PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳讲义(工艺实验).doc

t-PA基因的PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳实验讲义一、 实验目的 1、掌握PCR反应的原理和方法； 2、掌握琼脂糖凝胶电泳分离和鉴定DNA的原理和方法。二、实验原理 PCR原理：首先使双链DNA在反应液中热变性而分开成单链，然后在低温下与两个引物进行退火。使引物与单链DNA配对结合，再在中温下利用TaqDNA聚合酶的聚合活性及热稳定性进行聚合反应。每经过一次变性，退火，延伸三个步骤为一个循环，通过三个不同温度的重复循环，在经过约30次后，所扩增的特定DNA序列的数量可增至10000000倍，由于一轮扩增的产物又充当下一轮扩增的模板，所以在这周而复始的过程中每完成一个循环，就基本上使目的DNA物增加一倍。 变性（denaturation）：双链DNA在9296变性成单链DNA。 退火（annealing）：引物在45-72与模板的互补区域相结合。 延伸（extension）：在72条件下DNA聚合酶将dNTP连续加到引物的3-OH端，DNA链的延伸方向为5-3。 DNA琼脂糖凝胶电泳原理：DNA分子在碱性环境中带负电荷，外加电场用下，向正极泳动。不同的DNA片段由于其由荷、分子量大小及构型的不同，在电泳时的泳动速率就不同，从而可以区分出不同的区带，电泳后经溴乙锭（EB）染色；在波长254nm紫外光照射下，DNA呈现橙红色荧光。 琼脂糖凝胶电泳所需 DNA样品量仅为 0.5-0.1g，溴乙锭检测 DNA，灵敏度很高，10mg或更少的DNA即可检出。三、实验仪器 超净工作台、回转式恒温调连摇瓶机、培养箱、冰箱、深冷冰箱（-70）、冷冻离心机、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、紫外凝胶成像系统、紫外分光光度计、恒温水浴锅、移液器、微波炉。 四、实验药品 蛋白陈、酵母粉、氯化钠、琼脂、氯仿、异戊醇、异丙醇、琼脂糖、饱和酚、氯化苄、CTAB、臭酚蓝、醋酸钠、DL2000Marker、TaqDNA聚合酶、Pfu酶、Dntp、Tris、HCl、Tris-HCl、葡萄糖、NaOH、乙醇、乙酸钾、冰乙酸、蔗糖、ddH2O、EB、EDTA、SDS、引物。五、实验内容 本实验为综合性实验，主要从以下几方面开展。1、设计PCR反应系统 根据 PCR反应系统的组成和要求，设计 20L或 50L的反应体系，可以下表1提供的50L的PCR反应体系为参考。 表 1 PCR反应体系组分原液浓度加量（L）终浓度Buffer1051dNTP10mmol/L10.2mmol/L引物15mol/L10.1mol/L引物25mol/L10.1mol/LTaq酶5U/L0.20.2 U/L模板DNA0.218mg/L14.36g/LMgCl27DdH2O33.8总体积502、进行PCR反应 PCR反应过程学生自行设计，可参考下列提供的PCR反应条件：94，5 min（热启动）；94，1min（变性）；52，1min（退火）721.5min（延伸）；循环30次；72，10min；保温湿度；4。3、对PCR反应产物进行水平板琼脂糖凝胶电泳分离和鉴定 将PCR反应产物通过水平板球脂糖凝胶电泳进行分离和鉴定，琼脂级凝胶电泳的具体方法如下：1）根据所需浓度称取一定量的琼脂糖。加入一定量的1TAE或其它缓冲液，加热使琼脂糖溶解。2）溶液冷至60时，若需要，则加入溴乙锭至终浓度为0.5g/mL（也可以在电泳之后再进行染色。）。3）琼脂糖倒入制胶模具，凝胶厚度一般为0.3-0.5cm。迅速在模具一端插上梳子，检查有无气泡。4）室温下放置30-45min后，琼脂糖溶液完全凝固，小心取出梳子将凝胶放置于电泳槽中。5）加入电泳缓冲液至电泳槽中，让液面高于胶面1mm，凝胶两端的电压与外加电压相等。6）在DNA样品中加入16的上样缓冲液，混匀后，离心聚集液体，使溶液全部汇集于管底部，用移液枪将加样混和液加入样品孔中。7）接通电泳槽与电泳仪的电源，电压降选择l5Vcm。8）根据指示剂迁移的位置来断定是否终止电泳，切断电源后再取出凝胶，未加EB的凝胶需要在含有 EB的缓冲液中浸泡约 2025min。9）取凝胶在凝胶成像系统中检测电泳结果。 t-PA是组织型纤溶酶原激活剂，由527个氨基酸组成。t-PA cDN