慢病毒法建立表达外源基因的人前列腺癌稳定细胞株学位论文.doc

慢病毒法建立表达外源基因的人前列腺癌稳定细胞株学位论文 南方医科大学级硕士学位论文慢病毒法建立表达外源基因的人前列腺癌稳定细胞株.课题来源:国家自然科学基金、广东省自然科学基金项目业 称专 名 泌尿外科学学位申请人荆玉明指 导 教 师谭万龙教授主任医师李红卫教授研究员答辩委员会主席 高 新教授答辩委员会成员 刘春晓教授刘久敏教授韦安阳教授赵善超教授论文评阅人 周祥福教授毛向明教授日年月 广州硕士学位论文慢病毒法建立表达外源基因的人前列腺癌稳定细胞株硕士研究生:荆玉明指导教师:谭万龙教授主任医师李红卫教授研究员摘 要研究背景癌症极大的威胁着人类的健康,前列腺癌是成年男性最常见的恶性肿瘤之一,在美国,其发病率居男性恶性肿瘤首位,在我国,其发病率也逐年上升。在对前列腺癌治疗研究过程中存在着一些难题:包括前列腺癌诊断困难以及晚期前列腺痛特别是雄激素非依赖型前列腺癌缺乏有效的可靠的治疗方法。肿瘤的基因治疗策略是通过转入外源基因,激活胞内的相关凋亡通路进而诱导肿瘤细胞的凋亡达到消灭或缩小瘤体的疗效。肿瘤基因疗法一些优点包括靶向性强,对晚期肿瘤有效,全身治疗等。然而,基因治疗也存在着一些难题:凋亡难以持续激活,外源基因转入困难以及缺乏检测手段等。丝裂原活化蛋白激酶是真核细胞信号传导的重要通路,其中作为该家族的亚族之一,参与了细胞内如应激反应、增殖、凋亡等多种生物学过程。在前列腺癌发生、发展的过程中,目前研究发现多种治疗基因通过导入通路诱导前列腺癌细胞凋亡。因此我们设计将外源性的细胞内,并使细胞稳定持续表达,观察该基因过表达时对细胞生长增殖的影响,同时为未来通过该通路的治疗靶点研究提供了工具。将外源基因转入宿主细胞并使其表达的过程中,外源性目的基因的携带载中文摘要体选择成为最关键的技术环节。目前基因治疗中转入基因的载体大体上可以分为两大类:即病毒载体和非病毒载体。非病毒载体常用的方法包括电转移法、磷酸钙共沉淀法以及脂质体法,可以达到瞬时表达的效果。但瞬时表达系统的外源基因表达会随细胞生长繁殖而逐渐降低,且无法传至子代细胞。病毒载体目前常用的包括腺病毒载体,腺相关病毒载体以及慢病毒载体。其中慢病毒载体改造自逆转录病毒,具有以下特点:第一、慢病毒载体既能转导分裂细胞又能转导非分裂细胞;第二、目的基因高效的整合于宿主细胞基因组内实现长期而稳定的表达并可以传代给子代细胞; 第三、不会引起宿主免疫反应;第四,去除了原病毒复制的关键位点,提高了生物安全性。对于前列腺癌的动物实验中,如何监测肿瘤细胞或者肿瘤组织的发生发展的过程成为亟待解决的问题,目前常见的方法包括荧光蛋白法和生物发光法。荧光蛋白作为报告基因,在生物学领域具有广泛的应用领域,成为细胞内分子影像的主流技术。其中远红色荧光蛋白因其激发和发射波长较长,细胞内成像背景低而成为生物发光研究领域的新热点。萤光素酶是一类在有及存在下,催化特定底物产生生物荧光的酶的统称,其发光强度与肿瘤细胞数目、存活率而且与生长状态相关;最有代表性的,可准确定位肿瘤灶,作为报告基因是萤火虫萤光素酶提供了对肿瘤早期、快速、准确、动态的监测手段。综上所述,本文包括两个部分,第一部分是利用慢病毒载体技术,构建包含目的基因的慢病毒载体,建立稳定、持续表达蛋白的前列腺细胞株;第二部分采用慢病毒法构建表达双报告基因即:红色荧光蛋白.萤火虫荧光素酶心?的前列腺癌稳定细胞株,并探索其在构建裸鼠前列腺皮下模型中的应用。一丝裂原激活蛋白激酶基因重组慢病毒载体的构建及其在建立人前列腺癌稳定细胞株中的应用.研究目的基因重组慢病毒载体,包装慢病毒后转导前本研究将构建及鉴定硕士学位论文列腺痛细胞株,建立稳定表达外源性/融合蛋白的人前列腺癌单克隆细胞株/.,初步探索对该细胞株生长的影响,从通路作用的相关基因的进一步研究提供而为 的功能及通过工具。.研究方法.慢病毒载体/构建及鉴定利用酶切、回收片段、再连接的方法构建慢病毒载体,将连接反应混合物转化大肠杆菌,挑取若干单克隆接种于特异性的抗性培养基中,提取重组载体质粒,以/质粒作为对照,双酶切鉴定重组载体。.慢病毒包装和滴度测定按说明书、.及慢病毒载体以.载体作为对照三质粒共转染细胞,转染 后收集细胞上清, / 离心后于.中保存病毒液。采用终点稀释法测病毒滴度枷。病毒滴度的计算公式为病毒滴度/阳性细胞数稀释倍数。.慢病毒转导细胞向细胞内加入总体积山,含山上述包装好的病毒上清及后更换为 后观/的全培, 不含病毒液的全培,察细胞荧光发光。.单克隆细胞株的建立采用有限稀释法建立单克隆细胞株。孔板中每孔含有单细胞的细胞悬液。常规培养天后选取生长状态良好阳性克隆孔,然后逐级扩大培养。. 检测重组细胞株总的表达共纳入三种细胞:/.细胞、.细胞、正常细胞裂解液裂解细胞后,收集上清于.保存,常规方法对样品进行检测。.细胞生长观察分别消化/.细胞、.细胞及正常细胞,细中文摘要胞计数后于孔板内每孔接种个细胞,每种细胞接种块板,每板接种个孔。之后每隔 分别于各板内随机取孔的细胞进行单盲计数并计算每板细胞数的平均值,连续计数 后进行数据统计;利用种细胞每天测量的细胞数的平均值绘制生长曲线。.统计学处理采用 .统计软件,运用重复测量分析方法分别比较实验组/.细胞与对照组.细胞之间的生长速度是否具有统计学差异,.为差异有显著性。.研究结果.慢病毒载体的鉴定慢病毒载体./经和双酶切后在%琼脂糖凝和.胶电泳中条带,其中可见大小约为. 的条带,对照载体/经双酶切后可见约. 和. 的条带,均与预计结果符合,证实载体构建成功。.慢病毒包装及滴度测定转染后 ,在荧光显微镜下观察几乎所有细胞均发出亮度较高的绿色荧光,利用终点稀释法稀释终点为孔和孔,计数两孔内分别共和个阳性细胞,故计算慢病毒滴度为/./。.慢病毒转导细胞慢病毒转导细胞 后荧光显微镜白光下下观察其成上皮细胞形态,生长状态良好。在激发光下,部分整合/融合基因的细胞能发出绿色荧光,荧光较均匀的分布于整个细胞,慢病毒的转导效率较高。.单克隆稳定细胞株建立有限稀释法选取的一株细胞,成上皮细胞形态与正常的未经处理的细胞在形态学上没有明显差异,其生长状态良好,所有细胞均发出绿色荧光,荧光较均匀地分布于整个胞浆。将其扩大培养后保存,命名为/.。. 检测/细胞株总的表达三株细胞的内参表达量基本一致;在 附近,株细胞均出现深浅程度相硕士学位论文近的条带,说明组细胞均表达内源性的蛋白,表达量没有明显差异;同时细胞株还出现了大/左右的条带,为外源性的/融合蛋白,其表达量较高。.细胞生长观察较用同样方法转入外源基因的对照组.细胞株,表达外源性的/细胞株生长速度明显减慢.,说明过表达对于细胞的增殖能力具有抑制作用。.研究结论重组慢病毒载体并利用该载体技术在本实验中,我们成功构建转导细胞;然后通过有限稀释法使细胞单克隆化,进而在荧光显微镜下选择荧光强度较高的单克隆株并通过进行表达鉴定,得到了稳定、高效、均一地表达外源性的前列腺癌细胞株;发现过表达的细胞尽管在细胞形态上没有发生显著改变,但其生长受到明显抑制,这种抑制作用因为蛋白的稳定过表达而长期存在。二慢病毒法建立稳定表达双报告基因的人前列腺癌细胞株.研究目的建立同时稳定表达萤火虫荧光素酶和远红色荧光蛋白双报告基因的人前列腺癌细胞株,体外观察该细胞株生长特性及荧光素酶发光特性,继而利用该细胞建立裸鼠前列腺皮下瘤体模型,观察其体内成瘤后的生长及发光特性,为后续的研究工作提供良好的工具。.研究方法.慢病毒包装及滴度测定按照的操作说明书,将载体、载体.及慢病毒载体?一?三质粒共转染细胞,转染/后收集细胞上清, 离心 后于.中保存病毒液。采用终点稀释法测病毒滴度/。病毒滴度的计算公式为病毒滴度枷阳性细胞数稀释倍数。.细胞培养与最佳筛选浓度确定中文摘要细胞株常规培养并加入浓度分别为咖、 /、 /、/、 /、 /的,设置个复孔及空白对照,每天观察细胞形态变化,每.天更换含有上述浓度梯度的培养基。.慢病毒转导细胞转导前天取对数生长期状态良好的细胞接种于孔板中,转导时加入总体积,含病毒液及/的全培,小时后更换为不含病毒液的全培,小时后观察细胞荧光发光。.单克隆细胞株的建立向转导后的细胞添加并每?天更换含有浓度/的的完全培养基,每天观察细胞形态及荧光发光情况,至大部分无抗性细胞死亡;然后利用有限稀释法挑选生长状态良好、荧光强度较高的阳性克隆孔,在含浓度/的的完全培养基继续扩大培养。.阳性克隆细胞株体外生长及荧光素酶发光特性观察:取阳性克隆.以及普通细胞分别消化后计数,细胞计数后于孔板内每孔接种 个细胞,每种细胞接种块板,每板接种个孔。之后每隔 分别于各板内随机取孔的细胞进行单盲计数并计算每板细胞数的平均值,连续计数 后进行数据统计,利用种细胞每天测量的细胞数的平均值绘制生长曲线。.细胞,以.个细胞每孔倍比稀释接种于孔板中,在活体成像系统中观察单克隆细胞株发光特性,测量每孔相对光子数并比较与细胞数的关系。.裸鼠皮下移植瘤的建立共只约六周龄的雄性裸鼠饲养于级动物房内,随机分为实验组和对照组,每组只做好标记;分别消化计数.以及普通细胞,并重悬于内,每只鼠右侧臀部皮下注射含有个细胞的细胞悬液,其中实验组注射细胞为.细胞,对照组为普通细胞。动物饲养至月时处死,解剖皮下移植瘤,制作病理切片并进行染色后于显微镜下观察。硕士学位论文.瘤体体内生长观察及荧光素酶发光特性观察自肉眼可见的皮下肿瘤形成开始,每天测量各只裸鼠皮下肿瘤的长径与短径计算肿瘤体积,同时在活体成像系统中观察其发光强度变化,至动物处死后停止观察。.统计学处理采用.统计软件,运用重复测量分析方法分别比较阳性克隆.与对照组普通细胞在体外生长速度是否具有统计学差异,.为差异有显著性:比较体外生长时发光强度与细胞数之间的相关性。.研究结果.慢病毒包装及滴度测定三质粒共转染后小时在荧光显微镜下观察细胞,几乎所有细胞均发出亮度较高的红色荧光,说明转染效率较高,病毒包装成功。经过抗生素筛选周后,在巧孔内共出现个阳性克隆,孔内共出现个阳性克隆,故计算慢病毒滴度为?/./。.慢病毒转导细胞慢病毒转导细胞小时后荧光显微镜下观察成上皮细胞形态,生长状态良好。在激发光下观察细胞转导效率较高,整合了目的基因的细胞能发出高亮度的红色荧光,荧光较均匀的分布于整个细胞,能较好地显示细胞的形态轮廓。.单克隆稳定细胞株建立有限稀释法铺板后天,在板中的挑选出的一株单克隆细胞群落,该株细胞生长状态较好,所有细胞均发出亮度较高的红色荧光,将其逐级扩大培养后保存,命名为.。.细胞株体外生长观察及表达特性观察连续天每天分别记录.及正常细胞株的细胞数并取三个孔平均值,利用重复测量的方差分析得到两组细胞生长速度无显著性差异.。在活体成像系统 中观察中文摘要.发光情况,及各组的相对光子数测量值。利用相关分析,得出相对光子数测量值与细胞数呈线性关系严.,.。.裸鼠前列腺癌皮下模型的建立及瘤体病理检测在第三周观察时,裸鼠皮下形成肉眼可见的肿瘤;动物处死时,大体观察,可见实验组与对照组肿瘤瘤体大小以及结构相似,染色后显微镜下观察瘤体细胞成典型的腺癌形态,与对照组相比没有明显差别。.皮下模型体内瘤体生长观察及荧光素酶发光特性观察皮下肿瘤体积随时间逐渐增大,活体成像系统中发现瘤体的发光强度随时间逐渐增加。.研究结论本研究采用慢病毒技术,成功构建稳定表达.双报告基因的激人前列腺癌细胞株:体外观察,其荧光素酶发光强度与细胞数成正比,细胞的生长速度与普通没有明显的统计学差别;在裸鼠皮下注射肿瘤细胞约天后,形成肉眼可见的皮下瘤体,其成长速度与对照组普通前列腺癌细胞没有明显的统计学差异,常规病理切片观察其成腺癌组织形态,恶性程度与对照组相近,荧光发光强度随时间不断增加,为前列腺癌的动物实验提供良好的研究模型。萤火虫萤光素酶前列腺癌皮下移植关键词:慢病毒稳定细胞株红色荧光蛋白瘤硕士学位论文 : ?: . ? . . , . ,. : ., ., : , , . : .,。 .,. . .:,., ,. , . ., :,:;,;,.;,?.,. . ,、. . 勰, ,嬲 , ., 、析, . 、: .: 硕士学位论文 . ./队 . . ./. . . ., / . . . . /, , ,.:. . , 。 甥/. . . . 山 . ., . . ,:/.魁 . .,. /. ,、., . . ,. . .% ././ . . . . ,.:/./. . . ,/ .,. 、析. 弱,. ./纾台 . /./ 、,/ ., .硕士学位论文 ,.,.,. , , .?/, ,一. /. : 仃/. . /, /, /, /, /砌,/. , 。 山“/. ,“. . . . . 一. ?, ,. . ., 、 . .?. .? . . . .,.,. , 埘也 . , .:/./.硕士学位论丈. . ?, . . . . .,. . . .。助,. . .,. . 。. ?. . , ,. .; ;:; ;.硕士学位论文目 录摘 要。前 日 言?.一 吾?.第一章丝裂原激活蛋白激酶基因重组慢病毒载体的构建及其在建立人前列腺癌稳定细胞株中的应用?第一节实验材料.第二节实验方法第三节实验结果?。第四节讨论?.第二章 慢病毒法建立稳定表达双报告基因的人前列腺癌细胞株.第一节实验材料第二节实验方法第三节实验结果第四节讨论?。参考文献?缩略词表读硕士学位期间成果?.致 谢?.学位论文原创性声明统计学证明第一章丝裂原激活蛋白激酶基冈重组慢病毒载体的构建及其在建立人前列腺癌稳定细胞株中的应用?一日 舌癌症极大的威胁着人类的健康,前列腺癌是成年男性最常见的恶性肿瘤之一,在美国,其发病率居男性恶性肿瘤首位。在我国,其发病率也逐年上升。近些年来,不论在基础或临床研究中,对于前列腺癌的治疗方法的研究成为一个活跃的领域。在对前列腺痛治疗研究过程中存在着一些难题:在临床方面,前列腺的发生发展,往往不伴有典型的临床症状或临床症状出现相对较晚,因此许多患者被诊断前列腺癌时已处于肿瘤发展的晚期,而目前对晚期前列腺癌特别是雄激素非依赖型前列腺癌缺乏有效的可靠的治疗方法;在基础研究领域,由于前列腺癌体较小,解剖部位深在,研究过程中缺乏有效、实时的监测肿瘤发生发展以及评价治疗方法的疗效及预后的公认有效的指标。基因治疗 是指通过导入目的基因进入靶细胞或宿主,通过目的基因在宿主中的表达,纠正错误的基因表达和基因表达的错误,以达到治疗目的,肿瘤的基因治疗策略是通过转入外源基因,激活胞内的相关凋亡通路进而诱导肿瘤细胞的凋亡达到消灭或缩小瘤体的疗效。随着人类基因组研究的进展以及分子生物学技术的快速发展,基因治疗已从实验室的研究走入临床的研究,而肿瘤的基因治疗研究也成为世界各国学者研究的热点。究其原因,肿瘤基因疗法拥有以下一些特点:第一,基因治疗的靶向性强,相对放疗、化疗,可以在达到相同或相近疗效的同时造成较轻微的不良反应:第二,对某些放、化疗不敏感的晚期肿瘤仍具有一定的疗效;第三,通过对基因治疗工具的改进达到全身治疗的目的,消灭肿瘤的转移瘤灶,等等。然而,基因治疗虽然拥有以上优势,但目前的研究中存在着一些共有的亟待解决的难点:首先,在激活细胞凋亡通路的过程中,细胞内凋亡信号通路交织成网,单一信号的信号强度相对较弱,凋亡程序往往难以高效、持续的激活:第二,携带兵导入外源基因的载体的限制影响了外源基因的表达以及最后的疗效;第三,难以全程实时的监测肿瘤的发展过程以及治疗后的变化,往往需要通过处死并解剖动物后才能对疗硕士学位论文效进行评价,增加了探索治疗方法以及治疗剂量的难度【】。随着人类基因组计划的不断进展,国内外许多学者在研究肿瘤治疗基因方面取得了巨大进展,利用过表达抑痛基因或敲除原癌基因的策略,许多具有良好疗效的治疗靶点被相继发现。但研究者发现,这些胞内的调控凋亡的基因交织成网络,但对单一靶点的研究仅仅成为该网络的一环,尽管对单一靶点的激活能够具有疗效,往往难以高效、持续的激活凋亡。丝裂原活化蛋白激酶是真核细胞信号传导的重要通路,是细胞促增殖和传递应激信号的关键激酶,该家族包括、等亚族.作为该家族的亚族之一,参与了细胞内如应激反应、增殖、凋亡等多种生物学过程【?。在前列腺癌发生、发展的过程通路广泛参与和调节肿瘤细胞的增殖和凋亡,目前研究发现多种中,通路诱导前列腺癌细胞凋亡【毛们。因此我们设计将外源治疗基因通过导入细胞内,并使细胞稳定持续表达,观察该基因过表达时对性的细胞生长增殖的影响,同时为未来通过该通路的治疗靶点研究提供了工具。将外源基因转入宿主细胞并使其表达的过程中,外源性目的基因的携带载体选择成为最关键的技术环节,如何使目的基因高效、稳定、持续的表达成为一大难题。目前基因治疗中转入基因的载体大体上可以分为两大类:即病毒载体和非病毒载体。早期的研究中,非病毒载体因其可操作性强、技术难度相对低而受到广泛应用,其主要的技术路线为通过物理、化学的方法将携带目的基因的片段如质粒、矾等直接转染细胞,在胞质内利用细胞本身的核糖体对该基因翻译使目的基因表达,常用的方法包括电转移法、磷酸钙共沉淀法以及脂质体法等等。这种直接向胞质内转入外源基因的方法由于直接启动了蛋白质的翻译过程,可以达到瞬时表达的效果,外源基因在几个小时内即可表达。但这些瞬时表达系统的外源基因表达会随细胞生长繁殖而逐渐降低,且无法传至子代细胞。病毒载体是近些年开始应用广泛的载体技术,病毒载体技术将外源基因先包装成某些工具病毒载体内,然后转导靶细胞,目的基因的表达与病毒载体本身的特性一致,所以特别适合作为基因治疗的工具载体。病毒载体目第一章丝裂原激活蛋白激酶基因重组慢病毒载体的构建及其在建立人前列腺癌稳定细胞株中的应用前常用的包括腺病毒载体,腺相关病毒载体以及慢病毒载体。腺病毒载体的表达特性与瞬时表达系统相似,腺相关病毒的能够特异性整合与特定染色体上,有一定的概率实现稳定表达,但整合的概率较氐】。慢病毒载体改造自逆转录病毒,因其独特的生物学性状显示出在基因治疗中的巨大潜力:第一、慢病毒载体既能转导分裂细胞又能转导非分裂细胞;目的基因高效的整合于宿主细胞基因组内实现长期而稳定的表达并可以传代给子代细胞; 不会引起宿主免疫反应;去除了原病毒复制的关键位点,提高了安全性【,】。对于前列腺癌的动物实验中,在监测肿瘤细胞或者肿瘤组织的发生发展的过程,以及治疗后的疗效评价愈合判断时,目前多采取处死动物后对肿瘤组织进行称重、进行病理学、组织学等检测,这种方法只评价了治疗的最终结果,而对治疗过程中肿瘤的变化缺乏有效地判断,因而在难以寻找到最佳的治疗剂量、治疗时间等,对于肿瘤转移灶更缺乏评价的手段,这严重影响了对基因治疗效果的评价。活体动物体内成像是近年来新兴的检测活体动物体内基因表达及细胞活动的光学成像技术,主要采用两种技术即:荧光技术与生物发光技术?。荧光蛋白作为报告基因,在生物学领域具有广泛的应用领域,成为细胞内,分子影像的主流技术。但传统的绿色荧光蛋白的发射光谱局限在激发和发射波长较短,能激发细胞内的某些物质产生荧光,因此细胞内成像时背景较高。近些年,远红色荧光蛋白因其激发和发射波长较长,细胞内成像背景低而成为生物发光研究领域的新热点,其中等在年成功改造出得远红色荧光蛋白,其成熟时间短,亮度高,大大提高了成像时的准确性列。萤光素酶是自然界中能够催化底物产生生物荧光的酶的统称,在哺乳动物体内无内源性表达,检测不受细胞内其他物质影响,并且具有敏感性高,特异性好,反应迅速,操作简单, 检测范围广等优点,作为报告基因为医学、生物学、环境科学等领域的研究提供了一个新工具,其中最有代表性的是硕士学位论文萤火虫萤光素酶 ,。早在年,和就得到了萤火虫萤光素酶的结晶,萤火虫萤光素酶 ,是分子量为的多肽链,有及存在下,催化特定底物产生生物荧光的酶的统称【,。注射过量底物后,通过对其催化底物反应后发射的荧光光子数的测量,反映荧光素酶的相对活性,其活性不仅与肿瘤细胞数目、存活率而且与生长状态相关,它属非分泌性的荧光素酶,可准确定位肿瘤原发部位及微小的转移灶,作为报告基因提供了对肿瘤早期、快速、准确、动态的监测手段。综上所述,本文分为两个部分,第一部分是利用慢病毒载体技术,构建包含目的基因的慢病毒载体,建立稳定、持续表达蛋白的前列腺细胞株,初步探索该基因对肿瘤的作用,为后续研究提供工具;第二部分采用慢病毒法.构建表达双报告基因:红色荧光蛋白.萤火虫荧光素酶.的前列腺癌稳定细胞株,并探索其在构建裸鼠前列腺皮下模型中的应用。第一章丝裂原激活蛋白激酶基因重组慢病毒载体的构建及其在建立人前列腺癌稳定细胞株中的应用第一节实验材料一细胞株、质粒载体和细菌菌株细胞株,前列腺癌细胞株,慢病毒包装系统的工具质粒质粒、.质粒以及慢病毒载体/质粒、?质粒由南方医科大学生物技术学院保存。感受态细菌. 购自公司。二主要试剂及仪器 购于公司,限制性内切酶购于购于,限制酶和连接酶购于, 第一章丝裂原激活蛋白激酶基冈重组慢病毒载体的构建及其在建立人前列腺癌稳定细胞株中的应用公司,高保真聚合酶、 购于公司,普通电泳级琼脂糖、分析纯琼脂糖购于公司,高糖购于,胎牛血清及购于,购于,细胞培养瓶、细胞培养平板购于, 酶标抗体购于, 抗体和抗体购于?,裂解液购于北京鼎国昌盛生物技术公司;倒置荧光显微镜由公司生产。三主要溶液及试剂配制细菌用培养液:双蒸水溶解.胰蛋白胨、.酵母提取, 值调至.,用双蒸水定容至,高压蒸汽灭菌以物和.上后冰箱内保存备用。工作液:在双蒸水中溶解. 、. 、.,值至.,加双蒸水定容至,高压蒸汽灭菌和.后于冰箱内保存备用。./的电泳缓冲液:.秭碱、.冰乙酸和.溶解在双蒸水中,加水定容至,室温保存即可。?所需的溶液:母液. .蒸馏水 溶解后,用浓盐酸调至所需点,最后用蒸馏水定容至,高温灭菌。./.异丙醇溶解后,分装于.离心管中,保存。./.蒸馏水至溶解后,高压灭菌,室温保存。硕士学位论文?一一./.蒸馏水至溶解后,高压灭菌,室温保存。%蒸馏水至。水浴下溶解,室温保存。如在长期保存中出现沉淀,水浴溶化使用。%过硫酸胺过硫酸胺.超纯水.溶解后,保存,保存时间为周。./?.超纯水溶解后,用浓盐酸调至.,最后用超纯水定容至,高温灭菌后室温下保存。./?.超纯水溶解后,用浓盐酸调至.,最后用超纯水定容至,高温灭菌后室温下保存。%/.:丙稀酰胺.甲叉双丙稀酰胺超纯水至 下溶解后,保存。使用时恢复至室温且无沉淀。/ 蒸馏水至混匀后保存。使用液单去污剂裂解液/确/,%?.,:,/.?.一 .蒸馏水至混匀后,保存。使用时,加入至终浓度为./.裂解液。加入./第一章丝裂原激活蛋白激酶基冈重组慢病毒载体的构建及其在建:覆人前列腺癌稳定细胞株中的应用./ .?. / . / 蒸馏水至. / .蒸馏水至高温灭菌后,室温保存。/牛血清白蛋白. / /用. 进行倍稀溶解后,保存。制作蛋白标准曲线时,释成/,保存。%分离胶和%浓缩校%分离胶两块胶, %浓缩胶两块胶,.超纯水.%以.: . .儿确?. / 一?.% %过硫酸胺 “ “加后,立即混匀即可灌胶。./二硫叔糖醇,还原型上样缓冲液./确?.,%,.%溴酚蓝,%甘油./秭?.二硫叔糖醇,.溴酚蓝.甘油混匀后,分装于.离心管中,保存。,./甘氨酸,.%电泳液缓冲液/.甘氨酸.蒸馏水至溶解后室温保存,次溶液可重复使用次。转移缓冲液/ ,/甘氨酸,.%,%甲醇硕士学位论文甘氨酸.甲醇 蒸馏水至 溶解后室温保存,次溶液可重复使用次。丽春红染液.酉春红三氯乙酸磺基水杨酸蒸馏水至使用时将其稀释倍。/嘶?缓冲液 / .,/?.蒸馏水至缓冲液含.%的缓冲液%.混匀后即可使用,最好现用现配。封闭液含%的缓冲液溶解后保存。使用时,恢复室温,用量以盖过膜面即可,一次性使用。/洗脱抗体缓冲液 /.,%,./ .?.超纯水至 配制时,在通风厨内进行。保存。可重复使用次。显影液自来水加热至 以下药品加温水中米吐尔.亚硫酸钠无水 .碳酸钠无水.溴化钾.补水至 配制时,上述药品应逐一加入,待一种试剂溶解后,再加入后一种试剂。保第一章丝裂原激活蛋白激酶基因重组慢病毒载体的构建及其在建矗人前列腺癌稳定细胞株中的应用存。使用时用自来水稀释至倍。定影液自来水 以下药品按顺序加入前者溶解后再加后者硫代硫酸钠亚硫酸钠无水 .冰乙酸硼酸.钾明矾水温冷至。以下时再加入加水定容至,室温保存抗体用稀释至一定浓度使用,每张膜需.四主要生物学软件利用 .统计软件对数据进行统计学分析。第二节实验方法一慢病毒载体. /构建及鉴定.慢病毒载体./的构建使用对/载体进行单酶切并进行平端化处理,再使用对酶切产物进行单酶切并进行琼脂糖凝胶电泳,切胶回收含/融合基和 双酶切后因的小片断;慢病毒载体.经回收含启动子的.大片段,并与/小片段按操作说明进行连接。将连接反应混合物转化大肠杆菌,挑取若干单克隆接种于含氨苄青霉素的培养基中,振摇过夜。各步骤反应体系如下:单酶切,金属浴中反应./质粒 /山,山.山末端平滑化处理,室温下反应,硕士学位论文山 肛酶切产物山乱.山单酶切,金属浴中反应./质粒切割产物 /山,肛.和 双酶切,金属浴中反应.旺.也.质粒/,山 .连接酶连接,反应山 肛待连接线性.慢病毒载体?/的鉴定及各载体的大量制备取 小量提取重组载体质粒,同时以菌液用和 进行双酶切后,琼脂糖凝胶电泳/质粒作为对照,使用鉴定重组载体。取出保存的各载体,转化感受态细菌,在抗性选择性培养基内第一章丝裂原激活蛋白激酶基因重缎慢病毒载体的构建及其在建赢人前列腺癌稳定细胞株中的应用试剂盒对载体进行大量对各菌液扩大培养,然后利用制备,用分光光度法测各质粒浓度将载体保存于冰箱内待用。各步骤反应体系如下:和 双酶切,金属浴中反应.质粒. /山,山山?山琼脂糖凝胶电泳:.制备琼脂糖凝胶:称取琼脂糖,加入电泳缓冲液,待水合数分钟后,置微波炉中将琼脂糖融化均匀。在加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液:加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。.胶板的制备:将胶槽置于制胶板上,插上样品梳子,注意观察梳予齿下缘应与胶槽底面保持左右的间隙,待胶溶液冷却至左右时,加入最终浓度为.微克/毫升的也可不把加入凝胶中,而是电泳后再用./的溶液浸泡染色分钟,摇匀,轻轻倒入电泳制胶板上,除掉气泡;待凝胶冷却凝固后,垂直轻拔梳子;将凝胶放入电泳槽内,加入电泳缓冲液,使电泳缓冲液液面刚高出琼脂糖凝胶面;.加样:点样板或薄膜上混合样品和上样缓冲液,上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于。用止微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内,每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。注意:加样前要先记下加样的顺序和点样量。.电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,的迁移速度与电压成正比,最高电压不超过。当琼脂糖浓度低于.%,电泳温度不能太高。样品由负极黑色向正极红色方向移动。电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范硕士学位论文围降低。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约处时,停止电泳。.观察和拍照:电泳完毕,取出凝胶。在波长为的紫外灯下观察染色后的或已加有的电泳胶板。存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。于凝胶成像系统中拍照并保存之感受态宿主菌的制备冰箱内取出菌涂在不含抗性的平板上,培养过夜。第二天挑选若干单克隆菌落放入含 培基的培养试管中,振摇过夜速度为。于上述培养管内取出菌,加入培基的烧瓶中,以的速度振摇。取出烧瓶,冰浴,然后将菌液离心,温度为,转速为,时间为 ,离心完毕去除上清液。将沉淀物倒置在滤纸上,静置 干燥,而后用预冷的浓度为./溶液重悬菌体,然后继续冰浴。冰浴结束后于,转速离心机内离心,去除上清液,倒置试。管使沉淀物在滤纸上继续干燥用预冷的. 溶液重悬菌体。而后分装,保存于.冰箱。转化事先将恒温水浴的温度调到预热,制冰机准备碎冰屑。从上述的超低温冰柜中取出分装的感受态菌约 ,迅速将其插入冰屑内,静置冰浴。相应的质粒溶液加入上述转化态细菌中,取出需要做转化的质粒,吸取做好标记,轻轻震荡摇匀继续静置冰浴。取出各管,迅速投入水浴中进行热休克,持续时间为分钟,而后迅速放回冰内静置。无抗性培在事先消毒完毕的超净工作台中,向上述各管内各加入第一章丝裂原激活蛋白激酶基因重身慢病毒载体的构建及其在建立人前列腺癌稳定细胞株中的应用养基,轻轻摇动混合均匀,然后转移入玻璃试管内,将各管固定与摇床的弹簧架上,温度为,速度为,继续震荡约.而后在超净工作台内分别取上述混合液 ,均匀涂布与含相应选择性抗菌素的固体平板培养皿中。在涂好的培养皿上标记质粒名称,涂布时间,抗生素名称,先正向放置在恒温培养箱中,到培养皿内的细小液滴消失后,培养皿干燥后,再倒置培养皿,继续与恒温培养箱中培养过夜。第二天观察平板上长出的菌落克隆,挑选菌落间隔合适,菌斑大小适巾的单克隆菌。质粒的大量提取取出菌液,在无菌超净工作台内,吸取菌液,用高温消毒后的玻璃棒将菌液均匀地涂布于含有适当浓度的抗性选择固体培养皿上,将培养皿放置于恒温培养箱中培养过夜。挑取单克隆:第二天在预先消毒的无菌超净工作台内,在上述的培养皿上选择菌落间隔合适,菌斑大小适中的单克隆,用枪头挑取.个合适的单克隆,与含有合适浓度的相应抗性选择性液体培养基混合均匀,标记好菌属类型,质粒名称以及时间等,将试管密封好,放入恒温摇床内,设定转速为,温度为,培养.个小时至菌液浑浊。超净台内,取出适量上述小摇的菌液,计算并以/稀释倍数转接到相应的抗性选择性液体培养液中,做好标记,做好封闭,在恒温摇床上温度为,转速为,培养.小时;其中盛载培养液的锥形瓶的容积至少为液体体积的倍以上以保证足够的氧气。收获菌液:观察菌液浑浊,取出菌液在高速离心机上以的速度离心,观察平底大块细菌沉淀物产生,尽量去净上清,此时若暂停试验,细菌沉淀可以冷冻保存在。细菌重悬:加入的事先已加入的 ,利用斡旋振荡器或硕士学位论文枪头反复吹吸的方法重悬细菌,细菌需充分重悬均匀,才能保证与裂解液充分混合,提高产量,充分重悬的标准为摇动时悬液均一,无可见的细菌团块。细菌碱裂解:向上述重悬液内加入的,细菌上清夜将呈蓝色,立即盖好溶液的盖子,以免空气中的二氧化碳将其酸化。轻轻上下颠倒次以混匀,使溶茵液呈粘稠状,溶液的蓝色均一分布,无可见的无色区,然后在室温放置分钟。中和:用加样器加入冰箱内预冷的,加入后立刻充分混匀,上下颠倒.次,观察悬液的蓝色消失,成无色透明,同时见大量白色沉淀析出,该沉淀为细菌的基因组,所需的质粒在上清液中,试管投入冰浴中保证沉淀形成,然后转移试管于高速离心机上离心,设置温度为,转速为,第一次离心结束后若仍有沉淀物悬浮于上清内,可重复离心一次。离心完毕后,将上清液转移到 中,注意不要将沉淀物加入内,以免堵塞滤孔。将溶菌液倒入 中,室温条件下静置,注意此时不能插入活塞,放置分钟有利于 发挥其最佳作用,放置过程中注意不要摇动。去除 出口处的盖帽,轻轻抽动活塞利用将细胞溶解液过滤到试管中。此时可以保存雎样品用于琼脂糖凝胶电泳鉴定,以确定裂解过程是否顺利进行。在过滤的裂解液中加入. 并混匀,轻轻上下颠倒次,溶解液呈混浊状,之后轻轻将其移至冰浴内分钟,冰浴后可见溶液重新变清亮。柱的预处理:加入于.邱中对平衡,让液体在重力作用下自然流下至完全流尽,同时注意控制时间,保证.内存留少量液体,避免其完全干燥。过柱:将第步得到的过滤溶液加到已经平衡过的.内,让其在重力的作用下自然留下,进入树脂,此时质粒会吸附与树脂膜上,由于温度恢第一章丝裂原激活蛋白激酶摹冈重组慢病毒载体的构建及其在建:莎人前列腺癌稳定细胞株中的应用复, 可能会使溶解液的外观变得混浊,但这种浑浊并不会影响整个操作,过滤完成后可以重复过滤一次,以尽量吸附质粒,提高产量。这一步后留的结合情况。取去除液进行琼脂糖电泳,以检查两清洁:加入珊事先于预热的,此处的预热可以增加质粒纯度,洗涤.柱子两遍。留取山去除液进行琼脂糖电泳,丢弃其他残液。洗脱:加入事先于预热的洗脱柱内的质粒,在重力作用下洗脱,注意此处使用.管收集,而不能使用聚碳酸酯离心管收集,因为之后的步骤中将使用乙醇重沉淀质粒,而聚碳酸酯材料不耐受乙醇。分沉淀:事先配置. .倍体积的异丙醇溶液,然后将溶液加入上述的溶液中,异丙醇会导致的沉淀,小心的混匀溶液以保证沉淀的充分发生,然后立即放置于离心机上高速离心,设置转速为/,温度为,离心时间为,而后轻轻去除上清,注意此时离心后的沉淀比较松散去除上清时注意动作轻柔,切不可将管底的沉淀物去除。清洁漂洗:准备好消毒的无菌工作台,此后的实验步骤需保证无菌,在上述沉淀中轻轻加入浓度为%的.乙醇溶液来洗涤沉淀,注意此处不可用吸管大力的抽吸,以免破坏质粒的结构,充分洗涤后,设置转速为/,温度为,离心,观察管底部形成小块沉淀物,动作轻柔小心地去除上清,避免破坏质粒。在室温条件下干燥?,沉淀不能完全干燥,否则影响溶解过程,注意保证操作过程的无菌状态,而后加入适量 溶液溶解质粒沉淀。 溶解沉淀时轻轻摇动试管,切不可用枪头反复吹吸,以免破坏脆弱的质粒。在弱碱性环境中最适于溶解,在酸性环境中难溶,若难以溶解可将试管放入水浴中,以加快溶解速度。观察管内沉淀消失后,说明溶解完成。保证整个过程的无菌操作。硕士学位论文含量及纯度测定:利用紫外分光光度法和以及琼脂糖电泳法对制取的样品进行含量和纯度的分析。同时对整个过程中保存的样品进行分析,综合判断质粒的产量纯度等质量标准。保证整个过程的无菌操作。最后将制备的质粒保存于.,定期对其进行浓度和纯度检测,保证后续试验的顺利进行。二慢病毒包装和滴度测定.慢病毒的包装细胞常规培养于含%的高糖培养基,%培养箱培养。转染前天,取对数期状态良好的细胞,胰酶消化后调整细胞浓度/,孔板每孔接种 细胞悬液。转染时观察细胞%融合,按说明书、.及慢病毒载体.洳/同时以?载体作为对照三质粒共转染细胞。利用进行转染的步骤如下:转染前分钟,去细胞原培基,换为.固 培养; .至?固 个管中并混匀,室温放置 ;将. 、. 、慢病毒载体加入中另一个管混匀;液与液轻轻混匀后室温放置;然后混合液缓慢轻轻加入细胞孔内:后更换为完全培养基。/转染 后收集细胞上清, 离心 后于.中保存病毒液。.慢病毒滴度的测定采用终点稀释法测病毒滴度/:对细胞进行病毒转导,转导前一天,细胞按/, 每孔的浓度接种于孔板中,同时取出上述收集的慢病毒液于冰箱中过夜融化。转导当天,分别配制终体积为“,病毒做倍稀释的的全培并做好标记,于 后更换为不含病毒上清的第一章丝裂原激活蛋白激酶基因重组慢病毒载体的构建及其在建靠人前列腺癌稳定细胞株中的应用普通全培,期间定期观察细胞的生长状态。 后荧光显微镜下显微镜下观察转导情况,将可出现荧光细胞的最大稀释倍数的两孔定位稀释终点并计数接近稀释终点的两孔的阳性细胞数,取平均值计算病毒滴度。病毒滴度的计算公式为病毒滴度/“阳性细胞数稀释倍数。三慢病毒转导细胞转导前天取对数生长期状态良好的细胞按每孔个细胞接种于孔板中,转导时加入总体积山,含山病毒液及后观察细胞/的全培, 后更换为山不含病毒液的全培,荧光发光。四单克隆细胞株的建立和保存采用有限稀释法建立单克隆细胞株。将转导后的细胞消化计数并调整浓度为个细囤,用玻璃吸管反复吹打细胞悬液使其均匀,然后向孔板中每孔加山细胞悬液,这样理论上实现每个孔内个单细胞。继续常规培养天,定期观察细胞状态,期间可更换细胞培养基。待细胞长成明显的群落时,在荧光显微镜下观察荧光发光的情况,并选择单克隆群体生长、生长状态良好、细胞形态无明显改变、荧光强度较高的阳性克隆孔,经胰酶消化后转移至孔内继续培养,然后依次逐级扩大培养。待细胞数量培养至一定数量后,选取生长状态良好的细胞进行细胞的冻存。五检测重组细胞株总的表达为检测我们构建的单克隆细胞株表达基因的情况,我们共纳入三种细胞进行比较即/.细胞、.细胞、正常细胞,后面两种细胞作为阴性对照。各细胞株均取对数生长期状态良好的 个细胞每孔接种于孔板中,培养后按下列步骤进行.试验:预冷的.、收集蛋白:每孔细胞加.。将弃净后把培养瓶置于冰上。按裂解液加 ,摇匀置于冰上。要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。每孔细胞加山含的硕士学位论文裂解液,于冰上裂解,为使细胞充分裂解培养板要经常来回摇动。裂解完后,用枪将细胞碎片和裂解液移至.离心管中。于。下离心。将离心