RNA干扰的作用机制及小干扰RNA的合成方法.doc

RNA干扰的作用机制及小干扰RNA的合成方法RNA干扰（RNA interference，缩写为RNAi）是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默1。与其它基因沉默现象不同的是，在植物和线虫中，RNAi具有传递性，可在细胞之间传播，此现象被称作系统性RNA干扰(systemic RNAi)2,3。在秀丽隐杆线虫上实验时还可使子一代产生基因突变，甚到于可用喂食细菌给线虫的方式让线虫得以产生RNA干扰现象。RNAi现象在生物中普遍存在。1. RNAi的作用机制 目前关于基因沉默的假说认为，转录后水平的基因沉默，主要包括起始阶段、效应阶段和倍增阶段。1.1起始阶段外源性导入或由转基因、转座子、病毒感染等多种方式引入双链核糖核酸(dsRNA)， 在细胞内特异性与RNA酶(RNAase核酸内切酶) Dicer结合，dsRNA被切割成2123nt长度的带有3端单链尾巴及磷酸化的5端的短链dsRNA，即小干扰RNA(siRNA)。1.2效应阶段双链siRNA可以与含Argonauto（Ago）蛋白的核酶复合物结合形成RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）并被激活。在ATP供能情况下，激活的RISC将siRNA的双链分开，RISC中核心组分核酸内切酶Ago负责催化siRNA其中一条链去寻找互补的mRNA链，然后对其进行切割。反义链先与同源mRNA配对结合，然后RISC在距离siRNA 3端12个碱基的位置将mRNA切断降解，从而阻止靶基因表达，使基因沉默1。1.3 倍增阶段siRNA在RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)的作用下，以mRNA为模板，siRNA为引物，扩增产生足够数量的dsRNA作为底物提供给Dicer酶，产生更多的siRNA， 可再次形成RISC，并继续降解mRNA，从而产生级联放大效应。并作用于靶mRNA。如此反复倍增，从而使RNAi的作用进一步放大。因此少量的siRNA就可以产生高效的基因沉默效果4。2.RNAi的设计及合成2.1siRNA的设计 设计高效率的siRNA首先要通过NCBI、DDBJ、BMBL这3个基因序列数据库，检索相关的基因序列，获得靶向mRNA或cDNA序列，再就是合理设计siRNA。常规siRNA的设计原则是以成熟的mRNA为标准，若以DNA序列为参照，则最好选择cDNA转录区+50到+100以后的下游序列，两端的非翻译区不作为siRNA设计依据。siRNA二聚体的正义链和反义链各含21nt为佳，3端为突出末端。3凸端为尿苷(U)，5凹端为腺苷(A)的mRNA序列应作为首选。进行Gen-Bank BLAST查询，确保所选siRNA编码不与其它基因同源5。不是mRNA的所有亚单位都能形成有效的siRNA，大约有60%70%可以发挥沉默效应， 这是由于5和3-UTR有丰富的调控蛋白结合区域，产生UTR结合蛋白或翻译起始复合物均可能影响RISC结合mRNA，从而影响siRNA的效果，所以沉默效应率差异较大，针对一个靶基因需要设计34条siRNA，以保证能够筛选出一条有效序列6。2.2iRNA的合成方法制备siRNA的方法主要有化学合成法、体外转录法、酶消化法、体内转录法等。当已经找到最有效的siRNA时，适合以核苷酸单体为原料，通过化学方法合成两条互补的长约2123 nt的RNA单链，然后退火形成双链复合体，这种方法所获得的产物纯度、干扰效率高，合成简单，但是制备周期长，作用时间短，而且价格昂贵限制了其应用和推广7。体外转录法8是以两段互补的DNA为模板， 在针对靶序列的正义链和反义链上游接上T7启动子，使用T7 RNA聚合酶，各自在体外转录获得两条单链RNA，将两条单链退火后形成双链RNA，然后用RNA酶消化，所得产物经纯化后就是所需的双链RNA，此方法适用于筛选有效的siRNA，但不适用于对特定siRNA进行长期研究。酶消化法9是先在体外化学合成2001000 完整的目的基因长片段dsRNA， 用细胞内形成的siRNA关键酶-Dicer酶或者RNase进行消化，即可得到各种不同的针对同一目的基因的不同位点的siRNA混合物，然后将混合物转染至细胞内，能得到较高的抑制效率。该方法抑制率高，且省时省力， 但此法产生的混合物可能导致非特异性抑制，另外在体外转录长链RNA有困难，Dicer酶费用较高，此方法不适用于长时间的研究项目，或者是需要一个特定的siRNA进行研究，特别是基因治疗。体内转录10是将siRNA的质粒、病毒表达载体或带有siRNA表达盒的PCR产物转入细胞，由细胞表达产生RNA干扰作用。siRNA表达载体常用能在哺乳动物细胞中表达shRNA的含有RNA聚合酶(pol)启动子的载体 ，通过转染含有RNA聚合酶II/III的启动子U6或H1，及其下游一小段特殊结构的质粒或病毒载体到宿主细胞内，转录出shRNA，该RNA在细胞内被Dicer酶剪切成siRNA而发挥作用。该方法的优点是细胞特异性强，适用于基因功能的长时间研究。 siRNA表达框(siRNA expreion caettes，SECs)是一种由PCR制备的siRNA表达模板，可直接转入细胞进行表达而无需事先克隆到载体中。利用引物延伸法进行PCR，产生包含1个RNA聚合酶III启动子U6或H1、一小段编码shRNA的DNA模板和1个RNA聚合酶III终止位点的表达框架，然后直接转染到细胞内。该方法为筛选有效的siRNA片段和合适的启动子提供了较为便捷的工具。其主要缺点是PCR产物转染细胞的难度大，如有转染试剂能提高SECs的转染效率，这一方法将得到更为广泛的应用。参考文献1Fire A, Xu S, Montgomery M, Kostas S, Driver S, Mello C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.J Nature. 1998, 391 (6669): 806-11.2Winston, William M. Systemic RNAi in C. elegans Requires the Putative Transmembrane Protein SID-1.JScience. March 2002, 295: 2456.3Jae-Yean, Kim. Regulation of short-distance transport of RNA and protein.J Current Opinion in Plant Biology. February 2005, 8: 45.4PD. Z. RNA interference: Listening to the sound of silenceJ.Nat Struct Biol，2001，8(9)：746-750.5 ELBASHIR SM，HARBORTH J，WEBER K， et al. Analysis of gen function in somatic mammalian cells using a small interference RNAs J.Methods in Enzymology，2002，26：199-213.6 D. G. Small silencing RNAs:state-of-the-artJ.Adv Drug Deliv Rev，2009，61(9)：672-703.7 R. M. Small interfering RNAs and their chemical synthesisJ.Angew Chem Int Ed Engl，2002，41 (13)：2265-2269.8BRUMMELKAMP TR，BERNARDS R，R. A. A system for stable expreion of short interfering RNAs in mammalian cellsJ.Science，2002，296：550-553.9MYERS JW，JONES JT，MEYER T， et