植物基因工程新途径叶绿体转化.doc

综述与专论中图分类号 : Q943 . 2文献标识码 :A文章编号 :1002 - 5064 (2001) 04 - 0009 - 05植物基因工程新途径 :叶绿体转化A Ne w Wa y of Plant Ge netic Engine e ring : Chlo ropla st Transfo rmatio n苏宁吴燕民孙丙耀沈桂芳SU Ning WU Yan - minSUN Bing - yaoSHEN Gui - fang中国农业科学院生物技术研究所 ,北京 100081Biotechnology Research Instit ute , CAA S , Beijing 100081 ,China摘 要 : 在植物基因工程研究中 ,叶绿体是继核转化之后又一新的遗传转化和表达受体 。叶绿体转化体系具有可同时进行多基因转化 、表达原核性 、超量表达 、后代遗传稳定 、定点整合 、不会产生基因沉默及母性遗传和安全性 好等特点 。本文着重介绍叶绿体转化体系的特点 、国内外研究动态 、存在的问题及未来发展方向 。关键词 : 叶绿体 ;叶绿体基因组 ;转化Abtract : Chloroplast p rovides an alternative usef ul plant t ransformatio n system of plant genetic engineering. Plastid t ransformatio n has several advantages : multiple exp ressed genes in a single t ransformatio n event , p ro karyotic system , high exp ressio n , stable t ransformatio n , site - specific int roductio n of foreign genes , absence of gene silencing and good enviro n2 ment safet y due to t he maternal inherence. In t his paper , t he characterizatio ns , recent advances , so me questio ns and it s p rospect of applicatio n of chloroplast t ransformatio n were described.Ke y wo rds : chloroplast ; chloroplast geno me ; tansformatio n近 20 年来 ,在国内 、外植物遗传工程研究中 ,取得了许多核转化的可喜成果 ,培育出了多种高产 、优 质和抗逆性强的转基因新品种 。1999 年 ,美国种植 的半数以上玉米 、棉花和大豆是转基因产品 1 。而 与此同时 ,公众对转基因植物的安全性也产生了一些疑虑和争议 。 争议的焦点之一是转基因植物的环境安全性问题 ,即转基因植物田间释放后 ,转基因随花粉转移到 环境中 ,是否会造成“基因污染”,打破原有生态种群 的平衡 。研究表明 ,标记基因从转基因作物传到野生向日葵的频率为 28 %38 % ,草莓种植园附近 50 米范围内有 50 %的野生草莓含有标记基因2 ; 转 抗除草剂基因油菜与野生型油菜在大田中第一次回 交产生的后代即可表现出抗除草剂特性 3 。尽管有关试验结果并不足以表明现有的转基因 植物对生态环境有直接危害 ,但对核转化安全性的担心以及对基因表达水平与稳定性的更高要求 ,促使人们继续探索和发现新的更为安全和有效的转化体系 。近几年来叶绿体转化研究的一系列重要进展 已引起人们的普遍关注4 ,本文就该领域的发展作一概述 。1叶绿体遗传转化的特点在高等植物细胞中 ,除细胞核外 ,叶绿体和线粒体中也都存在各自的 DNA 。1988 年 Boynto n 等5首次成功地用野生型叶绿体 DNA 转化了单细胞生 物 - - 衣藻突变体 ,使人们意识到植物叶绿体不仅 是光合作用的重要场所 ,也可以是植物遗传工程的 新的转化和表达受体 。叶绿体作为遗传转化受体具 有如下独特性 。1 . 1目的基因转化效率高且后代表达稳定 植物细胞中含有多个叶绿体 ,每个叶绿体中又含有多个基因组拷贝 。以显花植物为例 ,其每个叶肉细胞中约有 100 个叶绿体 ,每个叶绿体中又含有100 多个质体基因组拷贝 。如果将外源基因导入叶绿体基因组中 ,并达到同质化 ,该基因在植物细胞中的拷贝数将增加到约 10000 个6 ,增加基因拷贝数 并结合使用叶绿体特异性表达的强启动子 ,可大大 提高转基因的表达量 。由于叶绿体对表达产物的积 累具有较强的承受力 ,因而为外源基因在叶绿体中的大量表达提供了保障 。如 Khan7 报道将绿色荧 光蛋白基因和抗壮观霉素基因的融合基因导入烟草 叶绿体中 ,其表达量占可溶性蛋白的 18 % ; Guda8 将生物可降解多肽基因 ( GV GV P) 121 导入叶绿体 , 其表达量是核表达的 100 倍 ; Staub9 将人生长素蛋白转入 叶 绿 体 , 其 表 达 量 占 叶 绿 体 可 溶 性 蛋 白 的7 % ,是核表达的 300 倍 ; Poirie10 将生物可降解塑 料 P HB 基因导入拟南芥质体中 ,使 P HB 表达量提 高到占植株干重的 14 % 。同时 , 由于叶绿体具有母系遗传性 , 整合的目的基因不遵循孟德尔规律在后代中表现性状分离 ,故转基因可在子代中稳定地遗传和表达 。1 . 2 基因表达原核性同源片段 ,可将外源基因定位整合到叶绿体基因组中 ,从而减少由于外源基因整合位点的不确定性以 及由此而产生的位置效应对表达造成的不利影响 , 并简化外源基因转化后的筛选工作 。1 . 5环境安全性高 绝大多数植物的叶绿体遗传为母系遗传 ( 松树为 例 外 , 其 叶 绿 体 的 遗 传 为 母 系 和 父 系 双 亲 遗传) 15,不通过花粉传递 ,因此不会发生转基因因花粉传递而可能造成的环境安全性问题 。叶绿体外部包被有双层膜 ,将叶绿体与基质分 开 ,形成相对独立的小环境 。目的基因的表达具有 叶片组织特异性 , 不会在转基因植物果实中大量积累 ,以子实为产品的转基因植物的食用安全性增强 。此外 , 叶绿体基因组具有分子量小 、结构简单 、不结合组蛋白等特点 ,有利于实现分子操作 。叶绿体转化研究进展自 1962 年 Ris 和 Plaut 利用电镜首次证明叶绿 体中含有 DNA 以来 ,叶绿体 DNA 的结构和功能一2叶绿体基因组的遗传表达具有原核性11。其直是各国学者的研究重点 。目前已测出衣藻 、烟草 、基因组基因的排列方式 、调控方式 、GC 碱基对含量及翻译所偏爱的密码子与原核生物相接近 ,这有利 于直接表达来自原核生物的基因 ,无需进行繁琐的 优化密码子改造 。Mcbride12 将苏云金芽孢杆菌晶 体毒蛋白 (Bt ) 基因导入烟草叶绿体 ,得到的毒蛋白 占可溶性蛋白的 5 % ,杀虫性在 90 %以上 ,表达量比 将改造后的 Bt 基因转入植物核基因组中的最高表 达量提高了 50 倍 。1 . 3利于同时进行多基因转化 多个外源基因可以以多顺反子的形式同时在叶绿体中转录和表达13 。在叶绿体基因组中 ,许多功能相近的基因聚合在一起 ,共用同一个启动子 ,组成 操纵子 ,这种结构为在同一启动子的调控之下同时 表达多个外源基因提供了可行性 。 Khan5 的工作 证实了这一点 。此外 ,由于多个基因可以在同一个 启动子调控下完成转录和表达 , 因此可以避免因多 个相同的启动子调控多个基因在表达时产生基因沉默现象14 。1 . 4便于定位整合 由于一些植物的叶绿体基因组遗传背景较清楚 ,因此在转化叶绿体时通过在载体上设计相应的水稻等十几种植物的叶绿体基因组全序列 。随着分子生物学的发展 , 特别是核转化研究的深入 , 为了 减少外源基因大量表达对植物造成的危害 , 很早就有人尝试利用导肽将外源基因表达产物定位于叶绿体中 。最早有关叶绿体转化的报道是离体叶绿体的转化16;1987 年基因枪转化法确立17 ,使叶绿体转化成为可能 ; 1988 年 , Bo ynto n5 利用基因枪法 ,用带有 atpB 野生型基因的叶绿体 DNA 直接轰击三个 含 atpB 突变型基因的衣藻细胞 ,使其完全恢复了光合能力 , 证明植物叶绿体基因组可以被转化 ; 1990年 ,首次在高等植物叶绿体中使外源基因获得瞬间表达18。1992 年以来美国 Maliga 实验室的相关工作较为出色 ,他们用细菌来源的 aadA 基因 ( 壮观霉素抗 性基因) 作转化叶绿体的筛选标记基因 ,大幅度提高了基因的转化频率 、减少了继代次数 ,叶绿体 100 %得到转化 ,并首次成功地转化了烟草叶绿体 ,获得稳 定表达的个体19 。随着转基因技术研究的深入 ,除基因枪转化法外 ,产 生 了 一 些 新 的 转 化 方 法 , 如 : 农 杆 菌 介 导法20、玻 璃 珠 法21 、电 激 法22 、纤 维 注 射 法23 、P E G 法24 等 , 但转化效率均不如 基 因 枪 法 。基 因枪转化法是目前最有效的叶绿体转化法 。近几 年 , 叶 绿 体 转 化 研 究 有 了 很 大 突 破 。Daniell (1998) 25 首次将除草剂 ( 5 - 烯醇式丙酮酸 莽草酸 - 3 - 磷酸合酶 ( EPSPS) ) 基因转入烟草叶绿体 ,获得的转化体对除草剂的抵抗力提高了十倍 ,并且不会出现“基因逃逸”现象 ,显示出叶绿体转化的 优越性 。Kota ( 1999) 26 获得的转 Bt cry2Aa2 基因转基因烟草对具有 330390 倍 Cry2Aa2 抗性的烟青虫 ( Hel iot his v i rescens) 、棉铃虫 ( Hel icove r p a zea) 和甜菜蛾 ( S podopte ra ex i g u a) 表现出 100 %毒杀作 用 。Kanevski ( 1999 ) 28 在利用叶 绿 体 转 基 因 方 法 提高作物光合效率方面做了一些探索 ,为提高光合 效率的研究奠定了基础 。Staub ( 2000) 9 等报道 ,以 叶绿体作为生物反应器生产具有生物活性的人类生 长激 素 蛋 白 , 表 达 量 比 核 系 统 高 300 倍 。Co sa (2001) 28 将 Bt Cry2Aa2 转入烟草叶绿体 , 其表达 量占叶片可溶性蛋白的 45 . 3 % ,在老叶片中占可溶 性蛋白的 46 . 1 % ,并且在电镜下可以观察到表达产 物的蛋白质结晶 , 表达产物的杀虫性达 100 % 。叶 绿体表达体系的超量表达能力为叶绿体遗传工程在 生物反应器研究中的应用展示了美好的前景 。目前 ,叶绿体转化的植物种类有所扩展 ,在高等 植物中 ,除已获得稳定的转基因烟草植株外 ,还获得 了在植物叶绿 体 中 稳 定 表 达 gfp 基 因 的 转 基 因 水决的问题之一 ,它的解决将有助于提高叶绿体遗传转化的表达量 。目前多采用降低叶绿体的拷贝数或 选用致死型突变体作为外源基因的转化受体 , 但最 有效的方法还是抗体筛选 , 即选择合适的抗生素浓 度 ,经过多代筛选 , 淘 汰 未 转 化 叶 绿 体 DNA 的 方法 , 达到同质化的程度 。3 . 1 . 2 植物种类的拓展 目前利用叶绿体作为转化 受体可转化的高等植物仍然有限 , 从而限制了该技 术的应用范围 ,所以扩大叶绿体转化的植物种类不仅具有重大的理论意义 ,而且具有深远的实践意义 。限制叶绿体转化主要有两方面原因 : a . 叶绿体转化载体包含有叶绿体同源片段 , 以保证外源基因的定 点整合 , 而大多数植物的叶绿体基因组序列不清楚(目前只有十多种植物的叶绿体全序列已被完全测 出) , 因此 , 无法确定用于载体构建的同源片段和外源基因的插入位点 , 但叶绿体基因组结构保守性 高 ,对于未知序列的叶绿体基因组也可通过其保守 序列来完成基因操作 。如 Daniell 16 根据叶绿体基 因组序列的高度保守性构建了叶绿体通用表达载 体 ,从而为叶绿体转化提供了方便 ; b. 多数禾谷类作物是从胚性组织发育而来的 , 而这些胚性细胞中 只含有前质体或未成熟叶绿体 , 前质体和未成熟叶 绿体接受外源基因的能力是否与成熟叶绿体相当仍 是一个值得研究的问题 , 虽然目前在水稻 、小麦等 研究中有所突破 , 但仍需系统研究 , 特别是对于非绿色组织的叶绿体转化所需的相应组织培养技术和 有效筛选基因的选择对叶绿体转化的进一步深入应 用至关重要 。3 . 1 . 3 选择标记基因 烟草叶绿体遗传转化所用 的十分有效的选择标记基因是抗壮观霉素 ( aadA)基因 ,而高等植物核转化表明这种选择标记基因对 部分具抗生素耐性的双子叶植物和单子叶植物选择 效率低 ,无法得到大量转化植株 。因此有效的选择 标记基因是实现扩大叶绿体遗传转化植物种类的关 键因素 。最近 , 利用绿色荧光蛋白 ( GF P) 和氨基糖苷磷酸转移酶作为筛选标记的研究已取得一定的进 展 。3 . 1 . 4 缺乏表达的组织发育专一性 叶绿体基因 组的启动子中除了光调控启动子具有组织专一性 外 ,一般都没有组织专一性 ,特别是发育专一性表达稻7、马铃薯29 植株 。中国叶绿体遗传工程工作正在展开 ,中国农业科学院生物技术研究所叶绿体遗传工程室自 1990年以来 已 先 后 建 立 了 烟 草 、衣 藻 的 叶 绿 体 转 化 体系30 ,31,目前对水稻叶绿体转化体系的研究也有突破 。Bt 基因32 、nif 基因33 、Bar 基因34 和甲肝 、丙肝抗原融合基因31 已分别被导入烟草和衣藻叶绿 体中 ,并得到表达 。其中甲肝 、丙肝抗原融合基因在衣藻中的表达量占可溶性蛋白的 5 . 1 % , 显示出叶 绿体表达体系的广阔应用前景 。3问题与展望3 . 1叶绿体遗传转化亟待解决的主要问题3 . 1 . 1叶绿体转化的同质化 ( ho moplasmo n) 问题 由于叶绿体含有多个 DNA 拷贝 , 如何使外源基因 完全整合到叶绿体每个 DNA 拷贝中是目前首要解matio n in chlamydo mo nas wit h high velocit y microp rojectiles. 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