第三章 蛋白质工程习题答案201111.pdf

第三章 蛋白质工程 习题参考答案 1 名词解释 蛋白质工程 蛋白质分子设计 嵌合抗体 PDB 蛋白质工程 基于对蛋白质结构和功能关系的认识 进行分子设计 通 过基因工程途径定向地改造蛋白质或创造呵护人类需要的新的突变蛋白 质的理论及实践 蛋白质分子设计 为有目的的蛋白质工程改造提供设计方案 即在知道 了需要改造的蛋白质的性能及其相应的结构基础之后 通过理论的方 法 提出蛋白质改造的设计方案 嵌合抗体 用DNA重组技术将鼠源单抗的可变区 V区 基因与人免疫球蛋 白 Ig 的恒定区 C区 基因相连接 构建成嵌合基因 导入宿主细胞进 行表达 由此制备的抗体称为嵌合抗体 PDB 即蛋白质结构数据库 Protein Data Bank 由美国纽约Brookhaven 国家实验室于1971年创建 该数据库主要收集了通过X射线衍射和核磁 共振 NMR 试验测定的蛋白质的三维结构数据 还包括核酸 糖 类 蛋白质与核酸复合物的三维结构 2 请列表总结基因工程和蛋白质工程的相同点 不同之处 从结果 实质 流程等方面 及其联系 基因工程蛋白质工程 相同点 操作环境 生物体外 操作对象 基因 操 作水平 分子 结果天然存在的蛋白自然不存在的蛋白 实质基因重组基因修饰或基因合成 流程中心法则中心法则逆推 联系 蛋白质工程是在基因工程基础上的延伸 是 第二代基因工程 3 蛋白质工程的基本目标 基本途径是什么 基本目标 是以蛋白质分子结构规律及其生物功能的关系为基础 通 过DNA重组技术 从生物细胞中分离出编码蛋白质的基因 有针对性 地进行基因修饰或基因合成 在将其在特定的受体 宿主 细胞中表 达 以实现对现有蛋白质的定向改造或设计构建 并最终生产出比天 然蛋白质性能更加优良 更加符合人们需要的新型蛋白质 基本途径 1 分离纯化需要的改造的目的蛋白质 2 对已分离纯化的蛋白质进行氨基酸序列测定 蛋白质晶体X射线衍射 分析或蛋白质溶液核磁共振分析等一系列测试获得更多的蛋白质的结 构与功能的知识信息 3 通过蛋白质序列 设计核酸引物或探针 从cDNA文库或基因组文库 中获取编码该蛋白质的基因序列 4 设计改造方案 5 对基因序列进行改造 6 将改造过的基因片段插入适当的载体并加以表达 7 分离 纯化表达产物并对其进行结构和功能检测 4 目前有哪些蛋白质工程分子改造的常用方法 1 基因定点突变技术 即通过在DNA水平上进行碱基的取代 插入或缺失 达到改变基因 从而改变编码的蛋白质的结构的技术 2 基因剪切和融合 将编码某蛋白的部分基因移植到另种蛋白基因上 经克隆 表达 产 生新的融合蛋白 3 基因全合成 合成DNA 然后表达出相应蛋白 可以全部由人工控制 便于设计和 改造 还适用于同时实现多处突变 5 蛋白质工程中增加蛋白质稳定性的基本途径有哪些 稳定蛋白质空间构象的主要因素是蛋白质分子众多基团间的相互作 用 如肽键和侧链间的氢键 带有不同电荷的侧链间的静电作用 极性 氨基酸残基侧链间的偶极作用 疏水残基间的疏水作用以及分子内的二 硫键等 蛋白质结构与功能研究表明 上述稳定蛋白质空间构象的因素是由 蛋白质一级结构中某一个或某一段氨基酸序列决定的 人工改变或修饰 这些氨基酸残基 有可能增加蛋白质的稳定性 又不影响其生物学活 性 目前一般是通过定点突变方法 用稳定的氨基酸取代不稳定的氨基 酸残基 从而提高其稳定性 总结如下 目 标可采取措施 提高对热稳定性 增加分子内二硫键 增加分子表面盐键 调整分子内疏水基团 相互作用 增加分子内含键数量 增加对pH稳定性 置换分子内部分氨基酸 调整分子内带电荷基团 增强抗氧化能力 将Cyc置换为Ala或Ser 将Trp置换为Phe或Tyr 增强抗重金属离子的 将Cyc置换为Ala或Ser 能力 改变分子表面的羧基 6 请简述PCR介导的定点突变技术原理及优缺点 原理 需要4种引物 进行3次PCR反应 头两次PCR反应中 应用两个互 补的并在相同部位具有相同碱基突变的内测引物 扩增形成两条有一端 可彼此重叠的双链DNA片段 去除未渗入的多余引物之后 通过变性 退火形成具有3 凹末端的异源双链分子 在TaqDNA酶的作用下 产生 含重叠序列的双链DNA分子 在用两个外侧寡核苷酸引物进行第三次PCR 扩增 便产生突变体DNA 优点 操作较简单 突变的成功率可达100 缺点 后续工作较复杂 PCR扩增产物通常需要连接到载体分子上 然后才 能对突变的基因进行转录 翻译等方面的研究 不论是用普通的TaqDNA聚合酶还是高保真的Pfu酶 PCR方法产生的 DNA片段都要进过核苷酸序列测定 才可以确证有无发生其他突变发 生 7 举例说明蛋白质工程在医药等领域的应用成果 以下为几位同学的本题答案 供参考 A同学 a 酶的改造 如治癌酶的改造 提高疱疹病毒胸腺嘧啶激酶的催化 能力 从而有效阻断DNA合成 杀死癌细胞 b 蛋白质或肽类药物的改造 如生长激素改造 水蛭素 抗病毒药 干扰素改造等 通过蛋白质结构改造 改变其功能 从而提高药 效 c 重组药物的生产有重组胰岛素 在大肠杆菌中合成人生长素 重 组凝血因子 其他人类蛋白质的合成 重组疫苗等 d 提高重组蛋白的活性 改善制品的稳定性 提高生物利用度 延 长制品在体内的半衰期 降低制品的免疫原性等 如胰岛素的蛋白 质工程 e 在单抗人源化合制造融合蛋白方面起着重大作用 B同学 1 抗体工程 临床用鼠源单抗 面临免疫排斥问题 引起失效和过敏 因此兴 起了抗体工程 有嵌合抗体 重构抗体 单链抗原结合区 单功能域抗 体及全套抗体研究 其主要目的是使鼠源性抗体 人源化 嵌合抗体 用DNA重组技术将鼠源单抗的可变区 V区 基因与人免疫球 蛋白 Ig 的恒定区 C区 基因相连接 构建成嵌合基因 导入宿主细胞进 行表达 制成嵌合抗体 目前国内外已制备了数十种嵌合抗体 该抗体 的 人源化 使其免疫原性大为降低 在初期临床试验中 人源化嵌合抗体能够解决一些问题 且半衰期可以延长许多倍 但尚不 能全部解决免疫原性问题 有的嵌合抗体仍引起免疫反应 重构抗体 是将动物抗体中的高可变区 又称补体决定区与人抗体相 应的区域交换而重新构建抗体的补体决定区 以进一步 人源化 降 低单抗的免疫原性 现已构建成功数种重构抗体 它们的抗原结合能力得以保持 2 改良枯草杆菌蛋白酶的性质 218位Asn 变成Ser 用65 的失活半衰期衡量 从59分钟增到223 分钟 酶的稳定性显著增加 1985年Wells证明若用其他氨基酸取代Met222 可以提高枯草杆菌 蛋白酶的氧化稳定性而又保持高催化活性 枯草杆菌蛋白酶可作为洗涤剂的添加剂 但底物作用范围过窄 针 对Phe羧基所形成的肽键 用Lys取代位于活性中心166位的Gly 使其 底物作用范围拓宽 3 改良胰岛素 天然胰岛素制剂在储存中易形成二聚体和六聚体 延缓胰岛素从注 射部位进入血液 从而延缓了其降血糖作用 也增加了抗原性 这是胰 岛素B23 B28氨基酸残基结构所致 利用蛋白质工程技术改变这些残 基 则可降低其聚合作用 使胰岛素快速起作用 该速效胰岛素已通过 临床实验 4 改良生长激素 生长素有时会结合催乳激素受体 引起副作用 18位 21位氨基 酸改造 可能有望降低这种副作用 5 改良治癌酶 改良疱疹病毒的胸腺嘧啶激酶有杀死癌细胞功能 有人筛选到6个 AA替换后 活性部位附近 催化能力大大提高 6 改良T4溶菌酶 将T4溶菌酶的第3位异亮氨酸变成半胱氨酸 后者与第97位的半胱 氨酸形成二硫键 从而稳定了两个结构域所形成的活性中心 使酶在高 温下的稳定性大大提高 如果将该酶的第51位苏氨酸换成脯氨酸 可使 酶的活性提高25倍 Fe 这die 伟的会醒呢像豆尼