医学微生物学第五章 细菌的遗传与变异.ppt

改变花色的转基因矮牵牛花 转入荧光素酶蛋白基因的发荧光烟草 蓝色玫瑰一直是人类美丽的梦想基因工程已将它变为现实 转基因西红柿 由于细菌个体微小 遗传物质较为简单 易于人工培养 繁殖速度快 突变型容易识别和检出 因此 细菌一直被用做研究生物遗传与变异规律的实验材料 利用人工诱变或杂交选育医药或食品工业中所需要的高产菌株 利用分子生物学技术 构建 基因工程菌 生产新药 疫苗 食品添加剂 或者用于环保等 一 细菌遗传的物质基础二 细菌的基因突变三 细菌的基因转移与重组四 微生物基因组学五 基因工程菌株的构建 细菌的遗传与变异 1 细菌染色体基因组结构 细菌染色体是一个裸露的闭合环状的双链DNA分子 有核蛋白 缺乏组蛋白 无核膜包裹 一 细菌遗传的物质基础 细菌基因组结构的主要特征 1 遗传信息是连续的 不含内含子 很少有重复序列 2 通常 编码相关功能的基因高度集中 组成操纵子 operon 结构 自一个启动子开始转录成多基因的mRNA分子 翻译成多种功能相关的蛋白质 一 细菌遗传的物质基础 2 质粒 plasmid 一 细菌遗传的物质基础 是细菌染色体外的遗传物质 大多由闭合环状双链DNA组成 具有自我复制的能力 所携带的基因赋予宿主菌某些生物学性状 如F质粒 R质粒 毒力质粒 代谢质粒 增加细菌的存活机会 非生存所必需 可自行丢失或消除 可在细菌之间转移 质粒DNA的特征 一 细菌遗传的物质基础 3 转座子 transposon 一 细菌遗传的物质基础 是一个DNA片段 2kb 可在质粒与质粒之间或质粒与染色体之间随机转移 故又称为 跳跃基因 转座子不能自我复制 转座子 质粒 转座子的结构特点 2个末端反向重复序列 能为整合酶所识别 与插入功能有关 一 细菌遗传的物质基础 中心序列 带有遗传信息 如常带有耐药基因 细菌毒素基因 整合酶 或转座酶 基因 一 细菌遗传的物质基础 当转座子插入到某一基因组中 可能会产生什么遗传学效应 一 细菌遗传的物质基础 可引起插入基因失活 产生基因突变 在插入部位又出现一个或多个耐药基因 使细菌产生耐药性或多重耐药性 4 噬菌体 bacteriophage 一 细菌遗传的物质基础 噬菌体是感染细菌 真菌 放线菌或螺旋体等微生物的病毒 转座子 质粒 一 细菌遗传的物质基础二 细菌的基因突变三 细菌的基因转移与重组四 微生物基因组学五 基因工程菌株的构建 细菌的遗传与变异 基因突变 genemutation 细菌染色体基因发生突然而稳定的结构改变 包括一对或少数几对碱基的缺失 插入或置换 点突变 pointmutation 导致细菌性状的遗传性变异 1 概念 二 细菌的基因突变 随机发生 不定向 稳定 自发突变产生频率为10 10 10 6 可诱发性 野生株 突变株 2 特点 二 细菌的基因突变 耐药性突变 选择标记 毒力突变 疫苗研制 新现传染病 营养缺陷体突变 新药诱变作用检测 高产突变 抗生素等药品 食品生产 抗原性突变 逃逸免疫机制 3 突变现象 二 细菌的基因突变 日本发生过一次细菌性痢疾大流行 从病人粪便中分离到大量的痢疾杆菌敏感株和耐药株 同时耐链霉素 氯霉素 四环素 磺胺类 且大肠杆菌与痢疾杆菌有完全相同的多重耐药性 多重耐药性传播迅速 耐药菌在传代 保藏过程中可自发失去耐药性 能否用基因突变解释以上现象 三 细菌的基因转移与重组 一 细菌遗传的物质基础二 细菌的基因突变三 细菌的基因转移与重组四 微生物基因组学五 基因工程菌株的构建 细菌的遗传与变异 供体菌 donor 将遗传物质转移至受体菌 recipient 使后者获得新的生物学性状 称为基因转移 genetransfer 细菌通过水平方向的基因转移和重组 产生新的基因型个体 以适应随时改变的环境 基因转移的概念 三 细菌的基因转移与重组 质粒 plasmid 转座子 transposon 温和噬菌体 temperatephage 基因转移的元件 三 细菌的基因转移与重组 接合 conjugation 转化 transformation 转导 transduction 转座 transposition 基因转移的方式 三 细菌的基因转移与重组 1 接合 conjugation 三 细菌的基因转移与重组 接合 供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触 并将遗传物质 主要是质粒DNA 转移给受体菌 使受体菌获得新的遗传性状 三 细菌的基因转移与重组 质粒 质粒接合转移示意图 染色体 性菌毛 受体菌 供体菌 三 细菌的基因转移与重组 赋予宿主菌的耐药性 编码性菌毛 决定自主复制与接合转移 耐药性 R 质粒 三 细菌的基因转移与重组 R质粒主要以接合方式从耐药菌传递给敏感菌 使后者变为耐药菌 R质粒在同一种属或不同种属细菌之间传递 造成耐药性的广泛传播 尤其在肠道杆菌中比较普遍 给临床治疗带来很大困难 三 细菌的基因转移与重组 日本发生过一次细菌性痢疾大流行 从病人粪便中分离到大量的痢疾杆菌敏感株和耐药株 同时耐链霉素 氯霉素 四环素 磺胺类 且大肠杆菌与痢疾杆菌有完全相同的多重耐药性 多重耐药性传播迅速 耐药菌在传代 保藏过程中可自发失去耐药性 能否用基因突变解释以上现象 三 细菌的基因转移与重组 三 细菌的基因转移与重组 三 细菌的基因转移与重组 三 细菌的基因转移与重组 三 细菌的基因转移与重组 Griffith肺炎链球菌感染小鼠实验 1928 无荚膜活菌 有荚膜活菌 有荚膜死菌 三 细菌的基因转移与重组 有荚膜的活菌 三 细菌的基因转移与重组 活的无荚膜肺炎链球菌从死的有荚膜肺炎链球菌中获得荚膜 毒力决定因子 编码基因 称之为转化 transformation 引起转化现象的物质称为转化因子 Avery研究揭示 转化因子的本质是DNA 即遗传物质是DNA 1944年 获得诺贝尔医学生理学奖 三 细菌的基因转移与重组 2 转化 transformation 三 细菌的基因转移与重组 转化 受体菌从周围环境中直接摄取供体菌游离的DNA片段 并整合入受体菌基因组中 从而获得供体菌部分遗传性状的过程 三 细菌的基因转移与重组 1 转化的前提条件 供体菌DNA片段的大小 10 20个基因 供体DNA性质 同源性高的 未变性的双链DNA 质粒DNA 受体菌的生理状态 处于 感受态 三 细菌的基因转移与重组 2 自然转化过程 三 细菌的基因转移与重组 受体菌处于感受态 competence Ca2 诱导法 电穿孔法受体细胞经过一些特殊方法处理后 细胞膜的通透性发生了暂时性的改变 成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞 转化因子的结合与进入双链DNA与感受态受体菌表面的DNA结合受体结合 其中一条链被降解产生能量 另一条链与特异DNA结合蛋白形成复合物 进入菌体内 三 细菌的基因转移与重组 转化因子的整合单链DNA不经复制 与受体菌同源DNA区段的单链配对 被取代的受体菌DNA单链被降解 最终产生转化子 三 细菌的基因转移与重组 有荚膜的活菌 三 细菌的基因转移与重组 3 转导 transduction 三 细菌的基因转移与重组 以温和噬菌体为媒介 将供体菌DNA片段 染色体DNA 非接合性质粒DNA 转移到受体菌内 通过基因重组而使受体菌获得新的遗传性状 三 细菌的基因转移与重组 1 转导的概念 是感染细菌 放线菌 真菌等的病毒 分为头部和尾部 头部由核心 核酸 和衣壳 蛋白质 构成 能通过细菌滤器 须寄生在活的易感宿主菌体内 三 细菌的基因转移与重组 2 噬菌体 phage 3 温和噬菌体 烈 毒 性噬菌体 virulentphage 噬菌体在宿主菌体内复制增殖 产生大量子代噬菌体 并最终裂解细菌 建立溶菌周期 三 细菌的基因转移与重组 三 细菌的基因转移与重组 温和噬菌体 temperatephage 感染宿主菌后 不立即增殖 而是将其核酸整合到宿主菌染色体基因组中 与宿主菌DNA一起复制 并随细菌的分裂而传至子代细菌 前噬菌体 溶原性细菌 有些温和噬菌体可使溶原性细菌的表型发生相应改变 称之为溶原性转换 lysogenicconversion 例如 白喉棒状杆菌若携带 噬菌体时 可产生白喉毒素 三 细菌的基因转移与重组 溶原性细菌能正常以二分裂方式繁殖 前噬菌体也一代一代传下去 但有时也会自发终止 发生率10 5 从染色体上脱落 进入溶菌周期 三 细菌的基因转移与重组 4 转导的机制 前噬菌体从染色体上脱离进行增殖 装配成新的子代噬菌体 大约在105 107次装配中发生一次错误 误将大小合适的供体菌DNA片段装入噬菌体头部 成为 假噬菌体 三 细菌的基因转移与重组 假噬菌体 供体菌 当 假噬菌体 转导噬菌体 再度感染受体菌时 将供体菌DNA带入受体菌内 完全转导与流产转导 普遍性转导 局限性转导 三 细菌的基因转移与重组 假噬菌体 受体菌 供体菌DNA 一 细菌遗传的物质基础二 细菌的基因突变三 细菌的基因转移与重组四 微生物基因组学五 基因工程菌株的构建 细菌的遗传与变异 微生物基因组学 Genomics 是利用全基因组DNA序列研究微生物基因及其功能的学科 四 微生物基因组学 细菌是研究和分析基因组序列与相关生物学功能关系的理想模式 首先 用超声波将细菌染色体DNA随机切割成一定大小的DNA片段 插入到测序载体 质粒 中 以构建DNA文库 进行大规模的测序 对DNA序列加以拼接 1 核苷酸序列测定 四 微生物基因组学 经过计算机分析 完成全基因组各个区域的编号和注释 最后存入数据库 并在互联网上发表 以供全世界的科学家参考和使用 四 微生物基因组学 细菌全基因组序列测定完成后 更重要的任务是鉴定基因及尽可能确定基因的功能 称之为后基因组学 2 微生物基因组结构与功能研究 四 微生物基因组学 3 微生物基因组学研究的意义 四 微生物基因组学 根据病原菌全基因组序列 应用现代生物信息软件对基因序列进行分析 可确定哪些基因与毒力 体内定居或体内持续感染有关 从而阐明病原菌致病基因及其产物 1 揭示病原微生物的致病机制 四 微生物基因组学 从分子和细胞水平上 揭示微生物与宿主之间的相互作用 更深入地阐明病原微生物的致病机制 诸如毒素作用机制 宿主细胞中微生物的受体 侵入细胞内微生物的定位和新表位的发现 对宿主免疫系统的反应等 四 微生物基因组学 2 建立灵敏特异的基因诊断技术 传统的病原体诊断依赖于致病微生物的形态 培养和生化特征 通过测定多种致病与非致病微生物的基因组序列 可以获得大量的基因信息 如特异DNA序列用于诊断 菌株特异性基因用于分型 四 微生物基因组学 图2引物特异性单重PCR电泳结果m100bpMarker 1CMCC51252 2CMCC51572 3CMCC51592 4GIM Shi1 5GIM Shi2 6ATCC9027 7ATCC15442 8CMCC10104 9GIM Ps 10ATCC43889 11GDCIQ O157 1 12GDCIQ O157 2 13CMCC50093 14CMCC50071 15CMCC50115 16CMCC47001 17GIM Vp 18GDCIQ Vp 3 开发新型抗菌药物 病原菌全基因组序列的测定 一方面 能揭示细菌耐药的确切机制 对现有抗菌药物进行改造或开发新型药物 四 微生物基因组学 另一方面 可使药物的研发策略从筛选化合物库转向优先筛选靶位基因 即以病原菌为目标 找出在人类基因组中缺失 对耐药菌生存必不可少并在感染过程中优先表达的基因 选择这些基因作为抗菌药物的靶位点 可设计出具有针对性很强的药物 窄谱抗生素 四 微生物基因组学 病原菌全基因组序列的测定 还可大大加速新疫苗的研制 4 开发新型疫苗 四 微生物基因组学 通过生物信息学软件 对全基因组序列进行分析 可预测出病原体的具有很高免疫原性的保护性抗原及其表位 将抗原或表位编码基因在合适的载体系统中表达 分离纯化目的抗原或表位 最后 检测抗原的安全性和有效性 四 微生物基因组学 随着微生物基因组被解码和微生物功能基因组的研究与开发 微生物学正面临着革命性的飞跃 微生物基因组研究所获得的信息将迅速转化为生产力 微生物感染性疾病的诊 防 治 将会彻底得到改观 四 微生物基因组学 一 细菌遗传的物质基础二 细菌的基因突变三 细菌的基因转移与重组四 微生物基因组学五 基因工程菌株的构建 细菌的遗传与变异 目的基因 重组质粒 转化 目的蛋白 五 基因工程菌株的构建 重组DNA技术 基因工程菌 五 基因工程菌株的构建 质粒作为一种独立的复制子 容易从细胞中分离出来 在体外进行遗传操作和转入到合适的受体细胞中 表达外源目的基因 自主复制 可表达外源基因 限制性酶切位点 选择性标记 耐药性 五 基因工程菌株的构建 质粒可作为表达载体 首先在体外构建重组质粒 携带目的基因 再转入原核表达系统 大肠杆菌 或真核表达系统 酵母菌 中 构建 基因工程菌株 大量表达目的基因 获得目的蛋白 如氨基酸 味精 抗生素 胰岛素 干扰素 生长激素 乙肝疫苗 五 基因工程菌株的构建 幽门螺杆菌 Helicobacterpylori Hp 是慢性活动性胃炎和消化性溃疡的致病菌 并与胃腺癌和胃部淋巴瘤的发生密切相关 立论依据 五 基因工程菌株的构建 我国人口Hp感染率为70 目前主要采用的抗生素疗法 三联药物 埃索美拉唑 阿莫西林 克拉霉素 的疗效不甚理想 易复发 疫苗被认为是控制Hp感染最有效的方法 五 基因工程菌株的构建 全菌灭活疫苗 亚单位疫苗由于以上疫苗各自的缺陷 目前尚无安全 有效的疫苗应用于临床 鉴于Hp经黏膜途径入侵人体 黏膜免疫在抗感