降解酒糟生物质的纤维素分解细菌的筛选及产酶研究_大学本科毕业论文.docx

本科毕业论文（设计）论文（设计）题目：降解酒糟生物质的纤维素分解细菌的筛选及产酶研究学 院： 农 学 院 专 业： 农业资源与环境 班 级：09 农 资 学 号：0909010165 学生姓名： 指导教师： 2013年 5 月 28 日贵州大学本科毕业论文（设计）诚信责任书本人郑重声明：本人所呈交的毕业论文（设计），是在导师的指导下独立进行研究所完成。毕业论文（设计）中凡引用他人已经发表或未发表的成果、数据、观点等，均已明确注明出处。矚慫润厲钐瘗睞枥庑赖。特此声明。论文（设计）作者签名： 日 期： IV 贵 贵州大学本科毕业论文（设计） 目 录摘 要IIAbstractIII1前言11.1研究意义及目的11.2纤维素分解细菌的简介11.3国内外研究概况22材料与方法32.1供试样地区域概况32.2样品基本理化性质32.3研究内容和技术路线42.3.1主要研究内容42.3.2技术路线图42.4培养基52.5主要试剂和仪器52.5.1试剂52.5.2主要仪器62.6方法72.6.1分离、纯化72.6.2细菌初筛72.6.3细菌生长曲线的测定72.6.4纤维素分解细菌的复筛83结果与分析103.1分离、纯化结果103.2菌株初筛结果103.2.1初筛情况统计103.2.2初筛的保存123.3细菌生长曲线测定结果123.4纤维素分解细菌的复筛结果133.5滤纸条崩解实验154结果与讨论17参考文献19致 谢20降解酒糟生物质的纤维素分解细菌的筛选及产酶研究摘 要本试验从茅台酒厂提供的样品中分别从30和50下分离出能分解利用羧甲基纤维素（CMC-Na）的细菌共244株。经革兰氏碘液染色，在CMC-Na培养基上生成透明圈与菌落半径的比值大于5.0的有103株，大于10.0的有12株，其中，菌株BL5-95的透明圈与菌落半径比值最大，达到15.0。在这103株菌中，产透明圈半径大于1.5 cm（30）和2.0 cm（50）的菌株有20株。本试验分别从50C和30培养筛选条件下选取7株和6株，对这些菌株进行纤维素酶活及其他各项指标的测定。聞創沟燴鐺險爱氇谴净。菌株的生长曲线试验分别在30（中温）条件下静置培养和50（高温）条件下振荡进行培养。通过不同温度分离筛选条件下得到的菌株分别在其对应温度下的生长曲线可以看出，高温振荡培养的菌株会在试管表面长出菌苔，菌液澄清，试管底部有沉淀；中温静置培养条件下的菌株菌液整体浑浊，分布均匀。高温振荡培养的菌株在培养前期（12 h）生长快于低温静置培养的菌株，但培养3 d后，二者生长趋势趋向一致，但中温条件下筛选的部分菌株（BL5-106）性能优于高温条件下筛选得到的菌株。残骛楼諍锩瀨濟溆塹籟。通过纤维素酶活力鉴定，菌株BL5-106的酶活力最高，达到93.87 U/mL，表明该菌株最具研究价值，该探究也为下一阶段的堆肥试验提供了前期准备及研究用菌。酽锕极額閉镇桧猪訣锥。关键词：纤维素分解细菌，酶活性，纤维素酶，筛选Screening of Vinasse Cellulose Decomposing Bacteria and Research on Enzyme Production彈贸摄尔霁毙攬砖卤庑。Abstract244 bacteria strains which could form a sharp and distinct zone around the cellulase-producing microbial colonies on carboxymethylcellulose (CMC) plates with Grams iodine had been isolated. There were 103 strains which the radius ratio of distinct zone and colony was more than 5.0, and among which, the radius ratio was more than 10.0 were 12 strains. Especially, the radius ratio of strain BL5-95 was the highest (15.0). The strain number which the radius of distinct zone was more than 1.5 cm under 30 and more than 2.0 cm under 50 conditions was 20. In this study, 7 strains from 50 conditions and 6 strains from 30 conditions had been chosen to assay the active of cellulases and other index.謀荞抟箧飆鐸怼类蒋薔。The growth curve of strains test were cultured under 30 static culture and 50 oscillation conditions, respectively. There were lawns appearing on the culture medium surface, and the liquid were clarification under oscillation conditions. However, there was precipitation in the bottom of the test tube. In contrast, the liquid were overall turbidity under static conditions. Strains cultured under 50 oscillation conditions grew faster than the strains from 30 conditions during the earlier incubation stage, however, the growth from different conditions were consistency after incubation 3 d. The performance of strain BL5-1-6 from 30 conditions was better than the strains from 50 conditions.厦礴恳蹒骈時盡继價骚。The cellulose active of BL5-106 was the highest, which was 93.87 U/mL. This study provides preparation and microbes for the composting experiment.茕桢广鳓鯡选块网羈泪。Keywords: cellulose decomposing bacteria, enzymatic activity, cellulase activity, screening鹅娅尽損鹌惨歷茏鴛賴。第 2 页 贵 贵州大学本科毕业论文（设计） 1前言1.1研究意义及目的酒糟是酿酒业最主要的副产物，在我国，每年白酒酒糟产量都在2500万t以上1。由于酒糟酸度偏大，可生化性较较强，极易腐烂，不便存储，若不及时处理，易对环境造成极大的污染2。籟丛妈羥为贍偾蛏练淨。酒糟生物质主要由纤维素和木质素构成，同时含有一定的残余糖分、淀粉、粗脂肪和蛋白质3，因此，可利用具有降解纤维素的菌种对其进行分解，把其中部分纤维素转化为有机质等，从而提高酒糟的综合利用效率4。預頌圣鉉儐歲龈讶骅籴。对纤维素酶产生菌的研究过去多集中于真菌的研究和应用，鉴于细菌繁殖和产酶速度快、发酵周期短，有利于工业生产，故近年来对细菌产纤维素酶日益引起重视。纤维素酶的比活力一般都很低，因而产酶成本高。据估计，纤维素水解成葡萄糖所需的酶蛋白要比淀粉相应水解所需的酶蛋白多100倍，这是影响纤维素酶实际应用的重要原因之一5。因而，筛选纤维素酶比活力高的菌株无疑具有重要的意义。渗釤呛俨匀谔鱉调硯錦。本试验针对酒糟生物质降解慢的难题，拟从茅台酒厂提供的样品中分离细菌，筛选出酶活性较高的纤维素细菌菌株，对筛选的菌株进行产酶特性初步研究，以此为依据优化产酶条件，以期为酒糟综合利用研究提供科学依据。铙誅卧泻噦圣骋贶頂廡。1.2纤维素分解细菌的简介能产纤维素酶的细菌种类虽不如真菌，生孢食纤维菌属( Sporocytophaga ) 、有报道的食纤维菌( Cytophaga) 、多囊纤维菌属( Polyangiumcellulosum) 等属细菌均有较强分解纤维素的能力6 。擁締凤袜备訊顎轮烂蔷。酶活较强的菌种有纤维杆菌属(Culmolnoas)、生孢纤维菌属(sporocytophaga)7和梭菌属(cellulomonas)。研究最多的是纤维单胞菌（Cellulomonas）8-9和热纤梭菌（Clostridium thermocellum）。根据细菌的生理学特性，一般将纤维素降解细菌分类为：厌氧型、好氧型和好氧滑动菌。好氧细菌以可溶性胞外酶的形式分泌出3种纤维素酶对纤维素进行水解， 如纤维杆菌属(Culmolnoas)的纤维单胞菌。贓熱俣阃歲匱阊邺镓騷。第 24 页 贵 贵州大学本科毕业论文（设计） 厌氧细菌将3 种纤维素酶以特定方式联合组装成一个大复合体 纤维小体(cenulosome)10，具有多种功能的超分子结构。纤维小体附着在细菌细胞表面，所以细菌需要粘附在纤维上，使纤维小体在纤维的接触点处对纤维素进行水解，如热纤梭菌（Clostridium thermocellum）。研究表明，细菌在降解纤维素过程中产生纤维素酶的量较少，且大多不能分泌到细菌细胞外，其大多数对结晶纤维素没有活性，在降解纤维素能力方面，细菌明显低于真菌，因此，很少将细菌投入到工业生产中11。坛摶乡囂忏蒌鍥铃氈淚。1.3国内外研究概况在关于纤维素酶活性及发酵时间、温度对产酶的影响研究方面，江龙法等12从白酒糟采集的样品中初筛得到产纤维素酶酶活较高的5株菌。纤维素酶和滤纸酶活研究结果表明，这5 株菌在分泌纤维素酶活力及降解滤纸能力方面均较强，其分解纤维素的酶活最高达到11.9 U/ mL，而分解滤纸的酶活力则最高达到64 U/ mL。最适产酶条件为：发酵时间72 96 h，发酵温度25 30C。对酒糟发酵减重最高达18%。蜡變黲癟報伥铉锚鈰赘。李日强等12通过对发酵处理后的玉米秸秆和白酒糟的分析，玉米秸秆经发酵处理后粗蛋白、真蛋白和主要氨基酸总量分别比发酵处理前高了576.4 %，31.2 %和501.9 %；白酒糟经发酵处理后粗蛋白、真蛋白和主要氨基酸总量分别比发酵处理前高了65.3 %，64.0 %和50.9 %，而且都具有较高的半纤维素酶和纤维素酶活性，可对秸秆和白酒糟进行持续降解，进一步提高了消化率。買鲷鴯譖昙膚遙闫撷凄。秦广利等13在酒糟中提取酒的研究也有了新发现，结果表明，在残糟中添加纤维素酶10 U/g，于58C的水浴锅中保持5 h，可以提高还原糖的含量，残糟发酵酒精度达到4.67 %vol，出酒率达到31.39 %，出酒率比原糟提高了2.61 %，蒸馏出的产品达到蒸馏白酒各项卫生指标，达到优质酱香白酒的要求，提高了酱香型白酒酒糟的利用价值。綾镝鯛駕櫬鹕踪韦辚糴。在纤维素利用的研究中，研究的对象多偏重于厌氧高温纤维素分解菌，好氧高温纤维素分解菌涉及较少；研究内容多偏重于分类学方面以及菌株在厌氧发酵纤维素类物质方面的应用。酒糟的利用研究也有进展，归纳起来，主要是通过生物法，将酒糟发酵为动物饲料，或从中再提取酒精，再有就是发酵为有机肥这几大个方面，并从其中衍生出其他的发展方向。驅踬髏彦浃绥譎饴憂锦。2材料与方法2.1供试样地区域概况样品来源地茅台镇位于仁怀市赤水河畔，是茅台酒、文台酒的故乡。平均海拔高度880 m，年平均气温16.3C，年日照时数1400 h，无霜期311 d，年降雨量8001000 mL。茅台镇地处河谷，风速小，冬暖、夏热、少雨、少风的特殊小气候十分有利于酿造茅台酒微生物的栖息和繁殖。茅台镇被数目庞大的特殊微生物群笼罩其中，正是它们充当了酿酒业的主力军。猫虿驢绘燈鮒诛髅貺庑。采集的样品放入塑料袋中，封口，置于冰箱中4C条件下保存。2.2样品基本理化性质表2.1为茅台酒厂提供的酒糟、301车间酒糟、酒曲、酒醅、茅台有机高粱基地土壤、废旧稻草等样品的基本理化性质。因为微生物试验的主要对象是微生物，其中空格部分的理化性质是无需检测的指标，理化性质只是作为最后结果的一个比较参考。锹籁饗迳琐筆襖鸥娅薔。表2.1 样品基本理化性质样品名称含水率有机C有机质pH全K速效K全P全N碱解N%g/kgg/kgmg/kgmg/kg%g/kgmg/km茅台酒糟0.13458.22789.973.826.551.0327.53301车间酒糟0.09458.55790.544.0511.440.934.63茅台大曲0.11474.54818.115.955.490.8621.96茅台酒醅0.13450.71777.033.785.8131.07茅台有机高粱基地土壤0.0421.9937.917.91188.550.662.09147.01废旧稻草0.12478.82825.4915.20.4910.86小麦粉0.16480.58828.526.262.470.8725.76里村组土壤0.0912.3821.354.78151.850.411.27129.15里列组土壤0.0910.7618.546.63107.280.320.8768.372.3研究内容和技术路线2.3.1主要研究内容1试验在30C及50C培养条件下，从茅台酒丢糟、301车间丢糟、酒曲、酒醅、茅台有机高粱基地土壤、废旧稻草样品中分离细菌；構氽頑黉碩饨荠龈话骛。2对分离得到的菌株分别于30C和50C下，采用羧甲基纤维素钠盐培养基培养基进行初筛；3对初筛得到的菌株进行生长曲线的测绘，以及滤纸酶活力（FPA）、羧甲基纤维素钠酶活力（CMC）的测定，筛选出纤维素酶酶活性最高的菌株保存。进行一定的不同碳氮源、温度、pH条件下的初略比较，为下阶段研究做准备；輒峄陽檉簖疖網儂號泶。2.3.2技术路线图酒糟、酒曲、酒醅、废旧稻草、土壤样品的采集制备保存样品30下细菌分离培养50下细菌分离培养相关准备工作30、50下预备试验从样品中分离、纯化细菌通过透明圈大小、滤纸溃烂度初筛出具有分解纤维素的细菌菌株对筛选出的菌株进行生长曲线测定进行滤纸、羧甲基纤维素钠酶活测定鉴定命名保存筛选出的目标菌落尧侧閆繭絳闕绚勵蜆贅。2.4培养基1牛肉膏蛋白胨琼脂培养基14：牛肉膏3.0 g、蛋白胨10.0 g、琼脂16.0 20.0 g、NaCl 5.0 g、蒸馏水1000.0 mL，调pH 7.2-7.4。识饒鎂錕缢灩筧嚌俨淒。2羧甲基纤维素钠鉴定培养基（CMC-Na）14：羧甲基纤维素钠3.0 g、蛋白胨0.2 g 、K2HPO43H2O 1.3 g、MgSO47H2O 0.5 g、NaNO3 2.0 g、KCl 0.5 g、琼脂16.0 g、蒸馏水1000.0mL，调pH 7.2-7.4。凍鈹鋨劳臘锴痫婦胫籴。3LB培养基14：蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、酵母膏10.0 g、蒸馏水1000.0 ml、调pH 7.2-7.4。恥諤銪灭萦欢煬鞏鹜錦。4斜面保存培养基：牛肉膏3.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、蒸馏水1000.0 mL，调pH 7.2-7.4。鯊腎鑰诎褳鉀沩懼統庫。5 滤纸崩解培养基：蛋白胨10.0 g、酵母膏5.0 g、NaCl 5.0 g、蒸馏水1000.0 mL、调pH 7.4，每10.0 mL培养基加入10.0 mL试管中，再加入滤纸（1cm6cm）。硕癘鄴颃诌攆檸攜驤蔹。6纤维素分解细菌活化培养液：羧甲基纤维素钠10.0 g、蛋白胨5.0 g、酵母膏0.5 g、K2HPO43H2O 2.0 g、MgSO47H2O 0.2 g、NaCl 5.0 g、蒸馏水1000.0 mL、调pH 7.2-7.4。阌擻輳嬪諫迁择楨秘騖。7纤维素分解细菌产酶发酵培养液：羧甲基纤维素钠10.0g、MgSO47H2O 0.2 g、CaCl2 0.02 g、K2HPO43H2O 1.3 g、KH2PO4 1.0 g、NH4NO3 1.0 g、FeCl36H2O 0.05 g、蒸馏水1000.0 mL、调pH 7.2-7.4。氬嚕躑竄贸恳彈瀘颔澩。以上培养基于121C下，灭菌30 min后使用。2.5主要试剂和仪器2.5.1试剂1DNS 试剂甲液：溶解6. 9 g结晶酚于15. 2 mL、10 % NaOH 溶液中， 并用水稀释至69 mL， 在此溶液中加6. 9 g NaHSO3.釷鹆資贏車贖孙滅獅赘。 乙液： 称取255 g 酒石酸钾钠加到300.0 mL、1 0 % NaOH 溶液中， 再加入880.0 mL、1 % 3，5-二硝基水杨酸溶液.将甲、乙二液相混合即得黄色试剂， 贮存于综色冰箱低温保藏1周后使用。怂阐譜鯪迳導嘯畫長凉。2柠檬酸缓冲液：称取4. 2 g 柠檬酸溶于200 .0 mL 蒸馏水，配成0. 1 mol / L 柠檬酸溶液，称取5. 88 g 柠檬酸三钠溶于200.0 mL蒸馏水，配成0. 1 mol/ L柠檬酸三钠溶液。量取0. 1 mol / L 柠檬溶液89. 5 mL，0. 1 mol/ L柠檬酸三钠溶液110. 5 mL，混匀，即得pH 4. 85、0. 1 mo l/ L的柠檬酸缓冲液。量取0. 1 mo l/ L柠檬酸溶液57 mL，0. 1 mol / L 柠檬酸三钠溶液43.0 mL，再量取100.0 mL蒸馏水 混匀，配成pH4. 4、0. 05 mol / L 的柠檬酸缓冲液。谚辞調担鈧谄动禪泻類。3醋酸缓冲液(pH 5.2)：取10.52 g冰醋酸钠溶于450.0 mL蒸馏水中，用冰醋酸将该溶液的pH值调至5.2（约用l2 mL），用蒸馏水定容至500.0 mL。嘰觐詿缧铴嗫偽純铪锩。4CMC-Na溶液：称取10.0 g CMC-Na（羧甲基纤维素钠）溶于1000.0 mL醋酸缓冲液（pH 5.2），加热使之溶解，保存于冰箱中，以待使用。熒绐譏钲鏌觶鷹緇機库。5葡萄糖标准溶液的配制：将葡萄糖放在110 C烘箱中烘2 h至恒重，称取0.1080 g烘好的葡糖糖，溶解并定容至100.0 mL。鶼渍螻偉阅劍鲰腎邏蘞。6滤纸纸1 %醋酸浸泡24 h，用碘液检验确定无淀粉后。再用2 % NaHCO3洗至中性，晒干待用。纣忧蔣氳頑莶驅藥悯骛。 7革兰氏碘液：碘1.0 g、 碘化钾2.0 g、蒸馏水300.0 mL，将碘与碘化钾先行混合，加入蒸馏水少许充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300.0 mL。颖刍莖蛺饽亿顿裊赔泷。2.5.2主要仪器仪器名称型号生产厂商冰箱BCD-215KALM青岛海尔股份有限公司电热恒温培养箱DH6000BH天津市泰斯特仪器有限公司电子天平ALB-224赛多利斯科学仪器有限公司单人单面净化工作台SWCJ1FD苏州净化设备有限公司恒温振荡器ZD85A常州澳华仪器有限公司型电热鼓风干燥箱1012AB天津市泰斯特仪器有限公司型电热恒温鼓风干燥箱DHG9240上海一恒科技有限公司紫外可见分光光度计721GG上海仪电分析仪器有限公司高速台式离心机TGL16B上海安亭科学仪器厂2.6方法2.6.1分离、纯化将从贵州茅台酒厂取样到的样品捣碎后，取适量滤液接取10.0 g样品于90.0 mL无菌水中制备成1%的菌悬液，震荡培养30 min用无菌蒸馏水稀释10-2、10-3、10-4、10-5四个梯度，然后再用无菌吸管吸取100 L菌悬液滴入牛肉膏蛋白胨培养基上涂布均匀，分别在30 C及50C恒温培养箱中倒置培养2 d，不同处理均作3个重复。濫驂膽閉驟羥闈詔寢賻。观察培养皿上菌落形成情况，选取优势菌株和透明圈明显的菌株，CMC-Na培养基上用两区划线培养进行分离和纯化。观察牛肉膏蛋白胨各培养基中的菌落形态特征，拍照并作好详细记录。銚銻縵哜鳗鸿锓謎諏涼。2.6.2细菌初筛将纯化的菌株接种到纤维素钠(CMC-Na)为唯一碳源的固体培养基的上，每个培养基点2 个样，不同处理均作3个重复。挤貼綬电麥结鈺贖哓类。分别于30C、50C下倒置培养2 d，每天检测观察各菌株的菌落状况，最后通过滴加革兰氏碘液，静置10 min，倾去染液，将平板置于白色背景下，观察透明圈产生的清晰度，测量菌落及浅色透明圈半径（R，mm），并拍照记录。根据透明水解圈半径和菌落半径的比值大小初步判断菌株产纤维素酶的能力，选取比值大的菌株继续进行研究。赔荊紳谘侖驟辽輩袜錈。最后保存菌落半径与透明圈比值大于2：4的菌株于牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养基上，其活性与透明圈半径/菌落半径（R/r）在冰箱中4C条件下保存，以作下一步的研究15。塤礙籟馐决穩賽釙冊庫。2.6.3细菌生长曲线的测定从斜面保存培养基挑取菌株单菌落，置于盛有10.0 mL LB 液体培养基的试管中，振荡培养12 h，然后取100 L 菌悬液置入另外盛有10 mL LB 液体培养液的试管中振荡培养。每4 h取样一次通过分光光度法测定菌体浓度。以未接种的LB培养液做空白对照，依次测定。裊樣祕廬廂颤谚鍘羋蔺。用721G可见分光光度计，在660 nm波长处测定吸光度。然后以时间为横坐标，以OD值为纵坐标，绘制菌体生长曲线。仓嫗盤紲嘱珑詁鍬齊驁。2.6.4纤维素分解细菌的复筛 1葡萄糖标准曲线的绘制取7支10 mL试管，编号，按表2.2用移液管准确吸取标准葡萄糖（500 mg/L）溶液与蒸馏水混匀，既得各种不同浓度的标准葡萄糖液。绽萬璉轆娛閬蛏鬮绾瀧。另取试管7支，编号，用移液管准确吸取上述试管个浓度的标准葡萄糖溶液2.5 mL，对好加入各试管，然后于各试管中加入DNS试剂2.5 mL，摇匀，置于沸水中煮沸5 min。取出后置于冷水浴中冷却，在721G型分光光度计上比色。选用520 nm波长。骁顾燁鶚巯瀆蕪領鲡赙。表2.2 标准葡萄糖液的制备管号制备标准葡萄糖液的浓度（g/mL）加500ug/ml标准葡萄液（mL）加蒸馏水量（mL）000101400.89.22801.68.431202.47.641603.26.852004662404.85.2加入葡萄糖标准液和蒸馏水，在试管中分别加入2.0 mL DNS试剂，于沸水浴中加热5 min进行显色，取出后用流动水迅速冷却，各加入蒸馏水9.0 mL，摇匀，用721G可见分光光度计，在520 nm波长处测定吸光度。以1.0 mL蒸馏水代替葡萄糖标准液按同样显色操作为空白调零点。以葡萄糖质量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。根据DNS (3，5-二硝基水杨酸)比色法测定原理绘制葡萄糖标准曲线16。瑣钋濺暧惲锟缟馭篩凉。2粗酶液制备将初筛选取的菌株环取一环接种到纤维素羧甲基钠活化培养液中，30C通过静置培养、50C则在120 r /min下振荡培养24 h，不同处理做3个重复。鎦诗涇艳损楼紲鯗餳類。每24 h 取一次菌液，3500 r/min 下离心5 min，收集上清液用于测定酶活。CMC酶活力的测定：取CMC 缓冲液2.0 mL于比色皿中，加入0.5 mL 稀释10 倍的酶液，50C 恒温水浴中反应30 min，加入3.0 mL DNS 试剂，沸水浴10 min，冷却后定容至25.0 mL。在520 nm 处测OD 值，测得OD 值后查阅葡萄糖标准曲线，求出酶解所得葡萄糖含量，换算成酶活力值。栉缏歐锄棗鈕种鵑瑶锬。3滤纸崩解的测定分别用接种环取一环初筛得到的菌种，将其接种到装有10 mL滤纸培养液的10mL试管中，置于30C、50C恒温摇床，120 r /min下振荡培养，每天检查记录各菌株对滤纸的作用情况17。辔烨棟剛殓攬瑤丽阄应。观察其酶活力的分解强度，以+、标示作用情况，本方法是以肉眼观察为主，主观意识为主，结果的表示只能为试验提供参考，不能作评判的依据，但用于筛选目标菌株有很大的适用性，再配以其他方法，不是为有效的手段。具体表示：+滤纸边缘膨胀；+ + 滤纸整齐膨胀并下弯； + + + 滤纸不定形；+ + + + 全成糊状。若滤纸不到2 4 h 全部分解，则记下达到全部被分解的时间，拍照记录。峴扬斕滾澗辐滠兴渙藺。4CMC酶活力测定酶液的稀释：取大号试管13只，用移液管吸取离心后的酶1 mL，加水24 mL，摇匀。还原糖的测定：取刻度试管26只，个加入稀释酶液0.5 mL，CMC缓冲液（柠檬酸缓冲液）2.0 mL。每次测酶活时均设一个总的空白样，即在试管中不加底物和酶液，只加蒸馏水1.0 mL，用作测量吸光度时的参比。对每个样品都设一个参照样，先加0.6 mL蒸馏水，后加0.5 mL相应样品的粗酶液。詩叁撻訥烬忧毀厉鋨骜。在容积为10 mL的试管管中，加入1 mL 适当稀释的酶液于50C和30C 恒温水浴中预热5 min后，摇匀，将试管置于水浴锅中，50C恒温水浴加热，充分反应30 min。将试管从水浴锅取出后，往所有试管中加入0.5 mL DNS试剂，然后又放入水浴锅，沸水浴5 min。迅速冷却试管，并加蒸馏水定容至10.0 mL。在560 nm 波长处测吸光度并做好记录。定义每分钟催化纤维素水解生成1 g葡萄糖的酶量为一个酶活单位，即在50C下，每1 g纤维素酶曲在1 min内水解CMC，生成1 ug葡萄糖的酶活性称作纤维素酶活力单位，记作U。则鯤愜韋瘓賈晖园栋泷。葡萄糖量=(mg/mL)30 min1/10式中 葡萄糖量：从标准曲线上查的（mg）；1/10： 稀释倍数；30： 糖化时间（min）。3结果与分析3.1分离、纯化结果利用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，分10-2、10-3、10-4、10-5四个不同稀释梯度，2至3组平行，从茅台酒丢糟、301车间丢糟、酒曲、酒醅、茅台有机高粱基地土壤、废旧稻草样品中初步分离到近千个菌株，在观察菌落生长状况、菌落形态特征的同时，如表3.1整理统计了不同稀释梯度下的菌落生长情况。细菌的纯化一般采用二区划线法，通过这种方式，进一步分离所筛选的菌种。胀鏝彈奥秘孫戶孪钇賻。表3.1 菌落计数统计菌株编号稀释10-2（计数） 稀释10-3（计数） 稀释 10-4（计数） 稀释10-5（计数）茅台酒糟B1200-32824-424-8-301车间酒糟B2400以上105-14234-547-13茅台大曲B3700以上74-10832-384-14茅台酒醅B4124-16517-224-11-茅台有机高粱基地土壤B5500以上201-27434-568-17废旧稻草B6连片连片289-32132-57根据菌落数30-300为最佳，从表3.1可以看出，B1的最佳稀释度为10-2、10-3，B2的最佳稀释度为10-3、10-4，B3的最佳稀释度为10-3、10-4，B4的最佳稀释度为10-2、10-3，B5的最佳稀释度为10-3、10-4，B6的最佳稀释度为10-5。鳃躋峽祷紉诵帮废掃減。3.2菌株初筛结果3.2.1初筛情况统计通过对近千个菌株的初筛，用羧甲基纤维素钠鉴定培养基进行培养，滴加革兰氏碘液有透明圈的244株。其中，菌落半径最大的为2.0 cm，BL5-95透明圈与菌落半径比值最大的，达到15。透明圈与菌落半径比值超过10的有12株，透明圈与菌落半径比值超过5的有103株。稟虛嬪赈维哜妝扩踴粜。50C培养条件下的，选取透明圈半径超过2 cm，透明圈与菌落半径比值大于3的7株菌；30C培养条件下的，选取透明圈半径超过1.5 cm，透明圈与菌落半径比值大于5的6株菌。陽簍埡鲑罷規呜旧岿錟。共选取13株菌进行纤维素酶活力等测定，图3.1是初筛时几株透明圈较为明显细菌。图3.1 几株细菌CMC培养基透明圈情况将透明圈与菌落半径比值较突出的13株菌，根据初筛过程顺序分别编号为BH1-9、BH3-14、BH3-31、BH5-20、BH5-26、BH5-36、BH6-34、BL3-45、BL4-65、BL5-58-1、BL5-95、BL5-99、BL5-106。 其中BL5-58-1是在纯化BL5-58时被发现的，后来发现透明圈半径比: BL5-58更大，就一直以此命名。表3.2是个菌株透明圈与菌落半径比值及其他数据统计情况。沩氣嘮戇苌鑿鑿槠谔應。表3.2 初筛中13株细菌透明圈与菌落半径比值样品编号菌落半径（cm）透明圈半径（cm）透明圈与菌落半径比值培养温度培养时间BH1-90.60 2.00 3.33 50C3dBH3-140.55 2.20 4.00 50C3dBH3-310.50 2.10 4.20 50C3dBH5-201.00 2.30 2.30 50C3dBH5-260.50 2.00 4.00 50C3dBH5-360.60 2.10 3.50 50C3dBH6-340.70 2.40 3.43 50C3dBL3-450.20 1.50 7.50 30C3dBL4-650.25 1.50 6.00 30C3dBL5-58-10.30 1.60 5.33 30C3dBL5-950.10 1.50 15.00 30C3dBL5-990.15 1.50 10.00 30C3dBL5-1060.30 1.70 5.67 30C3d3.2.2初筛的保存初筛的保存如图3.2，以牛肉膏蛋白胨作为保存培养基。保存在4C条件下，待到用时再取出，但要注意保存时间不宜过长，通常为7 d。做长期保存则是将菌种接种到斜边保存基上，4C低温保存。钡嵐縣緱虜荣产涛團蔺。图3.2 短期平板保存培养基3.3细菌生长曲线测定结果测定生长曲线所用到的波段没有固定的要求，经过具体的测定发现，在波长较小的情况下（440nm）所测定的值会大于较高的值（660nm），这要求根据菌悬液的浊度调整相对较佳的值，当菌悬液浊度教小时用低波段测定，反之用高波段测定，最好将最后测定的最大值控制在1.000之内。懨俠劑鈍触乐鹇烬觶騮。在测定细菌生长曲线时，通过观察发现。30C静置培养下的菌悬液，其沉淀量少、液面无菌苔或菌苔量微小、液体中颗粒物分布均匀、液体昏暗浑浊、细菌生长规律；而50C、120 r /min振荡培养下的菌悬液，沉淀量大、液体中分布有絮状物、液面有菌苔生长、液体中颗粒物分布不均匀、液体颜色呈清透亮、细菌生长情况很难判明。 通过肉眼的观察判断，50C、120 r /min振荡培养下的菌种，其吸光度因颗粒分布不均，必然无法准确测定。最后通过721G可见分光光度计的测定证实以上推断。謾饱兗争詣繚鮐癞别瀘。表3.3中记录的数值，50C、120 r /min振荡培养下的菌悬液吸光度只能略作结果的参考。表3.3 LB菌悬液OD测定菌株编号0（h）OD660nm4（h）OD660nm8（h）OD660nm12（h）OD660nm16（h）OD660nm20（h）OD660nm24（h）OD660nm28（h）OD660nm32（h）OD660nm36（h）OD660nm40（h）OD660nmBH1-90.000 0.113 0.146 0.139 0.084 0.710 0.660 0.053 0.228 0.195 0.103 BH3-140.000 0.218 0.223 0.243 0.232 0.253 0.267 0.310 0.338 0.102 0.100 BH3-310.000 0.088 0.092 0.123 0.142 0.146 0.213 0.189 0.317 0.083 0.031 BH5-200.000 0.062 0.074 0.043 0.046 0.054 0.065 0.065 0.075 0.031 0.036 BH5-260.000 0.012 0.022 0.020 0.043 0.039 0.021 0.032 0.023 0.035 0.054 BH5-360.000 0.033 0.032 0.024 0.032 0.042 0.310 0.026 0.023 0.014 0.048 BH6-340.000 0.059 0.096 0.137 0.119 0.134 0.139 0.216 0.207 0.153 0.190 BL3-450.000 0.010 0.023 0.037 0.035 0.042 0.087 0.114 0.146 0.071 0.142 BL4-650.000 0.041 0.023 0.038 0.034 0.045 0.063 0.087 0.133 0.142 0.081 BL5-58-10.000 0.008 0.002 0.005 0.010 0.013 0.008 0.006 0.009 0.001 0.014 BL5-950.000 0.007 0.003 0.005 0.011 0.020 0.013 0.016 0.014 0.004 0.010 BL5-990.000 0.514 0.544 0.605 0.672 0.792 0.817 0.835 0.649 0.756 0.784 BL5-1060.000 0.498 0.632 0.645 0.669 0.951 0.984 1.049 0.746 0.221 0.316 注：生长曲线的绘制时以细菌悬液的吸光度（O.D）为纵坐标，培养时间为横坐标绘出。因为测定的菌株比较多，每一个菌株对应一个生长曲线，且50C、120 r /min振荡培养下的菌悬液吸光度偏离真实值，为减少累赘，在这里只列表，不绘制曲线。呙铉們欤谦鸪饺竞荡赚。3.4纤维素分解细菌的复筛结果 对具有纤维素分解功能的菌株分别进行摇瓶培养，测定酶活力，其中菌株BL5-106产纤维素酶活力最高，其酶活为93.87 U/mL。莹谐龌蕲賞组靄绉嚴减。将分离到的13 株菌分别接种一环到装有50.0 mL 液体培养基的三角瓶中， 30 C振荡，转速为120 r/ min培养6 d， 将培养液于4C、3500 r / min 离心15 min， 取上清液作为粗酶液，测其对滤纸分解度，CMC 酶活力( CMCase )。麸肃鹏镟轿騍镣缚縟糶。.酶活力测定结果以520 nm 处测出的吸光度OD 值为纵坐标，以葡萄糖含量(mg)为横坐标绘制标准曲线。納畴鳗吶鄖禎銣腻鰲锬。图3.3为CMC酶活力测定显色后所拍摄，图中颜色最深的是编号为BL5-106的菌株，BL5-106的OD值为0.783。風撵鲔貓铁频钙蓟纠庙。图3.3 BL5-106DNS显色图通过查看表3.4即可得出BL5-106的葡萄糖含量为140.8 g，再根据相关公式计算得BL5-106的酶活为93.87U/mL单位。灭嗳骇諗鋅猎輛觏馊藹。表3.4 葡萄糖吸光度(OD520nm)管号2.5mL标准葡萄糖液中所含葡萄糖量（g） OD值11000.2122000.28933000.57944000.97355001.11366001.404图3.5是葡萄糖标准曲线的DNS显色反应图片，与图3.4可作为一个直观的对比方式，通过对比不难发现CMC酶活大体数值。铹鸝饷飾镡閌赀诨癱骝。图3.4 葡萄糖DNS显色反应3.5滤纸条崩解实验表3.5 滤纸崩解试验情况菌株编号培养液沉淀情况颗粒物分布状况菌落颜色培养液液面有无菌落层滤纸崩解状况培养液浑浊度BH1-9无-稀薄-极低BH3-14絮状均匀-少量+低BH3-31无-少量-极低BH5-20微量下层较多-大量-极低BH5-26无均匀-少量-极低BH5-36无-少量-极低BH6-34少量-稀薄-极低BL3-45中量上层较多黄色无+低BL4-65少量上层较多灰色少量-极低BL5-58-1大量上层较多黄红色无+中度BL5-95中量均匀红白交替无+中度BL5-99中量均匀-无+中度BL5-106微量均匀-无+高度上表3.5是单菌株纯培养崩解滤纸条试验结果，除了2株细菌BL5-106一具有一定降解滤纸条的能力外，其他单菌株在连续8d的恒温振荡培养过程中不能使滤纸条崩解，这也可能是培养时间不够长，或是滤纸成分构成的原因。攙閿频嵘陣澇諗谴隴泸。结合生长曲线测定的OD可以推断，液体浑浊度高的相对的OD就大，对滤纸的分解能力相应也会较强。浑浊度高的菌悬液，其细菌的生长繁殖速度快，繁殖能力较强。趕輾雏纨颗锊讨跃满賺。滤纸这种非天然纤维素底物化学组成均一、试验结果重复性好，是普遍选用的筛菌底物，但用其进行的纤维素酶活性检测不能真实地反映菌株对酒糟这类复杂组分的纤维素的降解能力。所以，滤纸崩解试验可以用作菌株的筛选之中，但不能作为判断酶活力大小的依据。夹覡闾辁駁档驀迁锬減。下图3.5是一组以LB去除碳源为培养液，添加滤纸作为唯一碳源，接种一环连续培养5d后，培养液及滤纸的出现的一些直观情况，以此可作为挑选菌株的参考依据。视絀镘鸸鲚鐘脑钧欖粝。图3.5 接种细菌下的培养液与滤纸通过观察发现，具有较强的纤维素酶活性的13株细菌，原先能在CMC-Na培养基上产生大而清亮的透明圈，但在滤纸条崩解试验中却没有明显的效果，只是显得浑浊。偽澀锟攢鴛擋緬铹鈞錠。4结果与讨论 从茅台酒厂提供的样品中分离到近千株菌，经过革兰氏碘液染色，共得到能产生透明圈的菌株244株，其中，有4株菌菌落半径达到2.0 cm，BL5-95透明圈与菌落半径比值最大的达到15，透明圈与菌落半径比值超过10的有12株，透明圈与菌落半径比值超过5的有103株。在这103株菌中，最具研究价值的有近20株，本试验着重选取了其中13株，分别是50 C条件筛选的7株和30 C条件的6株，对其进行各项指标的测定，主要偏重于其纤维素酶活的测定。緦徑铫膾龋轿级镗挢廟。通过滤纸的崩解试验找到重点目标，最后，CMC酶活和FPA酶活研究结果表明，这13株菌在分泌纤维素酶活力及降解滤纸能力方面，BL5-106，不管是从其一开始的生长速度（生长曲线），对环境的适应能力（滤纸崩解），还是对CMC的分解能力都显得尤为凸出。騅憑钶銘侥张礫阵轸蔼。其中分解纤维素的酶活力最高的BL5-106达到93.87 U/ mL。通过各细菌生长曲线可以看出，在条件适宜的情况下，前期（1d）细菌群落生长便已趋于稳定，随着时间的推移，有小幅变化，在培养的中期（4d），便有部分菌株进入了衰落期，菌悬液的OD出现下滑趋势，但总体趋势并没有