《基因工程》ppt课件

第三章基因工程的载体 载体 Vector 是指基因工程中携带外源基因 或DNA片断 进入受体细胞的运载工具 它的本质使DNA复制子 载体的构建和选择是基因工程的重要环节 构建的克隆载体可以申请专利保护 目前已经构建的克隆载体不下几千种 作为克隆载体的基本条件是 能自我复制并能带动插入的外源基因一起复制 具有合适的限制性核酸内切酶位点 具有合适的筛选标记 在细胞质中自我复制 整合到染色体DNA随染色体DNA同步复制 在载体上单一的RE位点越多越好 MultipleCloningSite 报告基因或选择标记基因 在细胞中拷贝数要适当载体的相对分子量要小 这样可以容纳较大的外源DNA插入片断 载体相对分子量太大将影响重组体或载体本身的转化效率 在细胞中稳定性高 保证重组体稳定传代而不易丢失 载体必须是安全的 不应含对受体细胞有害的基因 并且不会任意转入受体细胞以外的其它生物细胞 目前构建的载体 根据DNA来源性质可以分为 细菌质粒载体 噬菌体 衍生载体 Cosmid载体 噬菌体M13衍生载体 Phagemid载体 酵母质粒载体 真核病毒载体 杆状病毒和Bacmid载体 大肠杆菌质粒 枯草杆菌质粒 根癌农杆菌Ti质粒 发根农杆菌质粒Ri等 根据齐义鹏分类 人工染色体 根据功能和用途 载体可以分为 克隆载体表达载体测序载体转化载体穿梭载体多功能载体 根据受体细胞 载体可以分为 原核生物载体真核生物载体大肠杆菌载体酵母载体植物基因工程载体动物基因工程载体 第一节质粒载体 基因工程的质粒载体主要是以细菌质粒 Plasmid 的各种元件为基础组建而成的 必须的元件有复制必需区 选择标记基因和RE酶切位点 克隆位点 一 与组 构 建载体相关的质粒性质 1 质粒组成和分子构型 已知绝大多数质粒为闭合环形DNA分子 closedcircleDNA ccDNA 少数真核细胞中发现线性的DNA分子 酵母的杀伤质粒 killerplasmid 为RNA分子 真核生物的RNA质粒有壳体的dsRNA质粒 由蛋白质壳体包裹 存在于某些真菌和植物细胞中 由于它们酷似病毒 所以也常被称作真菌病毒和植物隐蔽病毒 或称类病毒颗粒 典型代表是酿酒酵母的嗜杀dsRNA质粒 与RNA病毒的主要区别是它们不具有感染性 无壳体的dsRNA质粒 存在于脂质小囊中的栗疫菌减毒dsRNA质粒 玉米线粒体中与雄性不育有关的dsRNA质粒 质粒DNA分子具有3种不同的构型闭合环状DNA ClosedcircleDNA ccDNA 两条dsDNA保持完整的环性结构 呈现出超螺旋构型 Supercoil 即SC构型 开环DNA OpencircleDNA ocDNA 两条dsDNA中的一条保持完整的环性结构 另一条出现一个或多个切口 即OC构型线性DNA LinerDNA lDNA 闭合环状的dsDNA双链断裂中成线性DNA分子 即L构型 OC L SC 电泳 OC L SC 2 质粒的复制类型 质粒的复制受质粒和宿主细胞双重遗传系统控制的 根据质粒复制与染色体复制的偶连程度将质粒的复制类型分为严密型 stringentplasmid 和松弛型质粒 relaxedplasmid 严密型 stringentplasmid 质粒DNA复制与宿主染色体DNA复制紧密相偶连 受到某种程度的控制 每个细胞中只有1 2个拷贝的质粒 分子量大 自身传递 松弛型质粒 relaxedplasmid 质粒DNA复制与宿主染色体DNA复制松弛地偶连 受到松弛程度的控制 每个细胞中只有10 200个拷贝的质粒 分子量大 不能自身传递 基因工程中一般希望构建松弛型质粒 含ori位点和cop基因 在培养基中加入蛋白质合成抑制剂 氯霉素或链霉素 后 染色体复制终止 松弛型质粒仍可以依赖半衰期较长的酶 DNA聚合酶I DNA聚合酶III等 进行复制 使细胞中拷贝数达到数百上千氯霉素扩增 关于质粒拷贝数的定义 在文献中有二种不同的说法 常用的定义是指 生长在标准的培养基条件下 每个细菌细胞中所含有的质粒DNA分子的数目 然而我们知道 培养在富裕培养基中快速生长的细菌细胞 可拥有3 4条染色体DNA 而在碳源供应不足的培养基中缓慢生长的细菌细胞 平均只有1 1条染色体DNA 因此 在有的文献中所说的质粒拷贝数的定义是指 每条细菌染色体所平均具有的质粒DNA分子数目 一种质粒究竟是属于严紧型还是松弛型并非绝对的 这往往同寄主状况有关 例如 R1质粒在大肠杆菌寄主细胞中的复制是属于严紧型的 而它在奇异变形杆菌寄主细胞中的复制则是属于松弛型的 再如 ColE1 K30质粒的情况与R1质粒恰好相反 它在大肠杆菌寄主细胞中的复制是属于松弛型的 而在奇异变形杆菌寄主细胞中的复制则是属于严紧型 至于F因子 不论是在大肠杆菌寄主细胞中 还是在奇异变形杆菌寄主细胞中的复制都是属于严紧型的 由此可见 质粒的复制不仅受自身的制约 而且还受到寄主的控制 环状质粒的复制形式主要分theta 及rollingcircle两种 基因体的复制都是由复制原开始 原核性复制原约由250个碱基对组成 一般质粒的复制原常称为oriV originofvegetativereplication 有时R 质粒的复制原称为oriR 大肠杆菌的复制原称为oriC Theta形式的质粒复制与细菌基因体复制一样 以RNA聚合酶 RNApolymerase 在复制原制造RNA引子 RNAprimer 然后由DNA聚合酶 DNApolymerase 接手由此向两个方向分别复制DNA 直到整个基因体复制完成 在复制过程中当然还有许多其它酶的参与 这些酶多由宿主提供 有的质粒自己携带一些与复制有关的基因 这些基因多被命名为rep 如repA repB等等 Rollingcircle形式的质粒复制与部分噬菌体基因体的复制相似 环状双绞链中的一股在复制原附近被酶切开 然后环状股与线状股被分别复制完成 至于线状质粒的复制则是靠特殊的RNA引子或该质粒所具有的telomere likesequence 3 质粒的不亲和性 在没有选压力的情况下 两种质粒不能在同一宿主细胞系中稳定地共存 在细胞增殖的过程中 其中一种会被逐渐稀释 排斥掉的现象 彼此不相容的质粒属于一个不亲和群 incompatibilitygroup 彼此能够共存的亲和质粒则属于不同的不亲和群 在E coil的质粒中已经鉴别出30个以上的不亲和群 在金黄色葡萄球菌 Staphylococcusaureus 中已经鉴别出13个以上的不亲和群 滥交质粒 promiscuousplasmid 大肠杆菌质粒的不亲和群P和W 能够在许多种的G 细菌中自我转移 并能在这些不同宿主细胞中稳定的成活下去 在基因工程中存在潜在的危险性 4 质粒的转移 质粒的转移是指质粒从一个细胞转移到另一个细胞的特性 主要原因是tra基因 质粒含有tra基因 接合质粒 conjugativeplasmid 不含tra基因质粒 非接合质粒 non conjugativeplasmid tra基因指令宿主细胞产生菌毛 pilus 合成细胞表面物质 促使宿主细胞与受体细胞结合 导致遗传物质从一个细胞转移到另一个细胞中 Sexpili Matingbridge Donorcell male Recipientcell female 一个结合质粒至少要具有下列三个基本条件 1 产生性线毛 sexpili 的能力 2 具有转移原oriT originoftransfer 及3 能辨认oriT的特殊DNA内切酶 DNAendonuclease 结合质粒F上有若干个与大肠杆菌染色体上相同的转位子 在偶然的状况下因为相同DNA序列的转位子发生同源重组 homologousrecombination 结果使F 质粒与染色体DNA融成一体 这种授株被称为Hfr highfrequencyofrecombination 5 质粒的迁移 质粒是非接合质粒 但是含有bom basisofmobility 位点 oriT位点 在宿主细胞的一种质粒 helperplasmid 含有mob基因 nickase mob基因产物打开是非接合质粒的bom位点 借助接合质粒的tra基因产物 使非接合质粒被动的转移到受体细胞 这种现象成为迁移 Mobilization 非结合质粒中有些因为具有oriT或bom 所以可以经由具tra基因的helper质粒协助而被传送 可被传送的非结合质粒称为可移动质粒 mobilizableplasmids pBR322就属于这个类型 不可被传送者称为不可移动质粒 non mobilizableplasmids RSF1010属这一型 可移动质粒与helper质粒的搭配使用在基因转殖上是常被利用的技术 含tra基因 含有BOM位点和mob基因的pCAMBIA5105 GTbacKseries 含有受体Ti质粒的农杆菌 含有协助质粒的大肠杆菌菌株含Tra基因 含有中间质粒的大肠杆菌菌株 质粒含bom位点和Mob基因 三亲杂交法 同源重组 pRK2013 5 显形质粒和隐形质粒 质粒携带的某些基因 宿主细胞由于含有这样的质粒而呈现出新的性状 这种质粒为显性质粒 phenotype 还有一类质粒 它们究竟赋于寄主细胞何种表型 迄今仍不清楚 因此持称这类质粒为隐蔽质粒 crypticplasmid 此外 近年来还在不同的细菌中发现了许多种异常的质粒 doublestrandedlinearplasmid 抗性质粒 Resistance 包括抗菌素抗性 R 质粒和金属抗性质粒 R质粒的进化 转移和扩散给抗菌素治疗带来很大麻烦 是医学所面临的重大问题之一 R质粒与转座子 Transposon 和整合子 Integron 的相互作用 使细菌耐药性问题更加严重 毒力质粒 Virulence 许多细菌的致病力和毒性与质粒有关 如大肠杆菌肠毒素和定居抗原 破伤风毒素 炭疽毒素 溶血毒素 苏云金芽孢杆菌的杀虫晶体蛋白 植物冠瘿病 Ti质粒 和发根病 Ri质粒 降解质粒 Degradative 许多环境污染物的降解途径由质粒基因编码 降解基因组成几个操纵子 操纵子的表达受调节基因控制 目前 已经测定全序列并注释基因的降解质粒有10余种 分别是尼龙寡聚体降解质粒pOAD2 芳香烃降解质粒pNL1 除草剂阿特拉津降解质粒pADP 1 甲苯降解质粒pWWO 烟碱降解质粒pAO1 咔唑降解质粒pCAR1 异丙基苯降解质粒pBD2 卤乙酸降解质粒pUO1 2 4 D降解质粒pJP4 萘降解质粒pND6 1和pDTG1 pOAD2NylonFlavobacteriumK17245519nylAMicrobiologyoligomersnylBC1995 141 2585pNL1Biphenyl naphthaleneSphingomonas184457pbh xyl J Bacteriol m xylene p cresolaromaticivoransF199nah pch1999 181 1585pADP 1AtrazinePseudomonasADP108845atzA atzBJ Bacteriol atzC atzDEF2001 183 5684pWWOXylene TolueneP putidamt 2116580 xylEnvi Microbiol 2002 4 856pAO1NicotineArthrobacter165137ndh 6hlnoJ Bacteriol nicotinovoranskdh dhph2003 185 1976pCAR1CarbazoleP resinovoransCA10199035carABCDEFJ Mol Biol antABC2003 326 21pBD2IsopropylbenzeneRhodococcus210205ipbA1A2A3A4J Bacteriol ErythropolisBD22003 185 5269pUO1HaloacetatesDelfitia67066dehH1 dehH2J Bacteriol AcidovoransB2003 185 6741pJP42 4 DRalstonia87688tfdA tfdBEnvi Microbiol 3 chlorobenzoateeutrophaJMP134tfdCDEF2004 6 655pND6 1naphthalenePseudomonasND6101858nahGene2004 336 231pDTG1naphthaleneP putida83042nahJ Mol Biol NCIB9816 42004 341 753 Thecatabolicplasmidsthatcompletesequencehasbeendetermined PlasmidSubstratesStrainSize bp CatabolicReferencesgenes 共生质粒 symbiotic 在许多根瘤菌属细菌中存在与结瘤和固氮有关的共生质粒 质粒的大小在1000kb以上 与细菌染色体基因一起行使固氮功能 Sinorhizobiummeliloti的豆科共生复合基因组由3部分组成 染色体为3654135bp pSymA为1354226bp 结瘤和固氮 pSymB为1683333bp 中华苜蓿根瘤菌 Sinorhizobiummeliloti 1021的基因组组成性质染色体pSymApSymB基因组长度 bp 3654135135422616833336691694蛋白基因3341129315706204tRNA基因512154rRNA操纵子3003共生功能菌毛合成菌毛合成表面多糖结瘤 固氮表面多糖固氮 二 构建质粒载体的基本策略 构建质粒应该在受体细胞中进行有效的复制 并且希望在受体细胞中有较多的拷贝数 有效复制的起始位点 最好是松弛型质粒的复制起始位点 构建质粒必须含有尽可能多的允许外源DNA片断克隆位点 在质粒载体上组装多克隆位点 MCS 连杆 含有可供选择的克隆子的标记基因或报告基因 最好有两个选择标记基因 在选择标记基因区中有合适的克隆位点 Resistancegenestodifferentantibioticsinplasmidsblaorampr 抗氨苄青霉素catoramlr 抗绿霉素kanorkanr 抗卡那霉素strorstrr 抗链霉素tetortetr 抗四环素 构建的质粒载体DNA分子应尽可能的小 根据特殊需要 在构建的质粒载体上组装各种原件 克隆位点上游组装强的启动子 下游组装相应的终止子 在适当的位置组装受体细胞染色体DNA的同源序列 成为基因整合平台系统的供体质粒克隆载体 三 构建质粒载体基本原则 1 选择合适的出发质粒 亲本质粒 出发质粒应该含有载体的必备条件 2 正确获得构建质粒克隆载体的元件 一般采用RE切割出发质粒 获得某些元件 切割的位点既要保证元件的完整 又要尽可能的小 PCR技术也可以得到某些元件 设计引物时带上RE位点 3 组装合适的选择性标记基因 标记基因必须根据受体细胞的特性来决定 4 选用合适的启动子 真核基因在原核生物中表达 用原核或病毒启动子 原核基因在真核生物中表达 也用原核启动子 为了能有效的控制基因在受体细胞中的表达 最好选用外界条件诱导的启动子 5 在能达到预期目的的前体下 构建质粒克隆载体的过程尽可能的简单 一 克隆质粒载体 四 常用质粒载体 克隆质粒载体是指专用于基因或DNA片断无性繁殖的质粒载体 常用的有pBR322 pUC及其派生质粒载体 1 pBR322质粒 4363bp 优点 1 分子量较小 为4363bp 不仅利于自身DNA的纯化 可容纳的外源DNA也较大 2 具有两种抗菌素抗性基因可供转化子的选择记号 将在重组子筛选中讲 3 具有较高的拷贝数 经过氯霉素扩增后 每个细胞中可累积1000 3000个拷贝 为重组体DNA的制备提供了极大的方便 10 15tetr P2 promoter 35sequence TTGACA 33 38tetr P2 promoter 10sequence TTTAAT 45tetr P2 RNAtranscriptstart86 1276tetracyclineresistance tet CDS start86 86 1276protein id AAB59735 1 db xref PID g208959 db xref GI 208959 translation MKSNNALIVILGTVTLDAVGIGLVMPVLPGLLRDIVHSDSIASHYGVLLALYALMQFLCAPVLGALSDRFGRRPVLLASLLGATIDYAIMATTPVLWILYAGRIVAGITGATGAVAGAYIADITDGEDRARHFGLMSACFGVGMVAGPVAGGLLGAISLHAPFLAAAVLNGLNLLLGCFLMQESHKGERRPMPLRAFNPVSSFRWARGMTIVAALMTVFFIMQLVGQVPAALWVIFGEDRFRWSATMIGLSLAVFGILHALAQAFVTGPATKRFGEKQAIIAGMAADALGYVLLAFATRGWMAFPIMILLASGGIGMPALQAMLSRQVDDDHQGQLQGSLAALTSLTSITGPLIVTAIYAASASTWNGLAWIVGAALYLVCLPALRRGAWSRATST 1905 1909ropRBS1915 2106ropCDS start1915 3122 2534pMB1originofreplication counterclockwise RNAII 35toRNA DNAswitchpoint 2940 2945RNAItranscriptpromoter 35sequence TTGAAG 2962 2967RNAItranscriptpromoter 10sequence GCTACA 2976 3083RNAItranscript2534 3086RNAIItranscript complementarystrand 3096 3101RNAIItranscriptpromoter 10sequence CGTAAT 3117 3122RNAIItranscriptpromoter 35sequence TTGAGA ColE1origin RNAIisANTISENSEmessageBindsRNAIIprimertopreventRNAaseHprocessingBindingenhancedbyRomprotein Rop alsoknownasrepressorofprimer isasmallhomodimericfour helixbundleproteinformedbytheantiparallelinteractionoftwohelix turn helixmonomers TheproteinisexpressedinEscherichiacoliasamechanismforregulatingthegenecopynumbersofplasmids Left Ropisasimplefour helixbundleproteinthatiswell characterized RopcontrolsthecopynumberofColE1plasmidsbybindingtoprimerandinhibitorRNAsassociatedwiththeColE1origin Right Byexpressinggreenfluorescentprotein GFP fromaColE1plasmid wecanquicklyknowifaRopvariantisactivebasedoncellularfluorescence http www proteopedia org wiki index php Rop protein SowhatwillhappenifwealterRNAIorrop DecreasenegativeregulationofRNAIIMoreRNAIIavailableMoreplasmidreplicationExamplepUCplasmidshaveasinglemutation G A onenucleotideupstreamoftheinitiationofRNAI pUCplasmidshave500 700copiespercell RepliconsAlsoControlPlasmidCompatibility 4153 3293beta lactamase bla amp r CDS start4153 complementarystrand 4153 4085beta lactamasesignalpeptideCDS start4153 complementarystrand 4165 4161blaRBS4188bla P3 RNAtranscriptstart complementarystrand 4202 4197bla P3 promoter 10sequence GAGACA 4223 4218bla P3 promoter 35sequence TTCAAA 36 37P1RNAtranscriptstarts complementarystrand 49 44P1promoter 10sequence TAAACT 75 64P1promoter 35sequenceregion 2 pUC系列质粒 pUC18和pUC19大小只有2686bp 是最常用的质粒载体 其结构组成紧凑 几乎不含多余的DNA片段 GenBank注册号为L08752 pUC18 和X02514 pUC19 由pBR322改造而来 其中lacZ MSC 来自M13mp18 19 pUC系列质粒载体具有三个显著特点 分子量更小 仅为2 7KB 容纳外源DNA量增大 具有更高的拷贝数 不用氯霉素扩增 每个细胞含500 700个拷贝 含易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZ 乳糖操纵子的启动子 调节子和 半乳糖苷酶的 肽基因 可利用 互补原理进行蓝白筛选 将在重组子筛选中讲 多克隆位点区 MCS 由人工合成的多个单一酶切位点构成 每一种限制性内切酶会产生不同的粘性末端 可选用两种内切酶组合在质粒载体和外源DNA上产生相同的末端 进行双粘端连接 既提高克隆的效率 又可以定向克隆 其MCS区与M13mp噬菌体载体的相同 可使pUC上克隆的目的基因直接转移到M13mp载体 进行DNA测序和体外突变等研究 二 表达质粒载体expressionvector 表达质粒载体是指用于在宿主细胞中高水平表达外源蛋白质的质粒载体 表达载体根据所表达的蛋白质是否分泌到细胞外分位非分泌型表达质粒载体和表达质粒载体 根据受体细胞又可以分为原核细胞表达质粒载体和真核细胞表达质粒载体 表达质粒载体必须包含有 强 诱导型 启动子启动子的下游区和起始密码上游区的好的S D序列 核糖体结合位点 外源基因序列的下游区的强转录终止序列 大肠杆菌常用的启动子有大肠杆菌Lac Trp Tac来自 噬菌体的强启动子PL和PRT7噬菌体的T7 型 转录起始区 调控序列 启动子 终止子 型 转录起始区终止子 翻译起始区 核糖体结合序列和起始密码子 终止子 型 转录起始区 翻译起始区 信号肽链编码区 终止子 常称之为表达分泌型载体 表达质粒载体模式 Ptac 3Ptrp 11Plac 启动子 转录调控机理具有多顺反子结构 基因排列次序为 启动子 lacP 操纵基因 lacO 结构基因 lacZ lacY lacA 正调节因子CAP 突变即PlacUV5 负调节因子lacI Lac表达系统以大肠杆菌lac操纵子调控机理为基础设计 构建的表达系统 Lac表达系统负调节因子lacI在无诱导物情形下 lacI基因产物形成四聚体阻遏蛋白 与启动子下游的操纵基因紧密结合 阻止转录的起始 lacIPlaclacOlacZlacYlacA lacIPlaclacOlacZlacYlacA 转录调控机理色氨酸启动子Ptrp受色氨酸 阻遏蛋白复合物的阻遏 转录呈基底状态 在培养系统中去除色氨酸或者加入3 吲哚丙烯酸 IAA 便可有效地解除阻遏抑制作用 在正常的细菌培养体系中 除去色氨酸是困难的 因此基因工程中往往添加IAA诱导Ptrp介导的目的基因表达 Trp表达系统以大肠杆菌trp操纵子调控机理为基础设计 构建的表达系统 Trp表达系统 Tac表达系统tac启动子是由trp的 35序列和lacUV5的 10序列拼接而成的杂合启动子 调控模式与lacUV5相似 但mRNA转录水平更高于trp和lacUV5启动子 Ptac 3Ptrp 11Plac 因此在要求有较高基因表达水平的情况下 选用tac启动子比用lacUV5启动子更优越 RB791 XL I blue SB221 JM109等 lac tac表达系统存在的问题IPTG用于诱导lac tac启动子的转录 但由于IPTG本身具有一定的毒性 从安全角度 对表达和制备用于医疗目的的重组蛋白并不适合 一些国家规定在生产人用重组蛋白质的生产工艺中不能使用IPTG解决方法lac和tac启动子的转录受温度严紧调控乳糖替代IPTG诱导lac和tac启动子的转录 PL和PR表达系统以l噬菌体早期转录启动子PL PR为核心构建的表达系统在野生型l噬菌体中 PL PR启动子转录与否决定了l噬菌体进入裂解循环还是溶源循环 PL和PR表达系统转录调控的机理由l噬菌体PE启动子控制的cI基因的产物是PL PR启动子转录的阻遏物 cI基因的产物在大肠杆菌宿主中的浓度取决于一系列宿主与噬菌体因子之间的错综复杂的平衡关系 由于通过细胞因子来控制cI基因产物的产生和消失是相当困难的 因此PL PR表达系统都选用温度敏感突变体cI857 ts 的基因产物来调控PL PR启动子的转录 M5219菌株 在较低温度 30 时以活性形式存在在较高温度 42 时失活脱落 另外一种思路是通过严谨调控cI产物来间接调控PL PR启动子的转录 比如Invitrogen的PL表达系统 就是将受trp启动子严谨调控的cI基因溶源化到宿主菌染色体上 通过加入酪氨酸诱导抑制trp启动子 抑制cI基因的表达 从而解除强大的PL启动子的抑制 PL和PR表达系统存在的问题由于PL和PR表达系统诱导时不加化学诱导剂 成本又低廉 最初几个在大肠杆菌中制备的药用重组蛋白质都采用PL或PR表达系统 缺陷在热脉冲诱导过程中 大肠杆菌热休克蛋白的表达也会被激活 其中一些是蛋白水解酶 有可能降解所表达的重组蛋白 在大体积发酵培养菌体时 通过热平衡交换方式把培养温度从30 提高到42 需要较长的时间 这种缓慢的升温方式影响诱导效果 对重组蛋白表达量有一定的影响 T7表达系统大肠杆菌T7噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系 利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为T7表达系统 T7启动子是当今大肠杆菌表达系统的主流 这个功能强大兼专一性高的启动子经过巧妙的设计而成为原核表达的首选 尤其以Novagen公司的pET系统为杰出代表 T7表达系统T7噬菌体基因1编码的T7RNA聚合酶选择性的激活T7噬菌体启动子的转录 T7RNA聚合酶活性高 其合成RNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍左右 并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列 在细胞中存在T7RNA聚合酶和T7噬茵体启动子的情形下 大肠杆菌宿主本身基因 JM109 DE3 的转录竞争不过T7噬菌体转录体系 最终受T7噬菌体启动子控制的基因的转录达到很高的水平 T7表达系统转录调控的机理T7噬菌体启动子的转录完全依赖于T7RNA聚合酶 因此T7RNA聚合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式 化学诱导型温度诱导型双质粒系统 T7表达系统转录调控的机理化学诱导型噬菌体DE3是l噬菌体的衍生株 一段含有lacI lacUV5启动子和T7RNA聚合酶基因的DNA片段被插入其int基因中用噬菌体DE3的溶源菌作为表达载体的宿主菌 调控方式为化学诱导型 类似于Lac表达系统 T7RNA聚合酶基因 lac启动子 E Coli DE3 IPTG诱导 大肠杆菌中T7启动子表达调控模式图 T7表达系统转录调控的机理温度诱导型PL启动子控制T7RNA聚合酶基因 通过热诱导方式激发T7噬菌体启动子的转录 这种方式可以使本底转录降到很低的水平 尤其适用于表达对大肠杆菌宿主有毒性的重组蛋白质 T7RNA聚合酶基因 PL启动子 E Coli CE6 热诱导 cI857 T7表达系统转录调控的机理双质粒系统一个质粒带有T7RNA聚合酶基因 另一个质粒带有T7启动子和目的基因两个质粒的复制子和抗性标记不能相同调控方式为控制T7RNA聚合酶的启动子调控类型 热诱导 T7表达系统存在的问题T7表达系统表达目的基因的水平是目前所有表达系统中最高的 但也不可避免出现在相对较高的本底转录 如果目的基因产物对大肠杆菌宿主有毒性 会影响细胞的生长 解决办法之一在表达系统中低水平表达T7溶菌酶基因 因为T7溶菌酶除了作用于大肠杆菌细胞壁上肽聚糖外 还能与T7RNA聚合酶结合抑制其转录的活性 目前T7溶菌酶基因都通过共转化质拉导入表达系统 它能明显降低本底转录 但对诱导后目的基因的表达水平无明显影响 营养调控型采用大肠杆菌碱性磷酸酯酶基因phoA启动子或甘油3 磷酸转移系统ugp启动子构建表达载体 这两个启动子受在培养基中的无机磷 Pi 浓度调控 Pi 5mmol L时抑制 Pi 1mmol L时激活 具有较高的转录水平 其他表达系统 糖原调控型采用的有大肠杆菌半乳糖转移系统 mglBAEC mgl启动子或沙门氏菌阿拉伯糖基因araB启动子构建表达载体 这两个启动子受葡萄糖抑制 岩藻糖和阿拉伯糖是它们的诱导物 其调控机理类似于Lac表达系统 其他表达系统 pH调控型采用大肠杆菌赖氨酸脱羧酶基因cadA启动子构建表达载体 cadA启动子受培养基中H 浓度 即pH值调控 在pH 8时抑制 pH 6时激活 pH 6时转录活力最高 该表达系统要求菌体发酵温度控制在27 30 之间才能使目的基因得到稳定的表达 其他表达系统 溶氧调控型采用大肠杆菌丙酮酸甲酸裂解酶基因pfl启动子 硝基还原酶基因nirB启动子或透明颤菌血红蛋白基因vgb启动子构建表达载体 这些启动子中都含有对氧响应的调节因子fnr的作用位点 在富氧条件下转录被抑制 在贫氧或微氧条件下转录被激活 其他表达系统 溶氧调控型大肠杆菌GJ100有透明颤菌血红蛋白基因 vgb 启动子控制下的T7RNA聚合酶基因表达质粒 vgb基因的转录是受环境溶氧浓度调控的 在贫氧条件下vgb基因的启动子被激活 因此 用大肠杆菌GJ100作为宿主时 表达系统调控方式为贫氧诱导型 菌体发酵时的溶氧浓度可以通过控制搅拌转速和通气量加以调节 与其他调控模式相比更适合于产业化生产过程 其他表达系统 生物素调控型用大肠杆菌生物素操纵子及其调控区构建表达载体 菌体生长过程中生物素会不断消耗 当浓度到达2ng ml以下时启动子被激活 能够在没有外界的物理 化学信号的介入条件下自动诱导表达目的基因是这类表达载体的特点 其缺陷是不容易精确控制自动诱导的时刻 其他表达系统 强化转录终止的必要性外源基因在强启动子的控制下表达 容易发生转录过头现象 即RNA聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列 形成长短不一的mRNA混合物过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达 其原因如下 转录产物越长 RNA聚合酶转录1分子mRNA所需的时间就相应增加 外源基因本身的转录效率下降 如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域 如选择性标记基因和复制子结构等 则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能 甚至导致重组质粒的不稳定性 过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质 增加工程菌无谓的能量消耗 更为严重的是 过长的转录物往往不能形成理想的二级结构 从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率 终止子 强终止子的选择与使用目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上的rrnT1T2以及T7噬菌体DNA上的Tf 对于一些终止作用较弱的终止子 通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结构 以增强其转录终止作用 1 表达融合蛋白的表达载体 Fusionproteinvector 当蛋白质表达以后 有效的分离纯化或分泌就成为获得目标蛋白的关键因素 通过以融合蛋白的形式表达 并利用载体编码的蛋白或多肽的特殊性质可对目标蛋白进行分离和纯化 用作分离的载体蛋白被称为标签蛋白或标签多肽 Tag 常用的有谷胱甘肽转移酶 glutathioneS transferase GST 六聚组氨酸肽 polyHis 6 蛋白质A proteinA 和纤维素结合位点 cellulosebindingdomain 等 谷胱甘肽转移酶 六聚组氨酸肽 P SD ForeignDNA 1 1表达LacZ融合蛋白的载体如pEX1 2 3载体 PR受cIts857控制 宿主M5219含缺陷性原噬菌体 编码cIts857和N蛋白 cIts857强烈抑制基因转录 N基因可使RNApolymerase跨过基因内部潜在终止位点 一般采用42 45 灭活cIts857阻遏物 此处采用40 以减少热激蛋白的诱导并使细菌能继续生长 因为温度转换不仅可诱导PL PR启动子 也可诱导热激基因 而后者有些可编码蛋白酶 PR 1 2表达GST融合蛋白的表达载体GST表达载体在启动子tac和多克隆位点之间加入了两个与分离纯化有关的编码序列 其一是谷胱甘肽转移酶基因 其二是凝血蛋白酶 Thrombin 切割位点的编码序列 当外源基因插入到多克隆位点后 可表达出由三部分序列组成的融合蛋白 Ptac IPTG诱导GST融合蛋白 直接纯化产物切割方便 pGEX 1 T 凝血酶pGEX 2T 凝血酶pGEX 3T X因子位相载体 1 3利用T7噬菌体启动子的表达载体表达载体pET 5a是典型的pET载体 其组成是在载体的基本结构的基础上加入了T7噬菌体启动子序列及其下游的几个酶切位点 当外源基因插入到这些酶切位点后 就可在特定的宿主细胞中诱导表达 2分泌型表达载体 excretionvector 除了在细胞内表达外 还可让表达的蛋白分泌到细胞外或细胞周质区中 这种表达方式可避免细胞内蛋白酶的降解 或使表达的蛋白正确折叠 或去除N 末端的甲硫氨酸 从而达到维护目标蛋白活性的目的 利用信号肽序列作为融合标签可将融合蛋白分泌到细胞外 可利用的信号肽有碱性磷酸酶的信号肽和蛋白质A的信号肽 启动子和SD序列信号肽序列 SD下游 编码信号肽 可引导蛋白跨膜优点 分泌表达 避免降解 表达载体pEZZ18的表达元件有lac启动子 蛋白质A的信号肽序列和两个合成的Z功能域 来自金黄色葡萄球菌 Staphylococcusaureus lac启动子 Z功能域 蛋白质A的信号肽序列 蛋白质A具有与抗体IgG结合的能力 Z功能域就是根据蛋白质A中结合IgG的B功能域而设计的 融合蛋白表达后 在信号肽序列的指导下 分泌到培养基中 然后用固定了IgG的琼脂糖层析柱 通过与ZZ功能域的结合而得到纯化的融合蛋白 这个14kDa的 ZZ 肽链对融合蛋白的正确折叠几乎没有影响 StaphylococcalproteinA ZDomain 3 非融合蛋白表达载体 P SD ForeignDNA 非融合型表达载体 非融合基因 天然完整蛋白主要元件 强启动子SD ATG 第一个密码子 tac强启动子 杂合启动子trp lac 终止子 5SrRNA区域 rrnB操纵子区域 rrnBT和rrnBT2终止子 防止通读 受lac阻抑物调控 1 5mMIPTG诱导 可直接表达任何含RBS和ATG的基因 若无RBS 其ATG需与固有RBS相隔5 13bp 常用的大肠杆菌表达载体有pKK序列 tac启动子 pGEx tac启动子并含GST融合蛋白表达系统 易表达产物 要求后加工时去除非目的蛋白 pBV系统 PL PR启动子 温度诱导表达 6Xhis表达系统 pGEM T系统 PCR克隆 三 多功能质粒载体 噬菌粒 这种质粒具有多种功能 它可以根据需要进行体外的转录 克隆 测序 基因表达等方面的基因操作 的pGEM 系列质粒 的pBluescriptII系列质粒 能转录为mRNA 作基因表达用 进行测序操作 四 穿梭质粒载体 穿梭载体 shuttlevector 是指能在两种不同的生物中复制的载体 例如既能在原核生物中复制 又能在真核生物中复制的载体 因此 这类载体不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因 还有真核生物的自主复制序列 ARS 以及选择标记性状 具有多克隆位点 通常穿梭载体在细菌中用于克隆 扩增克隆的基因 在酵母菌中用于基因表达分析 a 转化Ampr大肠杆菌细胞 b 转化LEU 酿酒酵母细胞 c 质粒可在两种不同类型细胞中来回穿梭 d 涂布在含氨卞青霉素的平板选择Ampr转化子 e 徐布在无亮氨酸 LeM 的干板选挥Leu 的转化子 五重组质粒的筛选 重组质粒转化宿主细胞后 可以用许多方法从大量细胞中筛选出极少的含有重组质粒的细胞 常见的方法有插入失活 互补 直接筛选 限制酶谱分析 表达筛选和核酸探针筛选等 例如 pUC18对大肠杆菌的转化率为108 即每微克pUC18中只有108个分子能进入受体细胞 一微克pUC18共有3 4X1011个分子 6 02X1017 2686X660 也就是说 每3400个pUC18分子才有一个分子进入受体细胞 另一方面 在实际操作过程中 转化一微克pUC18共需2ml感受态细胞 大约含有2X1010个大肠杆菌细胞 也就是说 每200个细胞只有一个细胞能接纳pUC18DNA Hostalone notransformation 1x107chanceHost re ligatedplasmidHost re ligatedligatedinsertDNA noorisite Host plasmid insert recombinantmolecule 转化子 transformant 就是掺入或导入外源DNA后获得了新的遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞 包含上述三种情况 recombinant Ingeneticmappingstudiesanoffspringhavinganon parentalallelecombination Anindividualorcellwithagenotypeproducedbyrecombination 1 插入失活较早的一些载体用插入失活方法进行重组 这些载体中带有两个 或更多 抗菌素抗性基因 在这些抗性基因中有适当分布的限制酶单酶切位点可以插入外源DNA 当插入外源DNA时 抗药性基因被破坏 一 载体的遗传标记检测 插入失活和插入表达 2 正选择 正选择用环丝氨酸可直接筛选在pBR322中插入外源DNA的对Ap有抗性 对tet敏感 ampr tets 的重组子 当将转化细胞生长培养在含Tet和环丝氨酸培养液中时 含插入外源DNA的重组体terS生长受到抑制 而非重组体tetr的细胞生长 但因环丝氨酸可杀死正在生长的细胞 故tetr细胞死亡 而tets细胞仍能存活 当改变环境 将细胞接种到只含Ap的平板上时 长出的细胞中90 的是ampr tets型的为重组子 目前通用的绝大多数的大肠杆菌质粒载体都至少含有两个选择记号 在与外源DNA的重组过程中 其中一个记号保持完整 用作选择转化子 然后根据另一记导的插入失活效应进一步筛选出转化子 此则表明它带有具外源DNA插入序列的重组质粒 显而易见 如果我们能够在转化之后直接选择出重组质粒 这将为实验工作带来诸多的方便 于是研究工作者们便按照遗传学上的正选择 directselection 原理 即应用只有突变体或重组体分子才能正常生长的培养条件进行选择 发展了一系列正选择质粒载体 directselectionvector 这种质粒载体具有直接选择记号并可赋予寄主细胞相应的表型 通过选择具这种表型特征的转化子 便可大大降低需要筛选的转化子的数量 从而减轻了实验的下作量 提高了选择的敏感性 OnePickBluntEndCloningVectorisa5809bpcloningvectorthatallowsdirectselectionofpositiverecombinantsviadisruptionofthecytotoxicOPsequence ExpressionofOPproteinbyIPTGinductionresultsincelldeathofE colicontainingvectorwithoutinsertornon transformedE coli ThisproductisidealforcloningbluntendPCRproductssuchasthosegeneratedbyPFUDNAPolymerases Nobackgroundcontaminationgivesusersanalmost100 guaranteeofcloneinsertionfordownstreamprocedures TheOnePickCloningVectorisdesignedfortransformationwithincludedinducibleHITOPCompetentCells 3 4 互补利用 半乳糖苷酶基因构建载体 半乳糖苷酶 galactosidase 是一种把乳糖切成葡萄糖和半乳糖的酶 最常用的 半乳糖苷酶基因来自大肠杆菌lac操纵子 在载体中构建E coli的lac操纵子的调节序列和编码 半乳糖苷酶N末端146个氨基酸的序列 用异丙基 D 硫代半乳糖苷 IPTG 可诱导这个氨末端片段的合成 合成的片段能与宿主编码的 半乳糖苷酶基因缺陷型进行基因内互补 恢复该酶的活性 这一过程称 互补 alphacomplementation 在诱导物IPTG存在下 细菌在含色素底物5 溴 4 氯 3 吲哚 D 半乳糖苷 x gal 培养基的干板上形成蓝色菌落 当在质粒多克隆位点中插入外源DNA时 使 半乳糖苷酶的氨末端失活 从而不能进行互补 因此带有重组质粒的菌产生白色菌落 5 bromo 4 chloro 3 indolyl b D galactoside 半乳糖苷酶 galactosidase 半乳糖苷酶基因 lacZ和lacZ 半乳糖苷酶基因有1021AAs 基因产物装配为四聚体后才有酶活 该蛋白质可分为两部分 链和 链 前者负责四聚体装配 后者具 半乳糖苷酶活性 只有当两者都存在时 才会表现出酶活性 该作用称之为 互补作用 这两个部分可独立存在 分别由两个基因编码 为 链编码的基因称之为lacZ 编码145AAs 这两个基因 LacZ和LacZ 均可作为标记基因 lacZ lacZ 中含有多克隆位点