黄芪总黄酮对小鼠的急性毒性及致突变性研究.doc

此文档收集于网络，如有侵权，请 联系网站删除黄芪总黄酮对小鼠的急性毒性及致突变性研究王沙沙基金项目：国家自然科学基金项目（31260622）作者简介：王沙沙(1992)，女，吉林榆树人，硕士研究生，研究方向为兽医药理学与毒理学通讯作者：张雪梅，教授，博士。Tel:E-mail: zhangxm ，郭泽，王平，张冲，王莹，张雪梅*延边大学农学院动物医学系，吉林 延吉 133002摘要：本试验采用小鼠最大耐受量法、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验和小鼠精子畸形试验等方法研究黄芪总黄酮的急性毒性、致突变性。结果显示，黄芪总黄酮的小鼠急性经口最大耐受剂量(MTD)大于15 g/kg.bw，小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验和小鼠精子畸形试验结果均为阴性。结果表明，黄芪总黄酮属无毒物，对小鼠体细胞、雄性生殖细胞均无致突变性。关键词：黄芪总黄酮；小鼠；急性毒性；致突变性Acute Toxicity and Mutagenicity of Total Flavonoids of Astragalus in miceWANG Sha-sha , GUO Ze , WANG Ping, ZHANG Chong, WANG Ying,ZHANG Xue-mei*Department of Animal Medicine, Agricultural College of Yanbian University, Yanji, Jilin, 133002Abstract: The acute toxicity and mutagenicity of total flavonoids of Astragalus was investigated. Acute toxicity test with the maximum tolerance dose, bone marrow polychromatic erythrocytes micronucleus test and sperm deformity test in mice were adopted. The results showed that the acute oral maximum tolerated dose (MTD) of total flavonoids of Astragalus mice were higher than 15 g/kg.bw, bone marrow polychromatic erythrocytes micronucleus test and sperm deformity test in mice were negative. The results proved that the total flavonoids of Astragalus is non-toxic, and non-mutagenic on somatic cells and male germ cells in mice.Key words: Total flavonoids of Astragalus; mice; acute toxicity; mutagenicity黄芪又称黄耆，为豆科多年生草本植物，药用历史悠久，古有“补药之长”之称1。黄芪性温、味甘、归脾肺经，临床应用多为蒙古黄芪干燥根，有补中益气、温养脾胃之功效2。黄芪具有分布广泛、易人工种植、炮制方法简单、药用价值高等优点3。黄芪的主要成分包括黄芪总黄酮、黄芪多糖、黄芪皂苷、生物碱及多种微量元素等4。黄芪总黄酮(Total Flavonoids of Astragalus, TFA)作为黄芪的主要活性成分，具有清除自由基、抗氧化、抗衰老的作用5，能显著增强小鼠的免疫功能6，还具有体外抗炎等活性7。国内外对黄芪总黄酮药理作用的报道很多，但是对其急性毒性、致突变性均无报道。本试验采用小鼠急性经口毒性试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验和小鼠精子畸形试验等方法，对黄芪总黄酮的急性毒性、致突变性进行研究。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 试验药品黄芪总黄酮，购自南京泽朗医药科技有限公司；环磷酰胺(CP)，购自江苏恒瑞医药股份有限公司；羧甲基纤维素钠(CMC)，购自天津科密欧化学试剂有限公司；瑞士姬姆萨染色液(Wright-Giemsa Stain)，购自珠海贝索生物技术有限公司。1.1.2 试验动物昆明种雌雄小鼠，购自延边大学实验动物中心。饲养于独立通风笼盒，自由采食，维持12 h光照/黑暗的节律，正式试验前均适应喂养3 d。1.2 方法1.2.1 小鼠急性经口毒性试验本试验采用最大耐受量法进行试验8。昆明种小鼠1822 g，20只，雌雄各半。TFA配制成浓度为0.25 g/ml混悬液。小鼠禁食不禁水16 h，称重，间隔4 h以0.3 ml/10 g BW灌胃两次，总剂量为15 g/kg BW。立即观察并连续定时观察14 d，记录小鼠中毒症状、死亡情况及出现时间。1.2.2 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验本试验采用30 h试验法8。昆明种小鼠2530 g，25只，随机分成5组，分别为CMC阴性对照组，环磷酰胺40 mg/kg BW阳性对照组，TFA 10、5、2.5 g/kg BW三个剂量组。小鼠称重，间隔24 h以0.225 ml/10 g BW灌胃2次，第二次给予受试物6 h处死。取小鼠股骨骨髓制片，自然干燥，甲醇固定，Wright-Giemsa染色。油镜观察，每只小鼠200个PCE，计数相同区域内的成熟红细胞(NCE)，计算PCE/(PCE+NCE)比值；每只小鼠1 000个PCE，记录出现微核的PCE数，计算微核发生率。1.2.3 小鼠精子畸形试验8昆明种雄性小鼠1822 g，25只，随机分成5组，分别为CMC阴性对照组，环磷酰胺40 mg/kg BW阳性对照组，TFA 10、5、2.5 g/kg BW三个剂量组。小鼠称重，以0.15 ml/10 g BW每天定时灌胃三次，连续5 d，首次给予受试物35 d处死。取小鼠双侧附睾，置于生理盐水中，剪碎、过滤，吸取滤液涂片，干燥，甲醇固定。镜下观察，每只小鼠1 000个结构完整的精子，计数畸形精子类型及数目，计算精子畸形率。1.2.4 统计学分析试验数据采用SPSS 17. 0统计学软件进行分析，以平均数标准差（s）表示，组间比较采用单因素ANOVA( Dunnets t-test) t检验方法，P 0.05 表示差异具有统计学意义。2 结果2.1 小鼠急性经口毒性试验小鼠在14 d观察期内，未见任何中毒反应并无死亡状况，表明TFA对小鼠经口最大耐受量大于15 g/kg BW。据急性毒性分级标准，TFA被判定为无毒。2.2 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验本试验PCE/(PCE+NCE)比值均处于正常范围，表明试验结果可靠。结果显示CP阳性对照组微核率与CMC阴性对照组比较，差异有统计学意义；TFA各剂量组微核率与CP阳性对照组比较，差异有统计学意义，与CMC阴性对照组比较，差异无统计学意义。见表1。表1 TFA对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率的影响Table 1 Effects of TFA on micronucleus rate of bone marrow polychromatic erythrocytes in mice组别Groups剂量g/kg BWPCE/(PCE+NCE)微核PCENCE比值(%)PCE微核数微核率()阳性对照组Positive group0.0410005240.660.0650009919.808.41*黄芪总黄酮组TFA groups1010007870.560.025000234.603.85#510006970.600.085000173.402.70#2.510007860.560.055000214.204.60#阴性对照组Negative group10007580.570.055000193.804.32注：与阴性对照组比较，*P 0.05，*P 0.01；与阳性对照组比较，#P 0.05，#P 0.01。Note: Compared with the negative group, *P 0.05, *P 0.01; Compared with the positive group, #P 0.05, #P 0.01.2.3 小鼠精子畸形试验CP阳性对照组精子畸形率与CMC阴性对照组比较，有极显著性差异；TFA各剂量组微核率与CP阳性对照组比较，均有极显著性差异，与CMC阴性对照组比较，差异无统计学意义。结果表明TFA各剂量不能引起小鼠精子畸形率增高。见表2。表2 TFA对小鼠精子畸形的影响Table 2Effects of TFA on sperm deformity in mice组别Groups剂量g/kg BW精子总数(个)畸形精子类型及个数(个)畸形率()无钩香蕉型胖头无定型卷尾双头双尾总数阳性对照组Positive group0.045000214741566956015181106221.249.8*黄芪总黄酮组TFA groups10500029123228582116232.49.8#5500036162527977521342.618.1#2.55000371547151042622645.215.8#阴性对照组Negative group500040152917983220440.819.0注：与阴性对照组比较，*P 0.05，*P 0.01；与阳性对照组比较，#P 0.05，#P 0.01。Note: Compared with the negative group, *P 0.05, *P 0.01; Compared with the positive group, #P 0.05, #P 0.01。3 讨论本试验采用的小鼠急性经口毒性试验是毒理学安全性评价第一阶段最基础性的试验9，结果表明，TFA对小鼠经口最大耐受量大于15 g/kg BW，判定为无毒级。本试验的致突变性研究采用两种方法，其中小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验是检测环境诱变因子的遗传毒理学技术10，小鼠精子畸形试验用于特异性检测环境理化因子对雄性哺乳动物生殖细胞的遗传性损伤11。本试验以CP为阳性对照物，CP属氮芥类烷化剂，为常用临床抗癌药，但有抑制骨髓、抑制免疫功能和遗传毒性等毒副作用12。有研究显示TFA对化学物诱导的DNA损伤具有一定的保护作用，即TFA有抗突变作用13，但未对TFA的毒性作出评价。本试验两项致突变性试验结果均呈阴性，分别从染色体水平、基因水平表明TFA无致突变性。因此，在临床治疗中，TFA具有抗肿瘤、抗突变等药理活性，同时具有毒副作用小等优点，值得开发利用。参考文献：1 吴大真, 余传隆, 袁钟, 等. 中医辞海: 中册M. 中国医药科技出版社. 1999: 1226.2 熊辅信. 临床中药辞典M. 云南科技出版社. 1988: 51-3.3 中华人民共和国国家药典委员会. 中华人民共和国药典: 一部M. 北京: 化学工业出版社, 2010: 212.4 侯团章. 中草药提取物M. 中国医药科技出版社. 2004, 1: 128-36.5 汪德清, 沈文梅, 田亚平, 等. 黄芪有效成分对氧自由基清除作用的ESR研究J. 生物化学与生物物理进展. 1996(03): 260-2.6 徐璐, 李艳明, 刘靖陶, 等. 黄芪总黄酮对小鼠免疫功能的影响J. 动物医学进展. 2013, 34(11): 36-39.7 张贤, 郭泽, 张冲, 等. 黄芪总黄酮对脂多糖体外诱导的RAW264.7细胞的细胞因子和NO分泌水平的影响J. 中国兽医科学. 2015, 45(03): 321-324.8 中华人民共和国卫生部. 保健食品检验与评价技术规范(2003年版)S. 北京: 卫生部, 2003: 22-34.9 肖经纬, 李斌, 张星. 急性经口毒性评价试验方法的研究进展J. 国外医学(卫生学分册). 2007(02): 84-8.10 中华人民共和国卫生部. GB 15193. 5-2003 骨髓细胞微核实验标准S. 北京: 人民卫生出版社, 2003.11 中华人民共和国卫生部. GB 15193. 4-2003 小鼠精子畸形实验标准S. 北京: 人民卫生出版社, 2003.12