纤维素降解研究.doc

纤维素降解研究众所周知，纤维素作为自然界中来源最广泛的植物产品，具有环境友好，再生性强这一巨大的优点，每年通过光合作用产生的植物纤维的生物量可以达到10亿t，其中木质纤维素占到其中的90%。但其有效的利用也成为了人类攻克了很久却有久攻不下的难题在今天，我们依然可以看到大量的秸秆在田间直接被焚烧，成堆的生物质废物堆弃在路边在这里，我很有兴趣把我这次演讲的重点放在这个前景诱人但现实却比较沮丧的主题上（虽然这和我本人导师做的课题联系不是很大）。本次的演讲主要有三部分构成：1.纤维素来源与性质；2.纤维素降解机理； 3.纤维素利用近期研究。1.纤维素来源与性质：纤维素是生物圈里最丰富的有机物质。占植物界碳素的50%以上。纤维素是植物（包括某些真菌和细菌）的结构多糖，是它们的细胞壁的主要成分。纤维素组成叶子干重的10%，木材的50%，麻纤维的70%-80%，棉纤维的90%-98%。但纤维素不是植物界所独有的，海洋无脊椎动物被囊类在其外套膜中含有相当多的纤维素，甚至有人报道在人的结缔组织中也有少量纤维素的存在。纤维素是线性葡聚糖，残基间通过-（1，4）糖苷键连接的纤维二糖可以看做是它的二糖单位。纤维素链中每个残基相对于前一个残基翻转180，使链采取完全伸展的构象。相邻、平行的伸展链在残基环面的水平向通过链内和链间的氢键网形成片层结构，片层之间即环面的垂直向靠其余氢键和环的疏水内核间的范德华力维系。这样若干条链聚集成紧密的有周期性晶格的分子束，成为微晶。多个这样的胶束平行地共处于在电镜下呈线状的微纤维中（如下图所示）。2.纤维素降解机理纤维素之所以难降解是由其空间结构决定的。木质纤维素具有特殊的晶格结构，导致其与酶的接触和作用很困难。同时，关于产纤维素酶菌株的筛选研究很多，但真正高产量的菌株并不多见，少有低温分解菌株，纤维素酶的生产依然是低产量高成本的状态，这是制约纤维素分解工艺的瓶颈。纤维素天然结构复杂，其生物降解过程则是一个复杂的酶学过程，需要多种酶的协同作用来完成的，从而需要多重微生物的共同作用。 自然界中，木质纤维素能够被千百种微生物所降解。微生物降解木质纤维素时主要有两种进攻方式，一是由外部到内部;二是由内部向外部。细菌在降解木质纤维素时首先吸附在纤维素表面，不断地由纤维的表面向内部生长，细菌吸附的纤维素部位被细菌所破坏，纤维易于膨胀，较为容易分解。真菌在降解木质纤维素的过程中，首先吸附在木质纤维素的端部，菌丝由端部向内延伸，分泌木质纤维素降解酶，然后由内向外降解木质纤维素。微生物降解木质纤维素时无论采用何种方式来破坏木质纤维素结构，在木质纤维素生物降解过程中起主要作用的还是微生物所产生的木质纤维素降解酶。 广泛接受的是纤维素酶是所有参与降解纤维素的各种酶的总称，主要由外切酶(CBH)、内切酶(EG)和-糖苷酶(BG)3种酶协同/竞争降解纤维素。由于纤维素的多形性，纤维素的水解需要多种酶协同作用才能完成，在纤维素降解过程中，纤维素酶间的协同效应已经得到了广泛的研究。水解分2个部分，初级水解和次级水解。初级水解发生在固体底物的表面，通过内切酶和外切酶的作用释放出聚合度在6以下的可溶性糖到液相中，其中，内切酶可作用于纤维素分子内的无定形区，随机水解-1，4糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量的小分子纤维素，即纤维素末端。内切型纤维素酶可为外切酶提供大量的反应末端，同时它也能水解小分子的纤维素寡糖;外切酶作用于纤维素分子的末端，依次从纤维素分子中切下纤维二糖，它可以作用于纤维素分子内的结晶区、无定形区和羧甲基纤维素;纤维二糖酶作用是将纤维二糖水解为葡萄糖。酶的作用形式如下图所示：3. 纤维素利用近期研究 利用生物分子技术进行新的纤维素酶的改造是当今纤维素酶解领域的一个研究重点和热点，下面我将就这个方向和大家分享一下最新的研究成果。实验室采用的是试验培养菌体产生的酶，其主要的实验步骤为：目的DNA合成并与载体相连 酶蛋白的表达与纯化 凝胶过滤层析确定分子量 ELISA确定复合物的结合与否 Coh-SP1与t-6B结合，Exo-complex形成 各种复合物降解纤维素活性的测定。如下图所示，Coh-SP1为两种蛋白的组合支架，Cel5A为一种纤维素内切酶，t-6B为一种纤维素外切酶。B所示为理想情况下支架复合蛋白的组装，我们可以看到外切酶通过支架锚定在支架蛋白上。首先探讨支架长度对承载纤维素酶能力的影响，如下图所示：试验通过凝胶过滤层析的方法来确定复合蛋白以及各个蛋白单体的分子质量，并通过计算得出：经过优化的实验条件，每个基座上最多可以锚定12个外切蛋白酶分子，并且随着支架长度的增加，基座上可以锚定的蛋白的数目也在增加。实验人员分析是因为支架的增长使得锚定的外切酶之间的空间位阻减少，所以可以容纳更多的酶分子。 再者，我们要确定复合物降解纤维素的能力是否增强，根据下面的图谱分析我们可以看出，图的横坐标是酶的浓度，纵坐标是酶的降解速率。很明显，随着酶浓度的增加，降解速率都在增大，但是我们通过支架锚定的复合蛋白与内切酶配合的一组的降解效果是最好的。复合蛋白提高了单位体积内外切蛋白的含量，我认为，这是它可以有效提高纤维素降解速率的首要原因。再者我们讨论下系统中内切酶浓度与复合物浓度的比值的优化。从中我么可以看到，外切酶浓度与内切酶浓度比值为1：20时，降解速率是最大的，因此之后的试验我们蛋白复合物锚定的过程中和酶解过程中，酶浓度比例（外切酶：内切酶）定为1：20。最后讨论下在外切酶浓度：内切酶浓度为1：20时纤维素被降解的情况，可以看到试验中的酶蛋白的复合物与内切酶的组合中，降解效率是最好的。主要参考文献1） 王士强等,木质纤维素生物降解机理极其降解菌筛选方法研究进展. 华 北农学报, 2010,25:313-3172） 王静岩,朱圣庚,徐长法主编,生物化学. 高等教育出版社, 2002.93） 张涛等,纤维素降解菌的筛选和鉴定. 现代食品科技, 2010, 418-4214） Arnon Heyman et,Enhanced cellulose degradation by nano-complexed enzymes: Synergism between a scaffold-linked exoglucanase and a free endoglucanase, Journal of Biotechnology 147 (2010) 205211 5） Bayer, E.A., Shoham, Y., Lamed, R., 2008. Cellulosome-enhanced conversion ofbiomass: on the road to bioethanol. In: Wall, J., Harwood, C., Demain, A.L. (Eds.),Bioengergy. ASM Press, Washington, DC, pp. 7596.6） Berger, E., Zhang, D., Zverlov, V.V., Schwarz, W.H., 2007. Two n