非那胺 含量测定 取本品约0 3g 精密称定 照氮测定法 附录 D第一法 测定 每1ml硫酸滴定液 0 05mol L 相当于15 26mg的C6H6Cl2N2O4S2 三 经有机破坏的分析方法 一 干法破坏氧瓶燃烧法适用含卤素或硫 磷等元素的有机药物的鉴别 限度检查或含量测定及药物中杂质硒的检查 三 经有机破坏的分析方法 一 干法破坏氧瓶燃烧法碘苯酯 含量测定 取本品约20mg 精密称定 照氧瓶燃烧法 附录 C 进行有机破坏 用氢氧化钠试液2ml与水10ml为吸收液 俟吸收完全后 加溴醋酸溶液 取醋酸钾10g 加冰醋酸适量使溶解 加溴0 4ml 再加冰醋酸使成100ml 10ml 密塞 振摇 放置数分钟 加甲酸约1ml 用水洗涤瓶口 并通入空气流约3 5分钟以除去剩余的溴蒸气 加碘化钾2g 密塞 摇匀 用硫代硫酸钠滴定液 0 02mol L 滴定 至近终点时 加淀粉指示液 继续滴定至蓝色消失 并将滴定的结果用空白试验校正 每1ml硫代硫酸钠滴定液 0 02mol L 相当于1 388mg的C19H29IO2 第二节定量分析方法的特点 一 容量分析法 1 适用于化学原料药的含量测定 2 容量分析法的有关计算 3 含量测定二 光谱分析法三 色谱分析法 第二节定量分析方法的特点 一 容量分析法的特点装置简单 操作简便 快速 方法耐用性高 测定结果准确 RSD 0 2 专属性差 适用于含量较高的样品分析 常用于化学原料药的含量测定 掌握含量测定的计算公式和方法 第二节定量分析方法的特点 二 光谱分析法 1 紫外分光光度法特点 1 灵敏度高 10 4 10 7g ml 2 准确度高 RSD 2 5 3 仪器价廉物美 操作简便 易于普及 4 应用广泛 第二节定量分析方法的特点 二 光谱分析法 1 紫外分光光度法含量测定方法1 对照品比较法2 吸收系数法3 计算分光分度法 4 比色法 第二节定量分析方法的特点 二 光谱分析法 2 荧光分析法特点1 灵敏度高 10 10 10 12g ml 2 在低浓度溶液中进行 3 在测定供试品溶液时 用基准溶液代替对照品溶液校正仪器的灵敏度 4 用荧光衍生试剂 提高分析方法的灵敏度和选择性 第二节定量分析方法的特点 三 色谱分析法 一 高效液相色谱法特点高灵敏度 10 12 10 15g ml 高选择性 高效能 高速度及应用广泛 第二节定量分析方法的特点 三 色谱分析法 一 高效液相色谱法系统适用性 1 理论板数 2 分离度 3 重复性 4 拖尾因子含量测定方法 1 内标法 2 外标法 第三节药品分析方法的验证 目的证明建立和采用的方法适合相应检测的要求 内容准确度精密度 专属性 检测限 定量限 线性 线性范围和耐用性 第三节药品分析方法的验证 一 准确度 Accuracy 指方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度 用回收率表示 第三节药品分析方法的验证 二 精密度 Precision 指平行测定的各测量值 实验值 之间互相接近的程度 第三节药品分析方法的验证 三 专属性指其它组分可能存在下 采用的方法能准确测定出被测物的特性 第三节药品分析方法的验证 四 检测限 Limitofdetection LOD 指试样中被测物能被检测出的最低浓度或量 第三节药品分析方法的验证 五 定量限 Limitofquantitation LOQ 指试样中被测物能被定量测定的最低量 第三节药品分析方法的验证 六 线性指在一定范围内 试样浓度与响应值呈正比 第三节药品分析方法的验证 七 范围指一种分析方法的精密度 准确度都符合要求的试验结果成线性时供试物浓度的变化范围 第三节药品分析方法的验证 八 耐用性指在测定条件有小的变动时 测定结果不受影响的承受程度 为于常规检验提供依据 药品分析方法验证内容 第四节体内药物分析简介 重要性 为了达到药物在临床上的使用安全 合理和有效 人们越来越要求了解和提供药物在体内的更多信息 即需要对药物及其制剂的体内吸收 分布 代谢和排泄过程 作用机制及药物效应进行研究 因而促使药物动力学 生物药剂学 临床药理学等一些新兴边缘学科的发展与建立 第四节体内药物分析简介 定义 体内药物分析是通过分析手段了解药物在体内数量与质量的变化 获得各种药物动力学参数 代谢的方式和途径等信息 第四节体内药物分析简介 任务 1 进行体内各种体液 组织 器官和排泄物中药物及代谢物的分离测定 2 进行新测定方法的研究 开发 以供临床常规测定之用 3 进行分析质量管理工作 提高测定技术和效率 以便获得迅速 准确 可靠的测定结果 4 进行方法学研究 及时为相关学科的研究提供合理的最佳分析条件与方法 估计 评定各种方法能达到的灵敏 专属和准确的程度 5 参与相关学科研究中对获得的分析结果的阐明工作 使所得的测定数据更有助于说明问题 第四节生物样品分析方法的基本要求 一 样品的种类凡是体内药物到达之处 如各种体液 器官组织和排泄物等 都是体内药物分析的对象 血液是最常用的生物样品 第四节生物样品分析方法的基本要求 一 样品的种类 一 血液 1 血浆全血中加入抗凝剂 肝素 枸橼酸 草酸盐 EDTA等 经离心后取上清液 2 血清全血不加抗凝剂 由血液中纤维蛋白原等影响下 引起血液凝结而析出的澄清黄色液体 离心后取上清液 3 全血加入抗凝剂混匀 以防凝血 第四节生物样品分析方法的基本要求 一 样品的种类 二 尿样尿药测定主要用于药物剂量回收 药物肾清除率 药物体内代谢及生物利用度研究 也可用于乙酰化代谢快 慢型测定等 尿样浓度与血样浓度相关性差 第四节生物样品分析方法的基本要求 一 样品的种类 三 唾液唾液中的药物浓度通常与血液浓度相关 可用唾液中的药物浓度来反应血浆浓度 唾液的采集一般是在漱口后15分钟 收集 离心后 取上清液 第四节生物样品分析方法的基本要求 二 样品的储存血浆和血清都必须在采血后即时分离 否则 血凝后冰冻保存 则因冰冻时引起细胞溶解 而阻碍血浆或血清的分出 同时因溶血而影响药物浓度变化 尿样宜立即测定 否则应加入防腐剂或低温冷藏 第四节生物样品分析方法的基本要求 三 生物样品分析前处理技术微量药物存在于大量生物介质中 若直接进行测定 内源性物质可能干扰 药物浓度太低将会达不到仪器灵敏度要求 因此 生物样品中的药物必须经过分离 纯化与浓集 必要时还需对待测组分进行化学改性处理 从而为最后测定创造良好的条件 第四节生物样品分析方法的基本要求 三 生物样品分析前处理技术 一 蛋白质的去除 二 缀合物的水解 三 有机破坏 四 分离 纯化和浓集 五 化学衍生化法 第四节生物样品分析方法的基本要求 一 蛋白质的去除目的 1 使于蛋白质结合的药物释放出来 以便准确地测定药物及其代谢产物的浓度 2 减免后续溶剂萃取过程中乳化现象3 保护仪器性能 第四节生物样品分析方法的基本要求 一 蛋白质的去除方法1 加入与水混溶的有机溶剂可使蛋白质分子内及分子间的氢键发生变化而使蛋白质凝聚 进而使与之结合的药物释放出来 第四节生物样品分析方法的基本要求 2 加入中性盐可使溶液的离子强度发生变化 能使蛋白质脱水后沉淀下来 离心后可获得含有药物及其代谢物的上层清液 第四节生物样品分析方法的基本要求 3 加入强酸使蛋白质分子的阳离子形成不溶性盐而沉淀 条件是pH值要低于蛋白质的等电点 第四节生物样品分析方法的基本要求 4 加入含锌盐及铜盐的沉淀剂当pH值高于蛋白质的等电点时 蛋白质分子中带负电荷的羧基与金属离子形成不溶性的盐而沉淀 第四节生物样品分析方法的基本要求 酶解法最常用蛋白水解酶 枯草菌溶素可使蛋白质分解而放出药物 第四节生物样品分析方法的基本要求 二 缀合物的水解尿中药物多呈缀合状态 一些含 OH COOH NH3 SH的药物可与内源性物质葡萄糖酸或硫酸形成葡糖酸苷或硫酸缀合物 1 酸水解2 酶水解 第四节生物样品分析方法的基本要求 三 有机破坏尿中药物多呈缀合状态 一些含 OH COOH NH3 SH的药物可与内源性物质葡萄糖酸或硫酸形成葡糖酸苷或硫酸缀合物 1 酸水解2 酶水解 第四节生物样品分析方法的基本要求 四 分离 纯化与浓集1 生物样本的分离与纯化 1 液 液萃取 liquid liquidextraction LLE 2 液 固萃取 liquid solid LSE 第四节生物样品分析方法的基本要求 1 液 液萃取 liquid liquidextraction LLE 亲脂性的药物与强极性的内源性水溶性物质 通过有机溶剂可以除去大部分干扰性物质 注意 1 所用溶剂对被测组分溶解度大 与水不混溶 无毒 化学稳定 不易乳化 常用 乙醚 叔丁基甲醚 氯仿 乙酸乙酯等2 有机相 水相 1 1 2 1 3 水相最佳pH值的选择与药物的pKa有关 第四节生物样品分析方法的基本要求 2 液 固萃取 LSE 优点 1 引入杂质少2 无乳化现象3 萃取效率高 样品用量少4 水作溶剂 安全性高5 速度快 室温下操作缺点 成本高 重现性稍差分类 亲水性 疏水性 第四节生物样品分析方法的基本要求 生物样品在待测组分中的浓集生物样品在萃取过程中 微量待测组分往往分布于较大体积的萃取溶剂中 不能直接供 和 测定 第四节生物样品分析方法的基本要求 五 化学衍生化法1 使样品中的药物转化成具有可被分离的性质2 提高检测灵敏度3 增强药物的稳定性4 提高对光学异构体的分离能力 第四节生物样品分析方法的基本要求 三 生物样品分析方法的验证 一 特异性 二 标准曲线与线性范围 三 精密度与准确度 四 灵敏度 五 稳定性 第四节生物样品分析方法的基本要求三 生物样品分析方法的验证 第四节生物样品分析方法的基本要求 三 生物样品分析方法的验证 一 特异性1 空白生物样本色谱图2 空白样品 标样3 服药后生物样本色谱图 第四节生物样品分析方法的基本要求 三 生物样品分析方法的验证 三 精密度与准确度1 精密度日内精密度 intra day 同一天内 多次测量的精密度 日间精密度 inter day 不同时间内测定结果的变异性 第四节生物样品分析方法的基本要求 三 生物样品分析方法的验证 三 精密度与准确度1 准确度绝对回收率 相对回收率 又称方法回收率 第四节生物样品分析方法的基本要求 三 生物样品分析方法的验证 四 灵敏度1 检测限 LOD S N 3时的被测物的浓度 2 定量限 LOQ 能满足测定 个半衰期时样品中药物浓度或 max的1 10 1 20时的药物浓度 第四节生物样品分析方法的基本要求 三 生物样品分析方法的验证 五 稳定性1 短期室温条件下的稳定性考察长期低温条件下的稳定性考察冷冻 解冻 冻融 稳定性考察 第四节生物样品分析方法的基本要求 三 生物样品分析方法的验证 六 质量控制 样品 七 测定结果详细记录实验过程和结果 思考题 一 简述含金属或含卤素 硫 磷 硒等特殊元素的药物分析前处理方法有哪些 二 简述凯氏定氮法的实验原理 操作过程及适用范围 方法中为何要选用硼酸作吸收液 硼酸吸收液的浓度是否需要标定 所取体积是否必须准确量取 改用硫酸或盐酸用吸收液 行吗 三 简述氧瓶燃烧法的实验原理 装置构成及适用范围 四 简述容量分析法的特点及计算公式 五 紫外吸收光谱有什么特征 哪些特征和常数可作为鉴定药物的定性定量