课题3　血红蛋白的提取和分离

专题五 DNA和蛋白质技术课题三 血红蛋白的提取和分离主备人：郭 燕 研备：高二生物组一、学习目标1、会说出凝胶色谱法和电泳法分离生物大分子的原理。（学习重点、难点）2、能写出血红蛋白提取和分离的步骤。（学习重点）二、学法指导 通过图片模型理解凝胶色谱法分离蛋白质的原理； 通过观看视频来理解血红蛋白提取和分离的过程三、课前热身一、基础知识1凝胶色谱法(1)概念：凝胶色谱法也称做分配色谱法，是根据_的大小分离蛋白质的有效方法。(2)原理：大多数凝胶是一些微小的_球体，内部有许多贯穿的通道，当_不同的蛋白质通过凝胶时，_的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程_，移动速度较慢；而_的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程_，移动速度较快。_不同的蛋白质因此得以分离。2缓冲溶液(1)作用：在一定范围内，缓冲溶液能抵制外界的_对溶液pH的影响，维持pH基本不变。(2)配制：通常由12种_溶解于水中配制而成。调节_的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。3电泳(1)概念：是指_粒子在电场的作用下发生_的过程。(2)原理：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的_下，这些基团会带上_。在电场的作用下，这些_分子会向着与其所带电荷_的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子_的差异以及_的大小、_不同，使带电分子产生不同的_，从而实现样品中各种分子的分离。(3)常用的电泳方法：琼脂糖凝胶电泳和_电泳。二、实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步：_、粗分离、纯化和纯度鉴定。1样品处理和粗分离(1)红细胞的洗涤：采集血样，_离心，吸取血浆后加_洗涤，再低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色。目的是除去_，以利于后续步骤的分离纯化。(2)血红蛋白的释放：将洗涤好的红细胞依次加入蒸馏水至_体积，再加40%体积的_，置于_上搅拌10 min，使红细胞吸水涨破，血红蛋白释放出来。(3)分离血红蛋白溶液：将搅拌好的混合液转移到离心管中，以2 000 r/min的速度离心10 min。离心后试管中的溶液分为4层。第一层为无色透明的_，第2层为白色薄层固体，是_的沉淀层，第3层是红色透明液体，这是_的水溶液，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去_层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。(4)透析：取1 mL的血红蛋白溶液装入_中，将_放入盛有300 mL的物质的量浓度为_mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12 h(以除去样品中_的杂质)。2纯化凝胶色谱操作(1)凝胶色谱柱的制作：准备材料加工_安装色谱柱。(2)凝胶色谱柱的装填。因为干的凝胶和_的凝胶的体积差别很大，因此装柱前需要根据色谱柱的内体积计算所需要的凝胶量。本实验使用的是交联葡聚糖凝胶(Sephadex G75)。“G”表示凝胶的_，膨胀程度及分离范围，75表示_值，凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成_悬浮液，在与色谱柱下端连接的尼龙管打开的情况下，一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时可轻轻_色谱柱，使凝胶装填均匀。注意色谱柱内不能有_存在。(3)样品的加入和_。3纯度鉴定判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。在鉴定的方法中，使用最多的是_电泳。三、操作提示1红细胞的洗涤：洗涤次数不能过少；_离心。2凝胶的预处理：沸水浴法不但节约时间，而且可以除去凝胶中可能带有的_和空气。3色谱柱的装填：装填尽量_，降低颗粒间隙；无_；洗脱液不能断流。4色谱柱成功的标志：红色区带_地移动。四、课堂探究（一）自主学习（独立完成，记录疑问）聚焦目标一：凝胶色谱法和电泳法分离生物大分子的原理问题一：凝胶色谱法使用的凝胶有哪些？凝胶有什么特点？问题二：为什么相对分子质量较大的蛋白质会先从色谱柱中洗脱出来？问题三：凝胶色谱法分离蛋白质时通过一次洗脱能否将所需蛋白质与其他杂质彻底分离？问题四：SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质是否依据蛋白质所带电荷的差异？为什么？聚焦目标二：血红蛋白提取和分离的步骤问题一：与其他真核细胞相比，哺乳动物成熟红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义？问题二：洗涤红细胞时能否用蒸馏水代替生理盐水？洗涤红细胞的目的是什么？你如何知道红细胞已洗涤干净？问题三：在血红蛋白释放过程中，蒸馏水和甲苯的作用分别是什么？ 问题四：血红蛋白释放后的混合液经离心后分为哪几层？如何获得血红蛋白溶液？ 问题五：将收集的血红蛋白溶液放在透析袋中进行透析，透析的目的是什么？问题六：在制作凝胶色谱柱时，凝胶色谱柱的高度不足或直径过大对洗脱效果分别有何影响？问题七：试从凝胶色谱的分离原理分析，凝胶的装填为什么要紧密、均匀？ （二）合作探究（组内讨论，突破疑难）（三）展示讲解（班内讨论，教师补充）五、课堂小结（构建思维导图，归纳总结）六、分层训练巩固性练习1.凝胶色谱法是分离蛋白质分子的一种常用方法，但并非所有的蛋白质都可以用此方法进行分离，能分离的蛋白质分子之间必须()A.具有相同的相对分子质量B.相对分子质量不同，但都是相对分子质量较大的分子C.相对分子质量不同，但都是相对分子质量较小的分子D.具有不同的相对分子质量2.将经处理破裂后的红细胞混合液以2 000 r/min的速度离心10 min后，离心管中的溶液分为四层，从上到下的顺序依次是()A.血红蛋白、甲苯层、脂溶性物质层、沉淀层B.甲苯层、沉淀层、血红蛋白、脂溶性物质层C.脂溶性物质层、血红蛋白、甲苯层、沉淀层D.甲苯层、脂溶性物质层、血红蛋白、沉淀层3.使用凝胶色谱法分离蛋白质实验中，相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的行进过程，可表示为图中()4.蛋白质的提取和分离分为哪几步，依次是()A.样品处理、凝胶色谱操作、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳B.样品处理、凝胶色谱操作、纯化C.样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定D.样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定5.在血红蛋白分离过程中，使用缓冲液的作用是()A.维持溶液浓度不变 B.维持溶液酸碱度不变C.催化蛋白质分离过程顺利完成 D.无实际意义提升性训练1.已知某样品中存在甲、乙、丙、丁、戊五种物质，其分子大小、电荷的性质和数量情况如下图所示。下列叙述正确的是()A.将样品装入透析袋中透析12 h，若分子乙保留在袋内，则分子甲也保留在袋内B.若五种物质为蛋白质，则用凝胶色谱柱分离时，甲的移动速度最快C.将样品以2 000 r/min的速度离心10 min，若分子戊存在于沉淀中，则分子丙也存在于沉淀中D.若五种物质为蛋白质，用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品中的蛋白质分子，则分子甲和分子戊形成的电泳带相距最近4.下列关于蛋白质提取和分离实验中样品处理步骤的描述，正确的是()A.红细胞的洗涤：加入蒸馏水，缓慢搅拌，低速短时间离心B.血红蛋白的释放：加入生理盐水和甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌C.分离血红蛋白：将搅拌好的混合液离心，过滤后，用分液漏斗分离D.透析：将血红蛋白溶液装入透析袋，然后置于pH为4.0的磷酸缓冲液中透析12 h5.凝胶色谱技术是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很好的分离效果，目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛应用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。据图回答问题：(1)a、b均为蛋白质分子，其中先从层析柱中洗脱出来的是 ，原因是 。(2)自己制作凝胶色谱柱时，在色谱柱底部d位置相当于多孔板的结构可由 _替代。(3)装填凝胶色谱柱时，色谱柱内不能有气泡存在，原因是 。(4)若选用Sephadex G100，则“G”表示 ，100表示 。13.血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中O2或CO2的运输。请根据血红蛋白的提取和分离流程图回答问题。 (1)将实验流程补充完整：A为 ，B为 。凝胶色谱