釉基质蛋白对双重酸蚀后纯钛表面磷灰石生成的影响.doc

www.CRTER.org朱习华，等. 釉基质蛋白对双重酸蚀后纯钛表面磷灰石生成的影响釉基质蛋白对双重酸蚀后纯钛表面磷灰石生成的影响朱习华1，吴倩雯2，黄 慧3(1武汉科技大学附属天佑医院口腔科，湖北省武汉市 430064；2上海市东方医院口腔科，上海市 200011；3上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔修复科，上海市 200011)引用本文：朱习华，吴倩雯，黄慧. 釉基质蛋白对双重酸蚀后纯钛表面磷灰石生成的影响J.中国组织工程研究，2017，21(2):249-253.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.02.016 ORCID: 0000-0003-0710-1157(黄慧)文章快速阅读：釉基质蛋白促进双重酸蚀处理后的纯钛表面：生成磷灰石涂层更快双重酸蚀钛片钙磷过饱和液釉基质蛋白猪未萌恒牙胚浸泡7 d不同浓度釉基质蛋白提取性能检测文题释义：釉基质蛋白：存在于发育期的釉基质中，其作用与釉基质的形成和矿化有关。釉基质中的蛋白主要包括两种：即釉原蛋白和非釉原蛋白，其中釉原蛋白占90%，由一组蛋白及多肽组成。发育中的釉质基质的主要成分是釉原蛋白，除了在釉质的成熟和矿化中发挥作用外，还能诱导无细胞性牙骨质的形成。磷灰石：釉基质蛋白分子与羟基磷灰石具有亲和性，釉基质蛋白对羟基磷灰石晶体有选择性吸附作用，实验通过模拟生物矿化的过程，将纯钛试件浸入到加有釉基质蛋白的钙磷过饱和液中，以考察釉基质蛋白是否影响纯钛表面矿化涂层的生成。摘要背景：为提高钛种植体植入后的生物活性，常采用各种表面改性技术。目的：研究釉基质蛋白对双重热酸蚀纯钛表面仿生矿化沉积磷灰石层的影响。方法：提取猪未萌恒牙胚表面的釉基质蛋白并进行验证，纯钛片经抛光清洗后进行双重热酸蚀处理，然后放入含不同浓度釉基质蛋白的饱和矿化液中矿化7 d，对照组为不含釉基质蛋白的钙磷过饱和液。扫描电镜观察试件表面形貌，X射线能谱及X射线衍射分析涂层的元素成分及晶相结构。结果与结论：经双重酸蚀处理后的钛片表面形成规则凹坑状的粗糙表面，经过7 d的矿化实验后，不添加釉基质蛋白的对照组试件上未见明显矿化涂层的形成。加入釉基质蛋白的实验组试件表面可形成矿化涂层，且随釉基质蛋白浓度的增加，矿化涂层的量及形态发生改变。能谱分析结果显示：矿化涂层中的主要元素为钙、磷、碳和氧，钙磷摩尔比在1.32-1.41之间。X射线衍射结果显示纯钛试件表面的沉积物为碳羟基磷灰石。提示釉基质蛋白可以促进双重酸蚀处理后的纯钛表面更快地生成磷灰石涂层。釉基质蛋白对纯钛表面磷灰石涂层的影响呈浓度相关性。关键词：生物材料；口腔生物材料；釉基质蛋白；纯钛；磷灰石；牙种植体；模拟体液；双重酸蚀；扫描电子显微镜；X射线衍射；国家自然科学基金主题词：钛；牙釉质；组织工程基金资助：国家自然科学基金项目(30670555)Effect of enamel matrix proteins on the growth of apatite coating on dual thermo-etching modified titanium Zhu Xi-hua1, Wu Qian-wen2, Huang Hui3 (1Department of Stomatology, Tianyou Hospital Affiliated to Wuhan University of Science & Technology, Wuhan 430064, Hubei Province, China; 2Department of Stomatology, Dongfang Hospital of Shanghai, Shanghai 200011, China; 3Department of Prosthodontics, Shanghai Ninth Peoples Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200011, China)朱习华，女，1966年生，湖北省人，汉族，1990年武汉大学毕业，副主任医师，主要从事口腔修复研究。并列第一作者：吴倩雯，硕士，主治医师，上海市东方医院口腔科，上海市200011通讯作者：黄慧，博士，副主任医师，上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔修复科，上海市200011 中图分类号:R318文献标识码A文章编号:2095-4344(2017)02-00249-05稿件接受：2016-10-28Zhu Xi-hua, Associate chief physician, Department of Stomatology, Tianyou Hospital Affiliated to Wuhan University of Science & Technology, Wuhan 430064, Hubei Province, ChinaWu Qian-wen, Master, Attending physician, Department of Stomatology, Dongfang Hospital of Shanghai, Shanghai 200011, ChinaZhu Xi-hua and Wu Qian-wen contributed equally to this work.Corresponding author: Huang Hui, M.D., Associate chief physician, Department of Prosthodontics, Shanghai Ninth Peoples Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200011, ChinaAbstractBACKGROUND: Various surface modification techniques have been used to improve the bioactivity of titanium 3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 implant in vivo.OBJECTIVE: To investigate the effects of enamel matrix proteins (EMPs) on the growth of apatite coatings on dual thermo-etching treated pure titanium. METHODS: EMPs were extracted from porcine tooth germs and then were identified. Dual thermo-etching was applied to treat titanium samples following polished, and then immersed in a blank simulated body fluid supersaturated calcification solution (control group) or supersaturated calcification solution containing different concentrations of EMPs for 7 days. The morphology of samples was observed using scanning electron microscope, and element components and crystal structures of the apatite coatings were analyzed by energy dispersive spectrometer and X-ray diffraction.RESULTS AND METHODS: After double-etching, a pit-like rough surface was observed on the titanium plate. After 7-day mineralization, in the control group, no overt calcium-phosphate deposits were found on the titanium surface; however, in the experimental groups, there were calcium-phosphate deposits, whose quantity and morphology changed with increasing concentrations. Energy dispersive spectrometer showed that the main element components of the mineralized coating included calcium, phosphorus, oxygen and carbon, and the calcium-phosphate ratio ranged from 1.32 to 1.41. The apatite coatings were proved to be carbonate hydroxyapatite by X-ray diffraction. To conclude, EMPs promote apatited deposition on pure titanium surfaces in a concentration-dependent manner.Subject headings: Titanium; Dental Enamel; Tissue EngineeringFunding: the National Natural Science Foundation of China, No. 30670555Cite this article: Zhu XH, Wu QW, Huang H. Effect of enamel matrix proteins on the growth of apatite coating on dual thermo-etching modified titanium. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2017;21(2):249-253.251ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction钛及钛合金因其良好的生物活性、优良的机械性能及耐腐蚀性被广泛用作种植材料1，但由于其属生物惰性材料，为提高其植入后的生物相容性和生物活性，常采用各种表面改性技术，包括物理化学方法、形态学方法以及生物化学方法等。种植材料植入体内后，立即与组织液和血液中的各种蛋白质及其他基质成分接触，种植体表面最初的性状决定了蛋白质吸附的种类和数量，从而影响宿主细胞和材料表面的结合状态2-3。仿生涂层(biomimetic coating)首先使基材表面带上功能性基团，即表面功能化，然后浸入含有机高分子及无机矿物的过饱和溶液中，无机物在功能化表面上异相成核并受控生长，形成不同于本体溶液的涂层。采用生物矿化的原理仿生合成的涂层具有如下优点：可对晶体形态及结晶方向等微观结构进行控制，生成的磷灰石晶体是纳米级的；可直接制备涂层，不用后续热处理即可获得致密的晶态膜。在常温常压形成，为其沉积蛋白质等生物大分子提供了可能。此法现阶段还存在许多不足，要真正制备出与骨组织相似的仿生涂层还需要深入的研究4-5。仿生表面改性技术模仿了生理状态下磷灰石的矿化机制。在涂层生长过程中加入各种有机大分子，通过有机大分子和无机物离子在界面处的相互作用，从分子水平上控制类骨磷灰石晶体的生长。所形成的修饰层不仅可提高植入体的耐蚀性，抑制合金中金属离子的溶出，而且其成分与人体骨无机质更为接近。实验将形态学和生物化学方法相结合，模拟体内磷灰石生成条件，将具有多种生物活性的釉基质蛋白引入到经双重热酸蚀处理的纯钛表面，并在饱和矿化液中诱导生成磷灰石涂层。并探讨不同浓度釉基质蛋白对纯钛表面仿生矿化形成磷灰石涂层的影响。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计 随机对照实验。1.2 时间及地点 实验于2011年2月至2012年3月在上海第九人民医院口腔医学重点实验室完成仿生矿化实验，在上海硅酸盐研究所完成扫描电镜和X射线衍射检测。1.3 材料 上海五丰食品有限公司提供的新鲜猪颌骨20块，用外科手术方法取出发育中的未萌恒牙胚，刮取牙胚表面奶酪样牙釉基质。商业纯钛片购自AlfaAesar公司，规格2.0 mm，纯度99.2%。主要试剂及仪器：氢氟酸购自国药集团化学试剂有限公司；浓硫酸购自上海凌峰化学试剂有限公司；浓盐酸购自宜兴市第二化学试剂厂；400号、600号和800号金相砂纸购自上海砂轮厂；X射线衍射仪购自日本Rigaku TF公司；X射线能谱仪购自美国EDAS公司；JSM-6360LV型扫描电镜购自日本JEOL公司。1.4 方法1.4.1 釉基质蛋白的提取和鉴定 按照束蓉等6的方法，从猪的颌骨中取其未萌恒牙的牙胚，刮取其表面未完全钙化的白色蜡状物，以各牙尖之间为多。分装入Eppendorf管中，每管中加入1 mL浓度为0.5 mol/L的乙酸，摇匀， 4 冰箱内过夜。经24 h后取出昨日置于冰箱内的蛋白，小心吸取上清液和中间的白色凝乳状层，加入适量20%三氯乙酸，混匀，4 离心15 min(1 200 r/min)。弃上清液于沉淀物中加入丙酮少许，混匀，按相同条件离心5min后弃上清液，待丙酮充分挥发后再加入去离子水使沉淀物溶解或漂浮其中，-40 冷冻。取出冰冻的蛋白质，用parafilm膜覆盖Eppendorf管的开口处，用针头刺出小孔，要尽量大而密，-56 真空干燥24 h后得到乳白色粉末状的蛋白，将其置于-40 的冰箱内保存。随后进行蛋白质聚丙烯酰胺SDS-PAGE 凝胶电泳分析，证实所提取的物质为釉原蛋白占优势的釉基质蛋白。称取釉基质蛋白冻干粉溶于 5 mmol/L醋酸溶液中配制成质量浓度为4 g/L的存储液过滤分装，-80 冻存备用7-8。1.4.2 纯钛试件的制备 将钛片切成规格为10 mm 10 mm2 mm的试件5件，依次用400号、600号和800号金相砂纸磨光，分别用去离子水、丙酮、体积根数70%乙醇超声清洗20 min，去离子水超声清洗10 min后，50 烘干待用9。1.4.3 纯钛试件表面的预处理 参考文献10-11中纯钛表面的酸蚀处理方法，将纯钛试件用体积分数15%的氢氟酸常温下处理1 min后，用去离子水冲洗，50 烘干。用浓硫酸(浓度95%-98%)和浓盐酸(浓度36%-38%)的混合液(体积比61)，70 水浴5 min后，去离子水冲洗， 50 烘干待用。1.4.4 钙磷过饱和液(supersaturated calcification solution，SCS)的配置 2种钙磷过饱和液中的离子浓度见表1。SCS1液的配制：按照表1中的离子浓度，分别称取CaCl2：0.034 g，K2HPO43H2O：0.042 g, NaCl：0.80 g, Tris：0.605 g, 溶于80 mL的去离子水中充分溶解，用HCl调节pH值至7.4，定容至100 mL。SCS2液的配制：按照表1中的离子浓度，分别称取KNO3：1.44 g，K2HPO43H2O： 0.021g，Ca(NO3)24H2O： 0.035 g，溶于80 mL去离子水中充分溶解，用HCl调节pH值至7.4，定容至100 mL。表1 钙磷过饱和液中的离子浓度 (g/L)Table 1 Ion concentrations in two kinds of supersaturated calcification solutions 离子钙磷过饱和液1钙磷过饱和液2Na+136.8-K+3.71144.6Ca2+3.101.5Cl185.5-HPO42-1.86 0.9NO3-145.8Tris50-1.4.5 试件分组干预 将预处理后的试件随机分成5组：对照组及0.05，0.10，0.15，0.20 g/L釉基质蛋白组。将各组钛片浸泡在钙磷过饱和液1液中，37 水浴4 h后取出，去离子水漂洗待用，加入含0，0.05，0.10，0.15，0.20 g/L釉基质蛋白的钙磷过饱和液2液37 水浴7 d，隔天换液，去离子水漂洗，50 烘干待用。1.4.6 矿化实验 用JSM-6360LV型扫描电镜观察纯钛表面生成的矿化涂层的微观形貌表；采用X射线衍射分析试件表面矿化层的晶相组成。X射线能谱仪分析检测矿化涂层的元素组成。1.5 主要观察指标 扫描电镜观察试件表面的微观形貌；能谱仪和X射线衍射检测并分析试件表面沉积物的元素组成和晶相组成。2 结果 Results 2.1 试件表面的微观形貌 电镜下可见，经过双重酸蚀后钛片表面变得粗糙，形成规则的凹坑状，直径为8.0- 9.0 m。经过7 d的矿化实验，在没有釉基质蛋白存在的情况下，钛试件表面几乎观察不到矿化涂层的形成。当釉基质蛋白质量浓度为0.05 g/L时，试件表面有极少量的矿化物晶体形成；当质量浓度为0.10 g/L时，试件表面有少量的矿化物晶体形成，但分布不均匀；当质量浓度为0.15和 0.20 g/L时，试件表面布满矿化物晶体，且分布均匀(图1)。高倍电镜下可见，形成的磷灰石晶体呈片状，当釉基质蛋白质量浓度为0.05 g/L时，晶体长度约为9.0 m；质量浓度为0.10 g/L时，晶体长度约为10.2 m；质量浓度为0.15和0.20 g/L时，晶体长度约为4.7 m。随着釉基质蛋白质量浓度的增加，钛表面生成涂层的片状结构更致密、规整，形态变小，且聚集成簇(图1)。2.2 试件表面沉积物的元素组成 能谱分析的结果显示在纯钛试件表面形成矿化涂层的主要元素有Ca、P、O和C，各组试件表面的钙磷摩尔比见表2。表2 不同浓度釉基质蛋白浸泡1周后纯钛试件表面元素的钙磷摩尔比Table 2 Calcium-phosphorus ratio of the apatite coatings under different concentrations of enamel matrix proteins for 1 week 试件釉基质蛋白质量浓度(g/L)0.050.100.15 0.20 试件1 1.401.371.491.34试件2 1.391.271.341.32试件3 1.381.501.401.32平均值1.390.011.380.121.410.081.330.012.3 试件表面沉积物的晶相组成 X射线衍射检测结果显示，0.15，0.20 g/L釉基质蛋白组试件表面形成的矿化涂层的晶体成分中，除了钛峰外，矿化物涂层的主要衍射峰与羟基磷灰石的特征峰基本一致(图2)。3 讨论 Discussion3.1 纯钛表面粗化处理的方法 种植体的表面形貌对于其周围的骨融合及上皮封闭都是非常重要的。现阶段种植体大多设计成粗糙的、螺纹状的或多孔的表面， 这种设计不但扩大了细胞的接触面积， 而且增加了细胞长入的机械锁结作用12。Ong等13研究发现无机元素(Ca、P、Na、Cl等) 的沉积数量也与表面粗糙度直接相关。表面粗化的钛种植体与光滑表面的种植体相比，矿物质的沉积率更快、骨结合的面积更大、骨整合的速度更快14。种植体允许骨组织以不规则生物化学键或骨整合的方式向次级更小的界面生长。经过双重酸蚀后的钛试件表面形成了规则的微孔对照组 0.05 g/L釉基质蛋白组 0.10 g/L釉基质蛋白组 0.15 g/L釉基质蛋白组 0.20 g/L釉基质蛋白组1001 000 图1 纯钛表面仿生矿化涂层形貌Figure 1 Micrographs of the mineralized titanium surface图注：随着釉基质蛋白浓度的增加，钛表面生成涂层的片状结构更致密、规整，形态变小，且聚集成簇。X射线衍射强度6 0005 0004 0003 0002 0001 0000衍射方向2()10 20 30 40 50 60 70 80图2 试件表面成分的X射线衍射检测结果Figure 2 X-ray diffraction micrographs of the surface composition of samples图注：图中A为经钙磷过饱和液和0.15 g/L釉基质蛋白处理后的试件；B为经钙磷过饱和液和0.2 g/L釉基质蛋白处理后的试件。为钛峰，为羟基磷灰石峰。结构，表面无杂质，为磷灰石的异质成核提供了优先位置，能诱导磷灰石从矿化液中快速沉积下来10。目前，国际上流行的种植体表面大部分是中等粗糙度(平均粗糙度为0.1-0.2 m)，这种表面与骨组织反应强烈。有学者通过实验证实，用HF和HNO3混合液酸蚀喷砂后的钛试件表面形成大量纳米级微孔，但同时发现含有大量的喷砂颗粒，说明酸蚀技术不能完全去除嵌在钛片表面的喷砂颗粒，可能会影响到种植体与骨组织之间长期的生物化学结合11。现阶段临床常用的钛种植体表面处理技术为种植体表面经大颗粒喷砂和H2SO4/HCl混合液高温(125-130 )酸蚀得到，扫描电镜下可见表面含有少量的喷砂颗粒15，双重酸蚀法无喷砂过程，且不需要高温，避免了因高温引起的钛表面物理化学性能的改变，所以作者采用双重酸蚀法对纯钛试件表面进行粗化处理。3.2 试件表面沉积物的微观形貌 曾有学者证实钛试件表面经酸蚀处理后在钙磷过饱和液中浸泡8周后表面形成含碳酸盐的磷灰石层，16周后形成磷酸八钙，认为粗糙的表面微观结构具有更高的表面能，可以促进磷灰石的行核和长大16-26。实验的试件在钙磷过饱和液中浸泡的时间为1周，在未添加釉基质蛋白的试件表面几乎观察不到矿化物涂层的形成，原因可能是因为浸泡的时间太短或者表面的粗糙度不够所致。在加入釉基质蛋白的试件表面有明显的矿化涂层，随着釉基质蛋白浓度的增加试件表面形成的磷灰石矿化物明显增加，从极少数的矿化物晶体到几乎布满整个试件表面的矿化涂层；从形态上来看低浓度时所形成的磷灰石为散在的片状结晶，且体积较大，晶体长度约为9 m，当釉基质蛋白浓度达0.20 g/L时，晶体体积减小，晶体长度约为4.7 m，更密集，形核增多，逐渐融合成球状。由此推测，釉基质蛋白可以促进双重酸蚀处理后的纯钛表面在短时间内形成羟基磷灰石涂层，这一结果与Habelitz等27-28的研究结果相似。3.3 试件表面沉积物的能谱分析 人体骨骼中的有机成分主要为胶原，占骨骼总量的30%。无机部分的主要成分是磷灰石，占人体骨骼总量的70%，磷灰石由非晶磷酸钙和晶化的羟基磷灰石组成。人体骨骼中的磷灰石的钙磷比为1.67，实验中纯钛试件表面所形成的矿化涂层的主要元素有Ca、P、O和C，钙磷比为1.32-1.41，为缺钙型的磷灰石Ca10-X(HPO4)X(PO4)6-X(OH)2-X，缺钙型磷灰石是一种在骨生长和骨愈合过程中重要的矿物质29-30。3.4 试件表面沉积物的X射线衍射分析 由于实验的基底为钛，所以结果中钛的峰值比较明显，除去该峰值后，纯钛试件表面形成的矿化物涂层其主要衍射峰与羟基磷灰石的特征峰基本一致，当釉基质蛋白浓度为0.20 g/L时，羟基磷灰石特征峰的强度较大。说明釉基质蛋白可以促进双重酸蚀处理后的纯钛表面更快地形成羟基磷灰石涂层，且这一影响呈浓度相关性。3.5 结论 釉基质蛋白可以促进双重酸蚀处理后的纯钛表面更快地形成磷灰石涂层，且釉基质蛋白对纯钛表面磷灰石涂层的影响呈浓度相关性。作者贡献：黄慧进行了实验设计，实验实施为朱习华和吴倩雯，实验评估为吴倩雯和黄慧，资料收集为朱习华和吴倩雯。朱习华和吴倩雯成文。利益冲突：文章所有作者共同认可文章无相关利益冲突。伦理问题：没有采用活体动物进行实验，无需伦理要求。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。作者声明：黄慧对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。开放获取声明：这是一篇开放获取文章，文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。根据知识共享许可协议“署名-非商业性使用-相同方式共享3.0”条款，在合理引用的情况下，允许他人以非商业性目的基于原文内容编辑、调整和扩展，同时允许任何用户阅读、下载、拷贝、传递、打印、检索、超级链接该文献，并为之建立索引，用作软件的输入数据或其它任何合法用途。4 参考文献 References1 Brnemark PI. 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