北大基础医学生物化学ppt课件 重组dna技术

重组DNA技术 RecombinantDNATechnology 刘新文 北京大学医学部生物化学与分子生物学系 第一节概述 DNA克隆 DNAcloning 应用酶学的方法 在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子 复制子 继而通过转化或转染宿主细胞 筛选出含有目的基因的转化子细胞 再进行扩增 提取获得大量同一DNA分子的过程 DNA克隆又称基因克隆 genecloning 基因工程 geneticengineering 实现基因克隆所采用的方法及相关的工作 又称重组DNA技术 recombinantDNAtechnology 一 克隆体系 目的基因 载体DNA 工具酶 宿主细胞等 1 目的基因 targetgene cDNA或基因组DNA 2 载体 vector 质粒 噬菌体 柯斯质粒载体 病毒和人工染色体等 cDNA complementaryDNA 指体外经反转录合成的 与RNA 常指mRNA 互补的单链DNA 单链cDNA进而合成双链cDNA 基因组DNA genomicDNA 代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列 称为基因组DNA 质粒 plasmid 存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子 在细胞中可以独立进行复制并在细胞分裂时恒定地传给子代细胞 3 1限制性核酸内切酶 restrictionendonuclease 存在于细菌体内 能够识别和切割双链DNA内部特定核苷酸序列的一类核酸酶 3 工具酶 限制性核酸内切酶 连接酶 DNA聚合酶 逆转录酶 碱性磷酸酶 末端聚合酶 RNA酶 DNA酶 等 常用的是II类限制性内切酶 许多限制性核酸内切酶II的识别序列属于回文结构 配伍末端 compatibleend 不同限制性内切酶产生的相同粘性末端 3 2DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶I 全酶 Klenow片段 Klenow酶 T4DNA聚合酶以及Taq酶等 3 3DNA连接酶T4连接酶 可用于粘端与平端的连接 4 宿主细胞 大肠杆菌 酵母 动物细胞 第二节DNA克隆的基本过程 分 切 接 转 筛 表达 一 分 目的基因及载体的制备 1 分离基因的方法 化学合成 PCR 基因组文库 cDNA文库 聚合酶链反应 polymerasechainreaction PCR 在反应体系中加入模板DNA dNTP 特别设计的特异引物及耐热的DNA聚合酶 常用Taq酶 经多次变性 退火 延伸循环反应 使目的DNA呈指数合成的过程 cDNA文库 cDNAlibrary 以mRNA为模板 利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA 再复制成双链cDNA片段 与适当载体连接后转入受体菌 这些受体菌包含了所有cDNA信息 总称cDNA文库 常用于筛选编码蛋白质的结构基因 基因组DNA文库 genomicDNAlibrary 利用限制性核酸内切酶将组织或细胞染色体DNA切割后 与适当载体连接后转入受体菌 这些受体菌包含了所有基因组DNA信息 总称基因组DNA文库 2 常用载体 质粒 噬菌体 病毒DNA 克隆载体 cloningvector 用于目的基因的克隆 扩增 序列分析和体外定点突变等 表达载体 expressionvector 用于在宿主细胞中表达外源目的基因 获得大量表达产物 二 切 限制性内切酶切割目的基因和载体DNA 三 接 重组体的构建 四 转 重组DNA分子导入受体细胞 1 转化 transformation 将质粒或其它外源DNA导入宿主细胞 常用大肠杆菌 并使其获得新的表型的过程 2 转染 transfection 将外源DNA导入真核细胞的过程 3 感染 transfection 以l噬菌体 柯斯质粒和病毒为载体的重组DNA分子 在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒 才能感染适当的细胞 并在细胞内扩增 也称为转导 transduction 五 筛 筛选出含重组DNA的受体细胞 1 直接选择法 遗传标记 抗药性标志选择 营养缺陷型的互补筛选法及分子标记 PCR 分子杂交 2 非直接选择法 免疫化学法 酶联免疫检测法 六 表达 使克隆基因在宿主细胞中复制 表达 1 外源基因在原核细胞的表达 大肠杆菌是最常用的原核表达体系 真核基因在原核细胞中表达的蛋白质常常形成不溶性的包涵体 2 真核表达体系 酵母 昆虫及哺乳动物细胞等 第三节重组DNA技术与分子医学的关系 疾病基因的发现 发展新药物 DNA诊断 基因治疗及遗传病的防治 一 疾病相关基因分析 1 功能克隆 functionalcloning 根据基因的功能 通常是根据其蛋白质 产物来寻找 克隆与疾病相关的基因 2 定位克隆 positionalcloning 从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩小范围 最后克隆该基因 二 制造生物活性蛋白 三 基因诊断 基因诊断 利用分子生物学的基本原理和技术 在DNA或RNA水平上分析 鉴定与某些疾病有关基因的改变 基因结构及其表达水平的异常 遗传病的产前诊断 感染性疾病的快速诊断 某些肿瘤的早期诊断以及器官移植供体的选择和法医学鉴定等 四 基因治疗 基因治疗 genetherapy 将某种遗传物质转移到患者细胞内 使其在体内发挥作用 从而达到治疗疾病目的的方法 1 基因治疗的方法 分类 1 基因矫正 genecorrection 将致病基因的异常碱基进行纠正 而保留正常部分 2 基因置换 genereplacement 正常基因通过同源重组 原位置换疾病基因 3 基因增补 geneaugmentation 正常基因非定点整合 补偿疾病基因的功能或使原有功能加强 4 基因失活 geneinactivation 采用各种方式抑制或破坏某种基因的表达 如反义RNA和RNA干扰 RNAi 技术 核酶与三链DNA 基因敲除 geneknock out 等 概述 1973 Cohen等人首次使用DNA克隆技术成功 一 克隆与克隆化 克隆即指同一副本或拷贝 copy 的集合 获取同一拷贝的过程叫克隆化 实例 肝组织 分离肝实质细胞 单一肝实质细胞繁殖 细胞克隆 自众多分子中分离获得相同分子 即为分子可隆 在分子生物学和遗传学领域所谈的分子可隆专指DNA可隆 一 质粒的特点 1 环状DNA 2kb 数百kb 2 某些质粒可以重组到染色体中复制 形成附加体 质粒载体 3 质粒的遗传信息可以赋予细胞某些性状 抗药性等 这些形状的有无常用于鉴定质粒是否存在于活细胞中 4 质粒复制分两型 严谨型 松弛型 松弛控制性质粒 拷贝数多 不受细胞内染色体控制 5 质粒含易位子和易位现象 易位子是质粒上的特定DNA序列 它可以从所在质粒易位于其它质粒或染色体中 它对细菌的进化有意义 质粒载体 严谨控制型质粒 拷贝数少 复制受染色体控制 质粒载体 理想载体的条件 1 具有自主复制能力 2 具有较多的拷贝数 易与宿主细胞的染色体DNA分开 3 分子量相对较小 能够容纳目的基因 4 具有较多单一限制性内切酶位点 5 有一个或多个筛选标记 6 具有较高的遗传稳定性 TheconstructedplasmidpBR322 质粒载体 外源基因插入位点EcoR 含一个复制起始点 ori 抗药基因terr和ampr 1977年由Boliver等人自E coli的天然质粒建成 1 克隆载体 AnexampleofanE coliexpressionvector 质粒载体 2 表达载体 外源基因插入位点复制起始点 ori 标记基因启动子调控序列核蛋白体结合序列 噬菌体载体 常用噬菌体 噬菌体载体 M13噬菌体 1 噬菌体载体 1 结构 线性双链DNA 由三个片段组成 左臂 中央 右臂 感染细菌后 可以形成封闭环分子 2 两类载体置换型载体 适于基因组DNA克隆 插入型载体 适于cDNA克隆 其它类型载体 一 柯斯质粒 cosmid 二 逆转录病毒载体 三 Ti质粒 可重组45kb的大片段 适用于动物细胞的基因工程 用于植物细胞基因工程 其它类型载体 四 酵母人工染色体 YAC 一 限制 修复体系 restriction modificationsystem 在细菌中与限制性内切酶同时共存有一种甲基化酶 两种酶共同构成细菌的限制 修饰体系 内切酶 切除限制外源DNA甲基化酶 保护自身DNA 限制性核酸内切酶 二 限制性内切酶分类 依据酶的组成 所需辅助因子及裂介方式分为三类 1 三个亚基组成的限制酶 即有内切酶又有甲基化酶活性需ATP供能辅助因子 Mg2 S腺苷甲硫氨酸切割 特异性差 切割识别位点约400 700bp或更远的DNA 限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶 即有内切酶又有甲基化酶活性需ATP供能辅助因子 Mg2 切割 识别位点周围25 27bp内 2 两个亚基组成的限制酶 3 一个亚基的限制酶 常称作限制性内切酶 只有内切酶活性 无甲基化酶活性不需ATP供能辅助因子 Mg2 切割 特异位点内 酶识别序列结构呈二元旋转对称又叫作回文结构 palindrome 限制性核酸内切酶 经典举例 EcoRI TheinteractionofEcoRIendo nucleasewithitstargetsequence Thedimericenzyme withitstwosubunitsingrayandlightblue isshownboundtoDNA InthetopviewtheDNAbindingsiteisfacingtheviewer InthebottomviewtheboundDNAisfacingawayfromtheviewerandisnotvisible 限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶 限制性内切酶切割产物 具有5 磷酸基和3 羟基基团由于酶的作用不同可以产生三种切割末端 1 5 突出末端 如EcoRI 酶识别DNA序列的长短不同 一般为4 18bp 3 平头钝性末端 如HpaI 限制性核酸内切酶 2 3 突出末端 如PstI 基因工程的基本步骤 1 分 2 切 3 接 5 筛 4 转 6 表达 基因工程的基本步骤 基因工程的基本步骤 基因工程的基本步骤 一 化学合成法 目的基因的获得 对已知基因的核苷酸序列 或蛋白质的氨基酸序列 推导出该多肽编码的核苷酸序列 用DNA合成仪经化学方法合成此基因 举例 胰岛素原 心钠素等 二 基因组DNA文库 鸟枪无性繁殖法 目的基因的获得 OH3 OH3 OH3 三 cDNA文库的建立 目的基因的获得 四 DNA聚合酶链反应 PCR 重组体构建 一 粘性末端连接 1 同一限制酶切割位点连接 碱基配对结合成重组分子 2 不同限制酶切割位点连接 因有相同末端 经配伍后连接 重组体构建 配伍末端连接 Complementaryhomopolymerictailsareaddedtotheendsofthetwofragmentstobejoined 重组体构建 Theoptimalsubstrateforterminaltransferaseisthe3 OHattheendofasinglestrandofDNAatleastthreenucleotideslong 粘端的生成 二 平端连接 平端在T4连接酶作用下可以连接 三 同聚物加尾连接 利用同聚物序列 如聚A与聚T之间经退火作用完成连接 需末端转移酶 四 人工接头连接 用人工和成某酶切割序列的接头 与DNA平端相连后形成粘性末端再连接 重组体构建 重组体构建 两个技术 制备感受态细胞和导入方法 一 感受态细胞制备 经某些方法处理后 具备接受外界DNA能力的细胞 称为感受态细胞 目前常用的多为E Colik 12株的衍生物 限制酶缺陷型使导入DNA免遭降解 重组缺陷型 以保证导入DNA完成独立存在 不与细菌中基因组DNA重组 重组体导入细胞 针对载体携有某些标志基因或目的基因的筛选方法 直接测定基因及表型 1 抗药性标志选择 含抗药性基因的载体 amp Tet Kam 转入的细菌 可在含该药物的培养板上形成菌斑 进行初步筛选 2 标志补救 导入基因的表达产物与受体菌的营养缺陷互补 利用营养突变株筛选叫标志补救 重组子的筛选 一 直接筛选法 实例 M13载体含 半乳糖苷酶N端序列 而突变株细菌中可表达 半乳糖苷酶C端序列 只有在两者共同表达时 才有酶的活性 重组子的筛选 3 分子杂交法 用32p标记的探针与转移至硝酸纤维素膜上的重组DNA片段进行杂交 直接鉴定目的基因 用特异的抗体与目的基因的表达产物相互作用进行筛选 二 免疫学方法 重组子的筛选 重组子的筛选 蓝白斑筛选 重组子的筛选 IdentifyingaclonewiththedesiredDNAsegment 氨基酸序列 预测核苷酸序列 分子杂交 实例 脆性x综合征 fragilexsyndrome 一种精神痴呆 研究发现细胞内有些DNA含脆性位点 并鉴定出含脆性位点DNA序列的特殊标志 但致病的分子机制不清楚 1991年用YAC克隆及分子杂交技术证明脆性位点是一个 CGG n重复序列 正常人含6 54 病人高达数百个 200 重复序列的增多使所在基因FMR 1不能转录出正确的mRNA 受累者出现综合征 基因工程的应用 一 疾病基因的发现 基因工程的应用 定点突变 基因工程产品 Atobacco