质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定.ppt

质粒DNA的提取 定量 酶切与PCR鉴定 一 实验流程 简述实验内容流程 质粒DNA提取 约1小时 紫外检测定量知识 计算方法 步骤 紫外检测定量 酶切步骤 酶切约1 2小时 学习酶切原理 琼脂糖电泳原理 电泳 样品 质粒DNA 酶切产物 Marker 约30分钟观察电泳结果 记录 拍照 保存 二 实验目的 掌握碱裂解法提取质粒的方法了解和掌握紫外吸收检测DNA浓度与纯度的原理和测定方法了解质粒酶切鉴定原理学习水平式琼脂糖凝胶电泳 检测质粒DNA的构型 分子量的大小 质粒DNA的提取与定量ExtractionandQuantitationofPlasmidDNA 一 什么是质粒 独立于细菌染色体以外 能独立自主复制的闭合环状DNA分子 基因工程常采用的载体 方法 碱裂解法 煮沸裂解 羟基磷灰石柱层析法 质粒DNA释放法 酸酚法概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂 有机溶剂或碱进行处理及用加热处理所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤培养细菌使质粒扩增 收集和裂解细菌 分离 纯化质粒DNA 二 实验原理 基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的 在pH值高达12 6的碱性条件下 染色体DNA的氢键断裂 双螺旋结构解开而变性 质粒DNA的大部分氢键也断裂 但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离 当以pH4 8的NaAc溶液调节pH值至中性时 变性的质粒DNA又恢复原来的构型 保存在溶液中 而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构 通过离心 染色体DNA与不稳定的大分子RNA 蛋白质 SDS复合物等一起沉淀下来而被除去 三 实验材料 宿主菌 大肠杆菌DH5a菌株载体 PMD 18T质粒插入片段基因 CHD5 CHD5 米尔副教授领导的研究小组发现的CHD5 其编码基因位于1号染色体的特异部分 1p36 当CHD5失去功能的时候 细胞内平时起抑癌作用的系统会被关掉 CHD5如同肿瘤抑制网络的总开关 这提示CHD5与多种人类癌症有关 根据CHD5的调节功能 可以设计更好更有效的癌症治疗策略 此前 这个基因一直是个谜 这项研究对未来的癌症治疗将产生重要影响 提高CHD5的表达量会带来额外的抑癌效果 临床实验中也发现 许多神经胶质瘤患者的CHD5基因缺失 说明CHD5与人类癌症有莫大关系 打开CHD5开关功能的药物可能会对很多种癌症的治疗有效 补充知识 模板基因 BufferS1 细菌悬浮液 已加入RNaseABufferS2 细菌裂解液 BufferS3 中和液 BufferW1 洗涤液 BufferW2concentrate 去盐液 已加入无水乙醇Eluent 洗脱液 一 仪器 恒温培养箱 恒温摇床 超净工作台 台式离心机 高压灭菌锅 二 材料 含pMD18 T质粒的大肠杆菌DH5 三 试剂 LB培养基 液体 固体 AxyPrep质粒DNA小量试剂盒 Axygen BufferS1 50mmol L葡萄糖25mmol LTris Cl pH8 0 10mmol LEDTA pH8 0 2mg mL溶菌酶作用 分散细胞 鳌合金属离子使金属酶失活 BufferS2 0 2mol LNaOH1 SDS作用 细胞壁肽聚糖在碱性下水解 核酸和蛋白质变性 BufferS3 5mol L乙酸钠60ml冰乙酸11 5ml水28 5ml所配成的溶液中钠的浓度为3mol L 乙酸根的浓度为5mol L 作用 酸性条件下质粒DNA复性 变性蛋白 SDS 线性DNA沉淀 Na 可中和DNA 2 离心层析柱 硅基质膜在高盐 低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA 不吸附蛋白质 多糖等物质 通过去洗涤液和去盐液将杂质和其它细菌成分去除 低盐 高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱 四 实验步骤 取1 5ml培养物加入灭菌的Eppendorf管中12 000g 1min 弃尽上清 可用枪头吸尽 加入250 lbufferS1 吹打 悬浮细胞沉淀 悬浮需均匀 不应有小的菌块 加入250 lbufferS2 温和并充分地上下翻转颠倒4 6次混匀使菌体裂解 不要剧烈振荡 直到溶液变得清亮 加入350 lbufferS3 温和并充分地上下翻转颠倒4 6次混匀 12000g 10min离心 小心取上清液 700 800 l 将吸附柱放于收集管中 将上一步所得上清液加入吸附柱中 12000g 1min离心 弃滤液 将制备管放回离心管 加入500 lbufferW1 12000g 1min离心 弃滤液 将制备管放回离心管 加入700 lbufferW2 12000g 1min离心 弃滤液 重复步骤8一次 空柱12000g离心1min 取出吸附柱 放入一个干净的离心管中 在吸附膜的中间加60 l 80 lEluent 室温放置1 3min 12000g离心1min洗脱质粒DNA 20 保存备用 四 质粒定量检测 紫外分光光度计法 原理 1 物质在光的照射下会产生对光的吸收效应2 而且物质对光的吸收是具有选择性的3 各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱 一 质粒定量 紫外吸收检测质粒DNA的浓度和纯度核酸的碱基 G A T C 在260nm处具有强吸收峰 所以通过测定260nm的吸收峰即可对DNA进行定量 260nm时 1A 50 g mLdsDNA 37 g mLssDNA 40 g mLRNA 30 g mLOligo可以通过计算确定双链DNA浓度 公式如下 dsDNA 50 A260 稀释倍数以上浓度单位为 g mL 注 本实验要用的eppendorf公司生产的紫外分光光度计 会根据样品的稀释倍数自动算出质粒DNA的最终浓度和Ratio值 A260 A280可以反应DNA的纯度 可根据在260nm以及在280nm的读数的比值 A260 A280 估计核酸的纯度 A260 A280 1 8 纯净DNAA260 A2801 8 说明有RNA污染 可用RNA酶处理 二 实验仪器 三 实验方法 1 打开仪器电源开关 无需预热 2 根据样品的不同 在仪器控制面版上选择对应的方法组 如测量质粒DNA浓度选 测量RNA浓度选等 以此类推 3 选择进入方法组后 选择你所需要的方法 然后按enter键确认 4 按parameter dilution键设置样品稀释倍数 输入样品的体积和稀释样品所用稀释液的体积 按enter键确认 取质粒DNA样品2 l 98 l灭菌水 5 后推打开仪器上放置石英比色皿的槽盖 6 按照设置的稀释方法 先向石英比色皿中加入对应体积的空白稀释液 然后把石英比色皿放入检测槽 按blank键进行调零 7 再按照设置的稀释方法 向石英比色皿中加入对应体积的样品 并用微量加样器轻轻混匀 8 按sample键 仪器会根据样品的稀释倍数自动计算出样品的最终浓度 注意事项 1 为确保液体始终处于检测区的中心位置 被检测样品的体积必须 50ul 2 为避免石英比色皿受到污染 每次检测样品浓度前后都要用灭菌蒸馏水或去RNase水清洗石英比色皿3 实验结束后 前推盖上检测槽的槽盖 并关掉仪器电源 数据处理 酶切鉴定DNArestrictionenzymedigestion 在一个洁净的1 5ml离心管中混匀下列反应物 混合后37 水浴1 2h 用酶切产物进行电泳注意事项 不要有气泡 并尽量使液体在离心管底部 质粒DNA的酶切分析 总计20ul 限制性内切酶可分为三类 限制性内切酶是DNA操作过程中所使用的基本工具 限制酶的切割位点在识别序列中 有的在对称轴处切割 产生平末端的DNA片段 有的切割位点在对称轴一侧 产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性末端 限制性内切酶 平末端在识别顺序的中心对称轴处切割 5 G G C C3 3 C C G G5 5 G G3 C C C C3 G G5 限制性内切酶 3 端粘性末端在识别顺序的双侧末端切割DNA双链 于对称轴的3 末端切割 5 G G T A C C3 3 C C A T G G5 G G T A C3 C C3 C A T G G 限制性内切酶 5 G A A T T C3 3 C T T A A G5 GC T T A A5 5 A A T T CG 5 端粘性末端在识别顺序的双侧末端切割DNA双链 于对称轴的5 末端切割 5 A A G C T T3 3 T T C G A A5 AT T C G A5 5 A G C T TA 限制性内切酶 CHD5 如 EcoR 和Hind 的识别序列和切口是 EcoR G AATTCHind A AGCTT 双酶切限制酶的选择非常重要 尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶 提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFERBuffer的选择查阅内切酶供应商在目录后的附录中提供的各种酶在不同buffer中的活力表 如果有一种buffer能同时使2种酶的活力都超过70 的话 就可以用这种buffer作为反应buffer 如果两种酶厂家不同无法查时可比较其buffer成份 相似的话可以考虑各取一半中和 酶量的选择任何时候2种酶的总量不能超过反应体系的1 10体积 而且最大反应体系最好不要小于20ul 以TAKARA的为例 其对1单位酶的定义如下 在50 l反应液中 30 温度下反应1小时 将1 g的 DNA完全分解的酶量定义为1个活性单位 U 而该酶浓度约为15单位 微升 在除外酶降解的因素外 该酶可分解15 g的DNA 琼脂糖凝胶电泳DNAagarosegelelectrophoresis 一 琼脂糖凝胶 天然琼脂 Agar 是一种多聚糖 主要由琼脂糖 Agarose 约占80 及琼脂胶 Agaropectin 组成 琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质 不带电荷 琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖 由于这些基团带有电荷 在电场作用下能产生较强的电渗现象 加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果 琼脂糖透明无紫外吸收 因此 目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳 在一定电场强度下 DNA分子的迁移取决于分子筛效应 即DNA分子本身的大小和构型 相对分子质量不同的DNA片段泳动速度不一样 且DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系 凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA 也可以分离相对分子质量相同 但构型不同的DNA分子 一般来说 其中闭环结构泳动最快 其次为线性结构 最慢的可能是单链开环 二 琼脂糖凝胶电泳原理 染色溴化乙锭 EB 3 8 二氨基 5 乙基 6苯基菲啶溴盐 可与DNA结合 在紫外光照射下呈现红橙荧光 有致癌性 Gelview 荧光染料 在紫外光照射下呈现绿色荧光 琼脂糖凝胶浓度与DNA分子的有效分离范围 胶浓度越大 越适宜分离的DNA越小 影响迁移速率因素 1 DNA的分子大小2 琼脂糖浓度3 DNA分子的构象4 电源电压5 嵌入染料的存在6 离子强度影响 三 实验材料 电泳指示剂 核酸电泳常用的指示剂有两种 溴酚蓝呈蓝紫色 二甲苯晴呈蓝色 它携带的电荷量比溴酚蓝少 在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢 Gelview 荧光染料 在紫外光照射下呈现绿色荧光 TBE TBE贮液2L 54gTris base 27 5g硼酸 20ml0 5M的EDTA pH8 0 加水至1L 用钱稀释10倍 琼脂糖 1g5 DNAMarker5000 DNAMarker是分子量不同的DNA片段 主要用途就是DNA分子凝胶电泳时 加样用做对比来检测琼脂糖凝胶是否有问题 应选择在目标片段大小附近ladder较密的marker 这样对目标片段大小的估计较准确 凝胶准备 胶床准备 铺胶 静置 胶床置于电泳槽中 加电泳缓冲液 拔梳子 上样 电泳 取出凝胶 拍照 三 实验步骤 样品准备 将6 lPCR产物 提取的质粒DNA 酶切产物 分别与约为样品体积1 6的loadingbuffer用加样器轻轻混匀 上样 用加样器吸取样品 轻轻的加入到凝胶的样品孔中 盖上电泳槽 接通电源 开始电泳 电泳条件 电压120v 时间25 30分钟 电泳结果分析 紫外检测仪直接观察电泳条带 注意事项 凝胶浓度选择根据样品DNA分子大小而定 所以电泳前应对DNA片段大小有粗略的估计 倒胶时把握好胶的温度 不要高于60 温度太高会使制板变形 胶一定要凝固好才能拔梳子 方向要竖直向上 不要弄坏点样孔电泳前 确认样品孔位于电场负极 点样时枪头下伸 一定不要弄破胶 并且点样孔内不能有气泡 缓冲液不要太多Gelview有毒 切勿用手接触 更不要污染环境 胶勿乱扔紫外线照射不要太久 采用1 琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物 酶切产物以及提取的DNA 四 结果分析 DNA marker 质粒DNA PCR产物 酶切产物 点样顺序 五 实验结果 M DL5000DNAMarker1 4 7 10为质粒2 5 8 11为PCR目的条带 3 6 9 12为酶切片段 温馨提示 防止紫外线对人皮肤及眼睛的损伤 避免直接照射皮肤与眼睛 Gelview是强诱变剂 有致癌性