免疫组化技术20131讲解课件

免疫组织化学染色技术 李会强医学检验学院 Email lihuiqiang1965 组织化学染色技术 HistochemistryTechnique观察对象组织 细胞使用工具普通显微镜荧光显微镜 形态与结构 苏木素 曙红 免疫组织化学染色技术 ImmunohistochemistryTechnique指用标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应 对相应抗原 目的蛋白 进行定性 定位 定量测定的一项免疫检测方法 ImmunohistochemistryTechnique 特定蛋白 抗原 透膜 授课提纲 基质标本的制作荧光免疫组化技术酶免疫组化技术相关问题与解决方案 授课提纲 基质标本的制作荧光免疫组化技术酶免疫组化技术相关问题与解决方案 标本类型 组织标本冰冻切片石蜡切片细胞标本体外培养细胞 单层细胞 悬浮细胞 体液细胞 涂片 固定与保存 固定的目的防止细胞自溶 保持细胞形态与机构 保存组织细胞抗原性 防止标本脱落 防止滋生微生物 预防组织腐败标本固定以不损伤细胞形态 不损伤抗原特异性为基本原则 固定与保存 固定剂蛋白类乙醇或甲醇微生物类丙酮 三氯化碳多糖类10 福尔马林 抗原修复 目的 充分暴露抗原表位 利于抗体识别 方法 酶 无花果蛋白酶 胰蛋白酶 消化法 盐酸水解微波处理煮沸法 授课提纲 基质标本的制作荧光免疫组化技术酶免疫组化技术相关问题与解决方案 标记物 荧光素异硫氰酸荧光素 FITC 四乙基罗丹明 RB200 藻红蛋白 PE 藻红蛋白花青苷 PE Cy5 技术类型 直接染色法荧光素直接标记在特异性抗体 Ab1 间接染色法荧光素标记第二抗体 Ab2 第二抗体针对第一抗体种属特异性的表位 如羊抗鼠Ig或羊抗人Ig 直接法 实例 细胞鉴定 免疫细胞及其亚群 流式细胞术 T细胞CD3 CD4 CD8 B细胞NK细胞 免疫细胞分类与计数 18 SuppressorTcell Tcell Bcell 间接法 实例 检测抗核抗体 检测原理已知抗原肝细胞 HEp 2待检抗体第二抗体荧光标记兔抗人Ig 实例 检测病原体 病毒 细菌 检测原理待检病毒 抗原 已知抗体单抗或多抗第二抗体荧光标记羊抗鼠 或兔 Ig 荧光显微镜 落射式 关键汞灯光源激发滤片暗场聚光镜吸收滤片 荧光显微镜 落射式 荧光显微镜 落射式 授课提纲 基质标本的制作荧光免疫组化技术酶免疫组化技术相关问题与解决方案 主要类型 酶标记抗体同荧光免疫组化非酶标记抗体酶 抗酶系统生物素 链霉亲和素系统 技术特点 以酶作为抗原 制备抗酶抗体 酶 抗原 与抗酶 抗体 结合制备酶 抗酶复合物 通过桥联抗体与识别系统 待检抗原 特异性抗体 连接 酶桥法 常用酶和相应底物 过氧化物酶Peroxidase P 二氨基联苯胺 DAB 碱性磷酸酶 AP alkalinephosphatase AP 溴氯羟吲哚磷酸盐 BCIP 过氧化物酶 抗过氧化物酶 PAP 法 P AP PAP复合物 抗体选择 第一抗体识别抗原第二抗体 桥联抗体 能同时与第一 第三抗体结合第三抗体抗酶抗体与第一抗体同源 A A A 图双酶双底物 复合物法 双重酶标染色原理 兔PAP GARIgG 兔抗 Ag 鼠APAAP GAM IgG 鼠抗 实例 淋巴瘤轻链双重染色法 一抗兔抗 鼠抗 二抗羊抗兔羊抗鼠 显色系统PAPAPAAP 亲和素 生物素 过氧化物酶复合体 ABC 生物素 Biotin 亲和素 Avidin 生物素标记抗体 B Ab 生物素标记过氧化物酶 B P 亲和素 生物素 过氧化物酶复合体 ABC EnVision 授课提纲 基质标本的制作荧光免疫组化技术酶免疫组化技术相关问题与解决方案 识别抗体 第一 选择 单克隆抗体 McAb 特异性强敏感性差多克隆抗体 McAb 特异性差敏感性强 识别 第一 抗体选择 构象 糖基化 碳水化合物 第二抗体选择 选择显色系统 荧光免疫组化酶免疫组化PAPAPAAPABCLAB 封闭非特异性结合 特异性显色 具备特定部位显色特定