怎样选择色谱柱_液相色谱柱的种类与方法开发.ppt

液相色谱柱的选择和方法开发 奥秘科技 AUMITechnologies US 内容概要 色谱基本概念回顾色谱柱类型 选择和方法开发 色谱基本概念回顾 色谱 chromatography 色谱原理色谱分类 气相 液相和高效液相 HPLC 反相 正相 离子交换 HILIC 混合固定相色谱功能 分析 种类 定量 纯化液相色谱仪器结构及功能 泵 脱气机 混合器 进样器 阀 色谱柱 柱温箱 检测器 流通池 分离度 Rs ResolutionN TheoreticalPlateNumber Selectivityk RetentionFactor拖尾 1 SeparationofCompoundsAandB 灵敏度 LimitofDetection LimitofQuantification 柱效 峰形 拖尾因子 重现性 分离度 保留时间 选择性 柱效 灵敏度 色谱柱类型 选择和方法开发 色谱柱与色谱条件对色谱性能的影响 分离度 选择性 键合类型 基质表面特性 流动相 温度 柱效 保留体积 粒径 柱长 基质表面特性 流动相 温度 上样量 流速峰对称性 基质表面特性 键合类型 流动相 温度保留体积 柱长 孔隙率 比表面积 基质表面特性 键合类型 流动相 温度灵敏度 粒径 基质表面特性 键合类型 流动相 温度稳定性和重现性 基质表面特性 键合类型 流动相 温度流动相 pH 缓冲盐种类 溶剂 影响色谱柱性能的主要因素 1 色谱柱的构型色谱柱内径色谱柱长度2 固定相柱填料粒径比表面积孔径孔隙率基质表面特性 表面活性 硅胶纯度 硅羟基的酸性 均匀性和数量 耐碱性键合类型 官能团 是否封尾 键合相的保留行为 耐酸性 色谱柱的构型对色谱柱性能的影响 色谱柱的构型对色谱柱性能的影响 长度和直径 色谱柱尺寸对色谱分离的影响 短柱 15 100mm 运行时间短 柱压低 长柱 150 250mm 分辨率高 运行时间长 窄径柱 2 1mm 满足检测器和样品量限制 宽径柱 3 7 8mm 载样量高 抗污染 寿命制备柱 内径 10mm 用于纯化制备 柱填料对色谱柱性能的影响 柱填料对C18色谱柱性能的影响 粒径 硅胶粒径和类型对柱效的影响 d 硅胶粒径和类型对压力的影响 柱填料对C18色谱柱性能的影响 粒径II 目前市场主要可供选择的填料粒径1 7 m 1 8 m 2 2 m 快速液相色谱柱 匹配快速色谱仪2 7 m 多孔壳层 在常规液相色谱仪上实现快速分离 Halo 3 0 m 3 5 m 普通快速分析5 0 m 常规分析 颗粒越小 柱效越高 但是耐污染性能下降 柱压升高 柱填料对C18色谱柱性能的影响 比表面积 每克填料的表面积 与粒度 孔径有关比表面积大 保留增加 载样量增加 平衡时间增加 梯度洗脱尤为注意 根据需要选择合适的比表面积 柱填料对C18色谱柱性能的影响 孔径I 多孔材料的95 以上表面在孔内部样品分子直径小于平均孔径 才能进入微粒内部孔径至少是样品流体学直径的4倍300 孔径用于 超过50个氨基酸的肽或25个残基的低聚寡核苷酸 样品分子直径小于平均孔径 才能进入微粒内部 柱填料对C18色谱柱性能的影响 孔径II 由于小孔径填料比表面积大 小分子的保留值在小孔径填料通常更大 条件 C8色谱柱 4 6 150mm 3 5um A溶剂 0 1 TFA水溶液 B溶剂 0 1 TFA于80 乙腈 水中 20min梯度 1030 B 60 C 1 5ml min 柱填料对C18色谱柱性能的影响 硅胶纯度I 2 3 二羟基萘 2 7 二羟基萘 TF 1 31 BrandW AQColumn5 m 4 6mm 150mm BrandZ C18Column5 m 4 6mm 150mm VenusilMPC185 m 4 6mm 150mm BrandH C18Column5 m 4 6mm 150mm BrandU C18Column5 m 4 6mm 150mm TF 1 42 TF 1 39 TF 1 69 TF 流动相 甲醇 水 65 35流速 1mL min温度 35 检测波长 230nm进样量 20 L 硅胶纯度 金属含量 硅胶基质类型及发展史 TypeA 原料来源 水玻璃 高金属含量 高活性 极性化合物容易形成拖尾和死吸附TypeB 原料来源 有机硅烷 四乙氧基硅烷 水解 烧结 酸洗杂化及表面杂化整体柱壳层柱 柱填料对C18色谱柱性能的影响 硅胶纯度II 硅胶纯度 金属含量 d 固定相对色谱柱性能的影响 硅羟基的影响 残余硅羟基的影响普通硅胶当流动相的pH值大于4 5 5 0时 表面的硅羟基会带负电荷 碱性化合物拖尾 解决方法封尾双层表面修饰表面杂化 固定相对色谱柱性能的影响 残余硅羟基的影响 封尾键合填料与小硅烷进行后续反应 如三甲基氯硅烷 反应掉部分残余硅羟基 以增加表面覆盖率 缺点 不能完全反应 仍有50 的硅羟基未被反应 在pH 3时 TMS易流失 耐用性 稳定性不好 TMS 固定相对色谱柱性能的影响 残余硅羟基的影响 不同长度和体积的键合相对表面覆盖率的影响 固定相对色谱柱性能的影响 残余硅羟基的影响 双层表面修饰降低表面硅羟基活性 硅胶表面更加均匀 固定相对色谱柱性能的影响 残余硅羟基的影响 硅胶双层表面修饰后新增加表面层硅羟基活性更低 新硅羟基pH 5 2 普通硅羟基pH约为3 5更对称的峰型 提高柱效 提高灵敏度硅胶表面更均匀 硅胶微晶形成过程中的不光滑表面被覆盖重现性更好表面纯度更高 硅胶金属杂质被覆盖极性化合物保留和分离更好 键性化合物峰形对比 Testconditions Columndimension 4 6mmx150mmSample doxepin nortriptyline trimipramineamitriptylineMobilephase Acetonitrile 0 01Msodiumphosphate pH 6 70 30Temperature 30oCFlow 1mL minDetection UV254nm BrandAC18 non endcapped C18 non endcapped twin layer ASBC18 ZorbaxSBC18 SaponinsExtract 4 6x150mmcolumn 1 formicacid MeOH 80 20 固定相对色谱柱性能的影响 残余硅羟基的影响 双层表面修饰代表产品 StableBondC18 PolarBondC18 SurfBondC18 0 01ng mLPseudoephedrine AUMIBauloStableBondC18 2 1 50mm 5 m BrandAC182 1 50mm 5 m PhenomenexLunaC18 2 0 50mm 5 m 固定相对色谱柱性能的影响 键合类型 A纵向交联 保留和选择不稳定B横向交联 宽pH适用C单体键合 重现性好 柱效高D单体 空间保护 低pH稳定 极性官能团嵌合反相固定相 固定相对色谱柱性能的影响 基质表面特性 键合类型 反相键合相的保留行为 同一厂家相同硅胶基质的反相柱 保留值随含碳量的增加而增加比表面积越大 保留值越大键合碳链越长 保留越大C18C8 C3 C1 长链之间差别不大 反相键合相的保留行为 不同厂家色谱柱的保留值 选择性与峰型色谱柱 4 6 150mm 流动相 乙腈 0 05M磷酸钾缓冲液 pH3 2 65 35 流速 1ml min 拖尾峰 T0 尿嘧啶 P 吡啶L 苯酚N N N 二甲基苯胺B 4 丁基苯甲酸J 甲苯 固定相对色谱柱性能的影响 基质表面特性 键合类型 键合相的稳定性 键合相的稳定性低pH值 键合相流失高pH值 硅胶溶解影响色谱柱寿命 方法不重现 键合类型对键合相稳定性影响 低pH值 键合相流失 键合类型对键合相稳定性影响 II 空间位阻保护 延缓键合相流失 固定相对色谱柱性能的影响 键合硅胶的稳定性 高pH值 硅胶基质溶解 pH9时 色谱柱的稳定性 固定相对色谱柱性能的影响 键合硅胶的稳定性 碳杂化 延硅胶缓高pH值水解 杂化颗粒 WatersXterra 表面碳杂化示意图 pH 12条件下的稳定性 4amines ACN 1 Ammoniaaqueous 25 75 40oC 4 6x150mm 5um 1h 200h 总结 如何选择色谱柱和相应的色谱条件 了解目标化合物的性质 结构 官能团 pKa 分子量 浓度范围 溶解度 极性了解色谱柱的性质粒径 孔径 比表面积 保留强度和柱效 抗污染性基质表面特性 键合类型 保留强度 选择性 柱效 对称性 灵敏度 稳定性和重现性选择相应的色谱条件 色谱柱选择 替代 粒径 比表面 基质表面特性 键合类型相似新方法开发 粒径 2umvs3umvs5um 分析时间 灵敏度 仪器 价格 寿命 内径 柱长 内径3mmvs4 6vs7 8 对分离影响不大 成本 柱长与粒径相关 比表面 低比表面耐污染 高比表面利于分离 孔径 在满足比表面前提下大孔径较好 硅胶基质表面特性