高中生物：1.2《 基因工程的应用》江苏课件（苏教版选修3）.ppt

多聚酶链式反应扩增dna片断 分子生物学研究中最强大的实验技术之一 其本质是在体外模拟胞内dna分子复制的过程 美国科学家穆利斯 k b mullis 发明了pcr技术1993年诺贝尔奖 一 多聚酶链式反应 是一种体外迅速扩增dna片段的技术 能以极少量的dna为模板 在几小时内复制出上百万份的 拷贝 广泛应用于遗传病的诊断 刑侦破案 古生物学 基因克隆和dna序列测定等 二 dna分子的结构 1 基本组成单位 脱氧核苷酸 脱氧核苷酸结构式 3 5 一个核苷酸上的磷酸基团上的 oh 和另一个核苷酸分子的第三位碳原子上的羟基之间失去一分子水 形成磷酸二脂键 即在相邻的两个脱氧核苷酸的3 和5 碳原子之间形成磷酸二脂键 数量庞大的四种脱氧核苷酸通过3 5 磷酸二脂键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链 通常将dna的羟基 oh 末端称为3 端 而磷酸基团的末端称为5 端 2 多脱氧核苷酸链的形成 多脱氧核苷酸链结构简图 3 dna分子的双螺旋结构特点 dna分子是由两条反向平行的 即一条链为3 5 另一条链为5 3 脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则双螺旋结构 脱氧核糖与磷酸交替连结 排列在外侧 构成基本骨架 碱基排列在链的内侧 两条链上的碱基通过氢键连结起来 形成碱基对 碱基对的组成有特定的规律 即腺嘌呤一定与胸腺嘧啶配对 鸟嘌呤一定同胞嘧啶配对 三 dna的复制 2 时期 有丝分裂间期或减数第一次分裂前的间期 3 场所 细胞核 主 线粒体 叶绿体 4 模板 dna母链 1 概念 由一个dna形成两个完全相同的dna的过程 5 原材料 脱氧核苷酸 6 基本条件 酶 atp 原料 模板 7 复制过程 dna的解旋 亲代dna分子利用细胞提供的能量在解旋酶的作用下氢键断裂 部分双螺旋链解旋为两条平行的双链 rna引物的合成 以单股dna为模板 在引物酶的作用下合成小段的rna引物 dna的生成 以单股的dna为模板 在dna聚合酶的作用下 在rna引物的末端由5 端 3 端合成dna 边解旋边复制 过程 8 复制特点 半保留复制 结果 9 遵循原则 碱基互补配对原则 10 精确复制的原因 11 复制的意义 dna分子通过复制使遗传信息从亲代传给了后代 从而保持了遗传信息的连续性 规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板 碱基互补配对能力保证了复制准确无误的进行 总结 胞内dna复制的基本体系 打开dna双链提供dna复制的模板合成子链的原料催化合成dna子链使dna聚合酶能够从引物的3 端开始连接脱氧核苷酸 四 pcr 多聚酶链式反应 1 pcr原理 在80 100 的温度范围内 dna的双螺旋结构将解体 双链分开 这个过程称为变性 当温度缓慢降低后 两条彼此分离的dna链又会重新结合成双链 pcr利用了dna的热变性原理 通过控制温度来控制双链的解聚与结合 现在使用的pcr仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器 变性 复性 延伸 加热到90 dna双链解旋为单链 降到50 引物通过碱基互补配对与单链dna结合 升温到72 四种脱氧核苷酸在dna聚合酶的作用下 根据碱基互补配对原则合成新的dna链 2 细胞内和细胞外dna复制环境的区别 细胞内源引物合成酶细胞内源细胞内源细胞内环境 外源加入外源加入外源加入外源加入缓冲液 pcr过程需要的引物不是rna 而是人工合成的dna单链 其长度通常为20 30个脱氧核苷酸 3 细胞内复制和pcr的主要不同点 pcr过程中dna的解旋不依靠解旋酶 而是通过对反应温度的控制来实现的 4 dna聚合酶特性 不能从头合成dna 只能从dna的3 端开始延伸dna链 因此 dna复制需要引物 5 dna聚合酶作用过程 当引物与dna母链通过碱基互补配对结合后 dna聚合酶就能从引物的3 端开始延伸dna链 dna的合成方向总是从子链的5 端向3 端延伸 高温解决了打开双链的问题 但又导致dna聚合酶失活的问题 耐高温的taqdna聚合酶解决了高温导致dna聚合酶失活 促成了pcr技术的自动化 6 taqdna聚合酶的应用 7 缓冲液需要为pcr反应提供的物质 dna模板 分别与两条模板链相结合的两种引物 四种脱氧核苷酸 耐热的dna聚合酶存在于缓冲液中 同时通过控制温度使dna复制在体外反复进行 pcr技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术 它具有特异 敏感 产率高 快速 简便 重复性好 易自动化等特性 8 pcr技术的特点 五 pcr的反应过程 1 pcr的反应步骤 pcr一般经历三十多次循环 每次循环可以分为三个基本步骤 变性 复性和延伸 变性 模板dna解旋 模板dna经加热至900c以上 一定时间后 使模板dna双链或经pcr扩增形成的双链dna解离 使成为单链 以便于它与引物结合 为下轮反应作准备 2 循环过程 pcr循环第一步 高温变性 复性 退火 低温复性 模板dna经加热变性成单链后 温度降到500c左右 引物与模板dna单链的互补序列配对结合 pcr循环第二步 引物与靶序列退火 延伸 中温延伸 dna模板 引物结合物在taqdna聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料 以母链为模板 按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理 合成一条新的dna链 3 30次循环后靶序列扩增的数量 六 pcr的实验操作 1 pcr仪 一 设备及用具 实质上一台能够自动调控温度的仪器 2 微量离心管 一种薄壁塑料管 总容积为0 5ml 3 微量移液器 用于定量转移pcr配方中的液体 其上的一次性吸液枪头用一次更换一次 pcr仪 微量离心管 一次性吸液枪头 调节轮 卸枪头按钮 推动按钮 卸枪头器 微量移液器 二 实验操作步骤 一 理论上dna扩增数目的计算 七 课题成果评价 1 一条dna 复制n次 dna为2n 2 a条d