抗生素精品课件d氨基酸氧化酶基因工程菌诱导发酵实验

D 氨基酸氧化酶基因工程菌诱导发酵实验 一 选题的意义两步酶法合成7 ACA的研究 两步酶法合成7 ACA 是指头孢菌素C CPC 首先在DAO的催化下氧化脱羧反应生成戊二酰 7ACA GL 7ACA GL 7ACA再由GA催化 脱酰基生成7 ACA 整个过程的流程参见Fig 1 因此 两步酶法转化CPC合成7 ACA的研究 离不开对DAO和GA的研究 Fig 1EnzymeticconversionofcephalosporsionCPCto7 ACA 半合成头孢类抗生素 是类高效 广谱性抗生素 被广泛应用于治疗细菌感染 具资料统计 以青霉素和头孢菌素为代表的Beta 内酰胺类抗生素 销售额已占临床抗生素世界销售总额的70 左右 前者占20 后者占52 由于在世界范围内 对半合成头孢菌素类抗生素的广泛需求 致使医药市场上对合成头孢类抗生素的前体 7 氨基头孢烷酸 7 ACA 的需求量持续增长 意义 D 氨基酸氧化酶的研究进展 DAO是一种黄素腺嘌呤二核苷酸为辅基典型的黄素蛋白酶 它是由两个相同的亚基与一分子FAD螯合在一起形成的有功能的蛋白质 DAO作用于CPC的7位D型a 氨基己二酰側链 催化CPC氧化脱氨形成过氧化氢和a 酮基己二酰 7ACA AKA 7ACA再被过氧化氢氧化脱羧生成GL 7ACA 次后 由于GA的发现 应用该酶可将GL 7ACA进一步酶促水解而得到7 ACA DAO是这些反应的第一个酶 它在工业生产中的重要性进一步被认识 DAO基因的表达的研究 DAO在大肠杆菌中表达 需IPTG或乳糖诱导 胞内表达 优点是发酵周期短18 20h 在毕赤酵母表达DAO 组成型的分泌表达 避免过氧化氢酶的影响 Fig3 ExpressionofdaogeneinE coliinducedwithIPTGLane1 2Theprecipitationof6 His N Lane3 Theprecipitationof2 His N Lane4 Theprecipitationof6 His C Lane5Thesupernatantof6 His N Lane6Thesupernatantof2 His N Lane7Thesupernatantof6 His C 三 His Tag亲和柱纯化D 氨基酸氧化酶收集菌体40g加入pH7 0 30ml磷酸buffer 用Frenchpressurecellpress 1000psi的压力下压榨细胞两次 离心取上清加入5gCo Agarose 10oC 160rpm振摇24h 装柱然后用50 100倍柱床体积的Washbuffer流洗柱1ml min 直到洗出液OD595小于0 06 然后用Elutionbuffer洗脱流速为0 5ml min 得到的酶液直接用于固定化 酶活的回收率为36 2 纯度为99 1 三 His Tag亲和柱纯化D 氨基酸氧化酶收集菌体40g加入pH7 0 30ml磷酸buffer 用Frenchpressurecellpress 1000psi的压力下压榨细胞两次 离心取上清加入5gCo Agarose 10oC 160rpm振摇24h 装柱然后用50 100倍柱床体积的Washbuffer流洗柱1ml min 直到洗出液OD595小于0 06 然后用Elutionbuffer洗脱流速为0 5ml min 得到的酶液直接用于固定化 酶的回收率为36 2 纯度为99 1 Fig 4SDSPAGEofpureDao1 3ml 2 6ml 3 9ml 4 12ml 5 15ml 6 18ml 1 发酵过程中菌生长曲线 Fig