提高中成药效率的PCLPEO纳米载药体系研究.doc

时间就是金钱，效率就是生命！提高中成药效率的PCLPEO纳米载药体系研究华东师范大学第二附属中学 高三 邵杨一 背景中药作为我国国药，近年来在政府、民营企业、新技术发展的推动下有了长足的发展。我国将按照中药现代化发展纲要提出的中医、中药协同发展的原则，以科技为动力，整合资源，加大投入，加快中医药理论、技术、产品的创新和突破，进一步推进中医药的全面发展。中药现代化工作取得了突出的进展：一批中药材规范化种植技术得到了推广，中药生产工艺技术、装备水平大大提高，中药研发体系不断完善，中药创新能力显著增强，自主开发了一批具有知识产权、技术含量高的中药产品，标准化、规范化程度不断提升，中药产业已成为中国快速增长的产业之一。据统计，2003年，全国中药工业总产值已达810.26亿元人民币，比上年增长10.66。中药工业的净资产收益率、销售利润率、成本费用利润率分别达到10.93、10.55、11.74，均高于医药工业的平均水平，显示了很强的发展潜力。在药物技术研究中，载药纳米微粒作为近年来新型的药物投递载体，由于其良好的生物相容性，超微小的粒径，良好的体内分布而受到日益广泛的关注。作为包载疫苗、多肽、蛋白和基因等大分子药物的载体，载药纳米微粒不仅可以增强药物的稳定性，增强疗效，降低毒副作用，由于其超微小的粒径可以有效地穿越组织间隙，可通过人体的毛细血管甚至血脑屏障被细胞吸收，从而更有效地对药物实行靶向和控制释放。此技术在医药学领域应用广泛，取得了令人瞩目的成绩，大大推动了医学科学的发展。临床治疗上，纳米技术被应用于药物治疗和DNA治疗方面，可获得药物靶向性、控释作用等，并可增大药物利用度，减小药物毒副作用，显著提高疗效。药剂学中的纳米粒可以分为两类：纳米药物和纳米载体。纳米药物是指直接将原料药物加工成的纳米粒，实质上是微粉化技术、超细粉技术的发展。纳米中药是采用纳米技术将中药有效成分,有效部位,原药及其复方多种中药制成小于100 nm的微粒复方制剂.例如中药雄黄主要含As2S3,对急性早幼粒白血瘤(APL)临床及细胞系有良好作用.因此国内有徐辉碧等研究了不同粒径的雄黄微粒对ECV-304细胞存活率,凋亡的影响.结果当雄黄粒粒径大小在500 nm时凋亡率为5.21%,当减小至100 nm时,使ECV-304细胞凋亡率为68.15%,有显著的变化.。纳米载药体系则是指溶解或分散有药物的各种纳米粒，如纳米脂质体、固体脂质纳米粒、聚合物纳米囊和纳米球、聚合物胶束等。美国布朗大学的研究人员以聚富马酸酐和聚丙交酯-乙交酯混合物为囊材，用相转化法制备胰岛素微囊，粒径为96。7201 nm。电镜观察表明，该微囊经口服后可迅速穿过小肠上皮，在上皮细胞间，Peyers patch和肝脏中均能发现微囊。将胰岛素药物制成纳米粒，再配合其他制剂技术，有可能使口服胰岛素用于临床。二 项目来源项目方向确定：多学科交融，促进中医药学术发展是今后中医药学取得进展的一条重要途径。从提高中药的技术含量角度出发，我们探寻着一种能提高中药吸收的良好解决方式。近年来，中药技术进步是我们有目共睹的，随着中成药的技术的日趋成熟，中成药替代草药的趋势变得更加明显。在没有能力对复方药物本身的性质加以改变创造出新药的情况下，我们预期通过一种药物辅料或多种辅料提高药物搭载的量，从增大受药量这个角度提高中药的利用率。纳米药物载体系统作为新型的药物投递和控制释放系统，受到国内外学者的广泛关注。其中，聚合物胶束是近几年正在发展的一类新型的纳米载体。与在此之前一直被使用的脂质体相比，聚合物纳米粒药物载体具有更好的稳定性及优异的控制释放性。它与药物的结合，可以是包封，也可以是附载，前者形成毫微囊、后者形成分散体。用于制备纳米微粒制剂的辅料多为高分子聚合物。利用双亲性嵌段共聚物制备纳米胶束作为脂溶性药物和基因的投递和释放载体系统近来受到了极大的重视。材料选择：用来制备载药纳米微粒的材料主要分为天然高分子和合成高分子两大类：前者主要是多糖、蛋白质、氨基酸等材料。后者主要有聚酯类、聚酸酐、聚酰胺类以及聚原酸酯类等。其中壳聚糖，海藻酸，聚乳酸，PLA，聚羟基乙酸，PGA，聚己内脂等被广泛应用。我借鉴了众多聚乳酸聚氧化乙烯（PLAPEO）共聚物在国内多个研究机构的研究成果，对采用了同类型的油脂性分离法纳米载药体系的多种材料的可行性进行了分析，由于国内在PLA/PEO嵌段共聚物纳米载体中研究较为广泛，故选择了可行性较高的生物降解性能优异的聚己内酯(PCL)和聚乙二醇(PEG)的嵌段共聚物进行实验。根据生物降解塑料研究会的土壤填埋及水中浸渍试验结果，PLACCEL-H试样在大多数场所经六个月后消失，一年后几乎所有场所中的试样均消失。这种生物降解速度，仅次于微生物合成的PHB和纤维素，在合成高分子中具有最良好的生物降解性。我有目标地合成水溶性嵌段共聚物或接枝共聚物，使之同时具有亲水性基团和疏水性基团，在水中溶解后自发形成高分子胶束，完成对药物的增溶和包裹。因为具有亲水性外壳和疏水性内核，适合于携带不同性质的药物，亲水性的外壳还具备“隐性”的特点。正由于这种稳定的结构，胶束的释放过程缓慢，可以保持药物的长效缓释和靶向部位的集中释放，胶束中亲水性核部分的聚集是整个胶束形成的驱动力，这种驱动力包括：疏水作用力、静电作用力、金属络合力以及嵌段部分的氢键。组装方法：本项目利用嵌段共聚物载体通过自组装方法，在选择性溶剂水(对PEO嵌段是良溶剂，而对PCL嵌段是不良溶剂)中，形成胶束样纳米粒，其内核为PCL，外壳为PEO。要达到相分离，采用的方法为沉淀法。在项目中，我们采用封管聚合的方法成功地合成了一种新型的可生物降解的两亲聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯三嵌段共聚物，并对此共聚物的物理、化学性质做了详细研究。该嵌段聚合物中，聚己内酯嵌段为疏水链段，聚乙二醇为亲水链段，通过调节这两种链段在聚合物中的含量比及亲水憎水性能，可以控制纳米微粒的粒径，以及对既含亲水成分、又含疏水成分的复方中药的包埋。以此ABA三嵌段共聚物为基础，我们采用自组装法制备了具有核壳结构的纳米微粒，对选定的模型药物进行了载药实验。 结构简式及示意图：下图为己内酯示意图 下图为聚乙二醇片段示意图 下图为合成后的PCL-PEO-PCL三嵌段共聚物片段示意图计算投料比的思路及过程如下一个PEG6000分子(双端羟基，以形成三嵌段共聚物)反应生成一个三嵌段聚合物分子；剩余分子量为 50000-6000=44000；-CL分子量为114， 44000/114=386 ；即PEG6000与-CL两者的投料比(摩尔比)为1:386；设总投料量为5g, 其中PEG6000 x g, 那么-CL的量为(5-x) g, 解下式：(x/6000) :(5-x)/114 =1:386； x=0.6，5-x=4.4；即PEG6000的投料量为0.6g，-CL的投料量为4.4g .三 实验制备部分主要试剂己内酯(-Caprolactone，-CL)，99%，Acors公司。聚乙二醇(poly-ethylene glycol，PEG)，化学纯，分子量2000、4000、6000三种规格，中国医药(集团)上海化学试剂公司。辛酸亚锡(Sn(Oct)2)，华东理工大学样品，用无水甲苯配制成约0.02g/ml溶液，置于干燥器内备用。甲苯(Tolene)，分析纯，上海菲达工贸有限公司和桥分公司。干燥处理。氯仿(Chloroform)，分析纯，中国医药(集团)上海化学试剂公司。甲醇(Methanol)，分析纯，上海振兴化工一厂。氢化钙(Calcium hydride)，95，中国医药(集团)上海化学试剂公司。其他试剂如钠、无水氯化钙、浓硫酸等均为分析纯样品。冬凌草甲素(Oridonin)是一种抗癌药物，它对各种癌症有明显治疗作用，且副作用小，在国际国内市场需求量很大，该产品在国内的参考报价为(人民币)18-22万元/千克，国际市场上的报价则更高，它的产业化具有重大的经济意义。1 PCL-PEO-PCL三嵌段共聚物的制备以辛酸亚锡为催化剂，185C条件封管聚合制备聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯(PCL-PEG-PCL)三元嵌段共聚物。具体方法如下：量取一定量的Cl加入到封管中，再向其中加入计算量的PEG及辛酸亚锡，70溶化，涡旋混合均匀。然后封管接真空系统，抽真空充氮气，至少三次，抽真空1小时后，熔封封管。该封管横放于185烘箱中，反应36小时。封管中得到固体，开始时呈完全透明，取出放冷后变为乳白色。所得粗产物溶解在氯仿中，再在过量甲醇中沉淀，以除去其中未反应的PEG和均聚物。所得沉淀离心分离后，再用氯仿溶解，沉淀。如此纯化三次，于50真空干燥72小时。得白色絮状固体。无水条件保存。2 PCL-PEO-PCL纳米球的制备空白纳米球制备采用自组装法制备PCL-PEO-PCL共聚物纳米微粒。准确称取100mg聚合物，溶于丙酮制成溶液。在25C恒温条件下将此溶液用滴管逐滴滴入50ml双蒸水，中速磁力搅拌，可明显看到有乳光现象。保持25 C，磁力搅拌4h，旋转蒸发除去丙酮，并浓缩溶液体积至20ml左右。放冷，用0.65um的水相微孔滤膜抽滤，以除去聚集体。存放于具塞试管中，放置于干燥器中。待冻干。载药纳米球制备以冬凌草甲素作为模型药物。称取100mg的PCL-PEO-PCL嵌段共聚物溶于20ml已蒸丙酮中，放置过夜，待共聚物充分溶胀；再加入约10mg的冬凌草甲素溶解均匀。将共聚物的丙酮溶液逐滴滴入水相中，其余步骤同上。冷冻干燥称取100mg无水葡萄糖(A.R)溶于上述溶液，可看到有一点丝状的共聚物析出。将溶液倾倒于培养皿中(要摊薄，液面厚度5mm)，用保鲜膜封口，放于-30冰箱中预冻(预冻温度在共熔点以下)。次日，将已预冻的样品置于ALPHA1-4冷冻干燥机内，深冻至-60C，干燥20h，直到显示真空度恒定，说明水分已完全去除。取出置于干燥器内保存。四 表征部分1嵌段共聚物的表征凝胶渗透色谱（GPC）将上述纯化后的样品进行GPC表征，图1是所得的GPC谱图。如图， 重均分子量MW为5.3889104。分子量符合设计要求(设计重均分子量5万)，且多分散性也较好，证明聚合方法是成功可行的。而GPC谱图上只有一个单峰，并图1 三嵌段共聚物的GPC谱图没有测到其他的峰，说明纯化方法是可行的，纯化过程较完全。未聚合的己内酯单体，聚乙二醇分子和一些分子量较小的均聚物杂质已被完全除去，得到了纯净、单一的聚合物。傅立叶变换红外光谱FTIR为证明所得的聚合物是我们所预期的二组分嵌段聚合物，我们用红外光谱对聚合物的结构进行了表征。图2是所得聚合物的傅立叶变换红外谱图。图2 三嵌段共聚物的特征FTIR光谱谱图如图，在1730cm-1处有一个峰，该峰为C=O的振动特征峰，对照实验，易知，该羰基为己内酯的羰基，证明在聚合物中有己内酯片断。在28003000 cm-1的峰显然是由饱和的C-H振动引起的，2944 cm-1的峰表明有聚己内酯片断，而2866 cm-1的吸收峰则显示聚乙二醇片断。此外，由文献可知，11001350cm-1复杂区域为C-O伸缩振动与C-H面外摇摆吸收的综合效果，而1093 cm-1处的峰为聚乙二醇醚键的特征吸收。综合以上数据和实验情况，可以肯定，在所合成的聚合物中，一定具有聚己内酯片断和聚乙二醇片断。差热分析DSC我们还对该聚合物进行了差热分析。图3 PCL-PEO6000-PCL与PCL-PEO2000-PCL聚合物的DSC谱图该谱图的两条谱线分别为PCL-PEO2000-PCL和PCL-PEO6000-PCL的差热分析谱线，显示的峰为聚合物的熔点峰。明显有，前者的熔点比后者低3.3 C左右，根据文献得知，PEO组分对该嵌段聚合物的结晶行为和热性能有重大影响。因此可以考虑通过调节链段的长短使共聚物处于不同的释放的环境。PCL-PEO-PCL纳米粒子的表征荧光法测定纳米球临界胶束浓度CMC如上所述制备纳米球的方法，制备聚合物浓度为1g/L的纳米粒子乳液。以此乳液为母液，稀释后配制成从0.00005g/L到1g/L不同纳米粒子浓度的溶液。向每瓶中加一定量芘，使每瓶中芘浓度相同，将芘进入PCL-PEG-PCL纳米球中静置24小时后，用FLS-920荧光分析仪测定其临界胶束浓度。荧光探针的技术可被用来研究微胶束在溶液中的性质。 图4是芘在不同浓度PCL-PEG6000-PCL聚合物纳米微粒乳液中的荧光激发光谱，从该图中可知，聚合物浓度改变不仅会引起激发强度的变化，还会使激发峰发生位移。当PCL-PEG-PCL浓度很低的时候，聚合物并不能形成纳米微粒，只有当聚合物的浓度增大到一定值后，其疏水成分才会聚集起来，形成纳米微粒的核，而亲水成分同时形成壳，此时的聚合物浓度即临界胶束浓度。图5反映了芘I338/I335的值和PCL-PEG-PCL浓度的关系。显然有，在较低浓度时，I338/I335值几乎没有什么变化，当PCL-PEG-PCL的浓度增加到一定值后，I338/I335的数值急剧增加，然后又到达一个平台。如图5中所示的两条直线的交点即曲线的拐点，它代表的浓度即是PCL-PEG6000-PCL的临界胶束浓度。由数据可以读得，该体系的临界胶束浓度约在0.008g/L，虽然不是非常低，但仍图4 空白PCL-PEO-PCL和 PCL-PEO-PCL载体的荧光激发光谱谱图 图5 PCL-PEG6000-PCL的临界胶束浓度在可接受范围内，纳米球比较稳定，进入体内后也不易崩溃，发生突释使人体中毒。表1 纳米载体球的CMC 值统计样本PEG 容量 %CMC g/LPCL-PEG6000-PCL18.30.008PCL-PEG2000-PCL4.00.002表1列出了不同PCL-PEG-PCL聚合物的CMC。从表中可以看出，CMC随聚合物中疏水组分的增加而减小，说明疏水成分的增加有利于形成具有核壳结构的纳米微粒。这些结果和文献报道的结论是一致的。SEM测定纳米球形态和动态光散射DLS表征结果仪器：XL-30 ESEN Philip 图6 PCL-PEO-PCL 纳米球SEM的电镜影像 图6所示为扫描电镜所得的两张照片，如图中所示，纳米粒子呈圆整的球形，这也进一步证明了我们的组装产品是值得信任的。表2 样品PCL-PEO2000-PCLPCL-PEO6000-PCL性能粒径(nm)多分散性粒径(nm)多分散性空白202.30.08177.30.27载药203.10.12183.30.26如表中所示，纳米粒载药前后粒径有些许变化，但都在理想的纳米药物粒径范围内。对此可以解释为：随CL在嵌段聚合物中的含量减少，纳米粒子的粒径也减小；同时，随PEO在聚合物中的含量增大，单个纳米粒子之间会出现聚集，形成了该系统中的大粒径部分。所以，PCL-PEO6000-PCL纳米粒子的粒径分布会大于PCL-PEO2000-PCL载体。五 数据处理和结论配制5个不同浓度的冬凌草甲素标准溶液，用HP 1100高效液相色谱仪得到其检测器响应强度对流出时间图，计算此图中每一曲线的冬凌草甲素峰面积，再将该峰面积对对应的浓度作图，得一标准曲线。称取一定量冻干后的载药纳米粒，溶出后得到一冬凌草甲素溶液，取一定量用同样的方法，得到该稀释溶液的检测器响应强度对流出时间图，计算得此曲线的冬凌草甲素峰面积，在标准曲线上找到对应的浓度，即该溶液的药物浓度。根据公式（1）、（2）： (1) (2)以浓度乘以全部溶液体积，可知取出纳米粒中所载药物的质量。将此质量比上总的纳米粒质量，即得纳米粒子的载药量。而将此质量比上药物投料质量，即得药物包封率。 仍然用高效液相色谱法测定冻干纳米粒中所包裹药物的量，采图7 图8用标准曲线法来定量。图7、图8分别是我们所测得的标准溶液HPLC谱图和根据此图得到的峰面积-浓度标准曲线。称取一定量冻干后的载药纳米粒子溶于丙酮，所得溶液稀释到标准曲线所在的范围，测其HPLC谱图。用计算得的峰面积在标准曲线上找到对应的浓度，乘以溶液体积，得到溶质质量，再利用公式1、2进行计算：用上述方法分别对PCL-PEO2000-PCL 及PCL-PEO6000-PCL载体进行了冬凌草甲素载药实验，各项结果列表如Table3，显示了较高的装载药物的能力，说明此共聚物胶束用作药物的载体是可行的。表3 不同链段长短的载体在药两及包封率载药量/%包封率/%得率/%PCL-PEO2000-PCL9.9699.399.96PCL-PEO6000-PCL9.5895.899.62表中数据投料比是10mg药物：100mg纳米粒时的载药量，按照这个趋势，如加大投料比，载药量还可能有更大的提高。因为种种条件的约束，对于在纳米载药的缓释实验并没有完成，原定计划配置了不同比率含药的同种纳米载药纳米球的缓冲液，将之静置十天时间，定期测量溶液中药物的含量。实验仅进行到了第四天就因周围环境的影响导致溶液中已经近乎检测不到药物含量的变化而终止了。初步测想原因是由于实验条件不足所至（浓度分别为0%、3%、5%、10%、20%的NaCl溶液）。此处仅转载了来自图9HAIXIONG GE,YONG HU,XIQUN JIANG ect. Preparation,Characterization,and Durg Release Behaviors of Drug Nimodipine -loaded PCL-PEO-PCL Amphiphilic Triblock Copolymer Micelles from JOURNAL OF PHARMACEUTICALSCIENCES VOL. 91, NO. 6, JUNE 2002的Nimodipine缓释曲线图（图9），仅作为参考。由于试验方式相近，可以判断冬凌草甲素也是有明显缓释过程的。对于如此高的载药率，我们也考虑到了是否存在并非所有的药物都已装载到纳米粒子内部，可能有部分药物沉积在粒子表面或者存在于粒子间隙当中的问题。对于这个问题，我们认为，因为所选的模型药物难溶于水，在水中的溶解度非常低，若在载药时没有包封进纳米球，则在水相中会很快结晶析出，在后续处理步骤中，用0.65m微孔滤膜过滤时会被完全除去。所以不可能有药物存在于粒子间隙的情况。另外，对于沉积在纳米粒子表面的微量药物对于载药量的影响问题，我们设计了如下实验来解决。将载药冻干后的粒子置于离心管中，加入37C纯水，用振荡仪对其进行振荡，使沉积在粒子表面药物溶解到水相中去(可痕量溶解)，如此反复多次，完全洗脱粒子表面吸附药物，再进行冻干。此后对于再冻干的粒子进行载药量测，将后者的结果与一次冻干的载药量对比，若相差不大，则说明沉积在纳米粒子表面的药物基本不能对载药量产生影响；若相差很大，则需通过另外的方法来解决载药问题。六 展望载药纳米微粒可靠的生物安全性、超微小的粒径结构、灵活的成分配比和可控的降解速度，使其具有广泛的应用前景。目前载药纳米微粒还存在着诸多共性的问题：(1)药物包载率过低；(2)口服纳米微粒的吸收机理尚不完全清楚；(3)生产过程成本过高以及工艺不稳定和制备过程中引入的少量不易去除的有毒物质残留。解决这些难题需要我们不断研制新的生物医用材料，不断发明改进新的先进而安全的制备方法。随着分子生物学和细胞生物学研究的不断深入，我们能够从分子水平认识药物的发生和发展，并了解伴随病症等疾病过程不同层次(如组织、细胞、细胞受体等)的特异性生理变化。这为纳米药物载体系统的靶向性研究提供了基础。将来的发展必朝着混合药物实验生物相容性实验临床实验，直至最终投入医药市场。对比现阶段已投入生产的诸多同等科技产品，本项目的深入研究具有极大的推广价值，值得我们期待。七 参考文献1. 俞耀庭, 张兴栋. 生物医用材料. 天津: 天津大学出版社, 2000: 5062.2. 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