右旋雷贝拉唑钠微生物限度方法验证报告.docx

江苏奥赛康药业股份有限公司右旋雷贝拉唑钠微生物限度检查法验证报告1、 供试品批 号： 规 格： 原料药 来 源： 江苏奥赛康药业 验证起止时间： 2、培养基胰酪胨大豆琼脂培养基 批号： 140304 沙式葡萄糖琼脂培养基 批号： 131230 胰酪胨大豆肉汤培养基 批号： 130426 均为符合药典规定的干燥培养基。由中国药品生物制品检定所提供。上述培养基的灵敏度检查和无菌性检查均符合药典规定。3、仪器电子天平： KF3102 江苏凯丰集团有限公司 细菌培养箱： GNP-9160 上海精密实验设备有限公司 真菌培养箱： BK6160 美国赛默飞世尔科技公司 无菌隔离器： HTY-SZ1806B 杭州泰林生物技术设备有限公司 4、试剂与稀释液PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，青岛蓝雁绿检生物技术有限公司5、菌种金黄色葡萄球菌 CMCC(B)26003 第 3 代大肠埃希菌 CMCC(B)44102 第 3 代铜绿假单胞菌 CMCC(B)10104 第 5 代枯草芽孢杆菌 CMCC(B)63501 第 5 代白色念珠菌 CMCC(F)98001 第 5 代黑曲霉 CMCC(F)98003 第 5 代上述菌种均由江苏省药品检验所提供。6、验证依据中国药典2015年版四部（通则1105-1106 ）非无菌产品微生物限度检查7、实验操作7.1 菌液制备7.1.1分别接种金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至10ml的胰酪胨大豆肉汤培养基中，置3035培养1824小时，分别取上述培养物1ml加9ml pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，10倍递增稀释制成适宜浓度的菌悬液。7.1.2接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml沙氏葡萄糖液体培养基中，置2025培养2448小时，取上述培养物1ml加9ml pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，10倍递增稀释制成适宜浓度的的菌悬液。7.1.3接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，置2025培养57天，使大量的孢子形成。加入35ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱并过滤孢子悬液至无菌试管内，取1ml原液加9ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。7.2 供试液制备称取供试品10g，加pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，充分振摇混匀，制得1:10的供试液，取50ml均分成五份（每份10ml）。7.3 验证试验细菌、霉菌及酵母菌计数验证7.3.1 试验组需氧菌：取上述均分好的三份供试液，分别加入0.1ml金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌与枯草芽孢杆菌的适宜浓度菌液，混匀，使每1ml均分供试液含菌量不大于100cfu；用适量pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液润湿滤膜后，分别取含菌供试液1ml，通过直径约为50mm，孔径不大于0.45um的薄膜过滤。每膜用500ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液进行冲洗，冲洗后取出滤膜。菌面朝上贴于胰酪胨大豆琼脂培养基上，于3035培养不超过3天。霉菌和酵母菌：另取上述剩余的两份供试液，分别加入0.1ml白色念珠菌、黑曲霉的适宜浓度菌液，混匀，使每1ml供试液含菌量不大于100cfu，用适量pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液润湿滤膜后，分别取含菌供试液1ml，通过直径约为50mm，孔径不大于0.45um的薄膜过滤。每膜用500ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液进行冲洗，冲洗后取出滤膜。菌面朝上贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基上，于2025培养不超过5天。7.3.2 供试品对照组用适量pH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液润湿滤膜后，取供试液1ml，通过直径约为50mm，孔径不大于0.45um的薄膜过滤。用每膜500ml pH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液分3次冲洗，冲洗后取出滤膜。将滤膜分别贴于胰酪胨大豆琼脂培养基上，于3035培养不超过3天，和沙氏葡萄糖琼脂培养基上于2025培养不超过5天。7.3.3 菌液组 取50ml pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，均分成五份（每份10ml），分别接种0.1ml金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉的适宜浓度菌液，混匀，使每1ml缓冲液含菌量不大于100cfu；分别取含菌缓冲液1ml置无菌平皿，向接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的平皿内注入1520ml温度不超过45的胰酪胨大豆琼脂培养基，混匀，凝固，于3035培养不超过3天，观察结果。向接种白色念珠菌与黑曲霉的平皿内注入1520ml温度不超过45的沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，于2025培养不超过5天。7.3.4 阴性对照组 分别吸取1.0ml 稀释剂置2个无菌平皿，并向内注入1520ml温度不超过45的胰酪胨大豆琼脂培养基，混匀，凝固，于3035培养不超过3天；分别吸取1.0ml 稀释剂置2个无菌平皿，并向内注入1520ml温度不超过45的沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，于2025培养不超过5天。 回收值 回收值=（试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数）/菌液组平均菌落数 当回收值在0.52范围内时，证明该方法能消除样品对微生物生长的抑制作用7.4 计数结果各试验菌比值计数结果右旋雷贝拉唑钠微生物限度计数结果菌种名称试验次数实验组菌液组供试品对照组比值铜绿假单胞菌182899892000.90272768881000.85372718979000.85金黄色葡萄球菌170697778000.90268727281000.92371748481000.88枯草芽孢杆菌169687571000.94267677686000.83366697979000.85白色念珠菌160627371000.85270648175000.86378767988000.92黑曲霉菌157536661000.87254525963000.87358626769000.88回收值=（试验组平均菌落数供试品对照组平均菌落数）/菌液组平均菌落数7.5 结果分析用该方法进行铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉菌的测定，其试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值均在0 .52 范围内，说明该计数方法是有效的。7.6 控制菌验证7.6.1 试验组 取1:10供试液适量，用适量pH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液润湿滤膜后，取1:10供试液10ml，通过直径约为50mm，孔径不大于0.45um的薄膜过滤。每膜用300ml pH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液进行冲洗，在最后一次冲洗液中接入不大于100cfu大肠埃希菌菌悬液1ml，混匀，冲洗后取出滤膜，接入100ml 的胰酪胨大豆肉汤培养基中3035培养18小时。取上述培养物l ml接种至100ml麦康凯液体培养基中，4244培养24小时。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，3035培养18小时。7.6.2 阳性对照组 取不大于100cfu的大肠埃希菌菌悬液1ml置于100ml 的胰酪胨大豆肉汤培养基中，混匀， 3035培养18小时。取上述培养物l ml接种至100ml麦康凯液体培养基中，4244培养24小时。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，3035培养18小时。7.6.3 阴性对照组 取10ml 稀释剂加入到100ml 的胰酪胨大豆肉汤培养基中，混匀， 3035培养18小时。取上述培养物l ml接种至100ml麦康凯液体培养基中，4244培养2448小时。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，3035培养18小时。7.6.4 结果判断上述实验组和阳性对照组若检出大肠埃希菌，阴性对照组无菌生长，则按此供试液制备法和控制菌检查方法进行供试品检查。右旋雷贝拉唑钠控制菌检查结果组别结果步骤试验组阳性对照组阴性对照组123123123麦康凯琼脂培养基平板+-结果显示，本品的控制菌检查方法验证结果（ ）符合要求 / （ ）不符合要求8、结论 右旋雷贝拉唑钠按中国药典2015年版四部（通则1105-1106）非无菌产品微生物限