食品中的生物毒素研究及进展.doc

食品中的生物毒素研究及进展摘要：。本文简述了生物毒素的致病机理，常见生物毒素的污染现状与国内外对不同真菌毒素的检测生物毒素的常用方法，为进一步加强生物毒素污染的控制提供依据。关键词：生物毒素、致病、检测。前言：生物毒素是一类重要的天然污染物1，根据来源可分为：微生物毒素、动物毒素、植物毒素。传统的生物毒素分析采用薄层层析法(TLC)4-6、微柱层析法7、高效液相色谱法(HPLC)8-9、毛细管电泳法(CE)10等。但TLC 法灵敏度低；微柱层析法需要用其他的分析方法进一步测定确认；HPLC 法要求样品纯度高，样品处理烦琐，操作复杂，仪器昂贵；CE 法操作复杂，成本较高。总之，上述分析方法只能用于实验室，很难适应现场简单快速、方便的要求。而酶联免疫吸附分析法(ELISA) 具有灵敏度高、干扰小、操作简便快捷、安全性高、污染小等优点11适合于食品中生物毒素的快速检测。在食品加工中，谷物和其他食品原料中的真菌毒素无法完全被破坏，使最终食品受到真菌毒素残留的污染。谷物中常见的真菌毒素包括黄曲霉毒素、赫锗霉毒素、伏马毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米烯酮。研究表明，食品加工对真菌毒素的稳定性有明显的影响，尤其是高温的影响最为显著。正文：1食品中微生物毒素的检测在各种食物中毒中，以微生物毒素中毒最多。ELISA 法检测食品中微生物毒素的报道有很多12-14。1.1 细菌毒素的检测1.1.1肉毒毒素13目前已知的化学毒物与生物毒素中毒性最强烈的一种，对人的致死量10-9mg/kg bw，毒力比氰化钾大一万倍15。Carlin 等12采用PCR-ELISA 法检测冷冻食品原材料中的肉毒毒素，并采用动物实验法对浓缩肉汤中细胞和毒素进行检测。结果显示，28个样品中有15个样品在动物实验中被检出呈阳性，MPN 值在1 3 之间。1.1.2金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌的检测方法主要有传统的分离鉴定法、免疫学检测法和核酸检测法。目前，由于PcR技术具有特异性、敏感性、快速性等特点被广泛应用于金黄色葡萄球菌的检测20。其特异的引物主要依据金黄色葡萄球菌的特异毒性基因序列或其基因组中的特异序列而设计。与此同时，金黄色葡萄球菌的亚分型方法在近几年也得到了很快的发展，尤其是以DNA为基础的遗传亚型的建立。它主要包括脉冲场凝胶电泳(PFGE)、核糖体(形botyPing，RBT)分型和DNA序列分析等。脉冲场凝胶电泳对金黄色葡萄球菌的分辨率高、敏感性强，但它检出的菌株间小的遗传差异在流行病学上是没有意义的;而且，即便在两个样本间检测出相同的脉冲场凝胶电泳型，也并不一定意味着两个分离株之间存在必然的联系50一561。核糖体分型使用内切核酸酶如EcoRI能将金黄色葡萄球菌菌区分为与表型和毒力相关的不同基因型，但分辨率和准确性不够高17一22。以DNA序列分析为基础的亚分型主要指多位点序列分型(MLST)，它通过对多个基因或基因片段进行测序来确定细菌的亚型及各分离株之间的遗传相关性。一般来说MLST的靶基因是通过中性改变而引起的多样化基因(通常是看家基因)，而不选用阳性选择引起的多样化基因(毒性基因)，因为这些基因并不能反映分离株之间的遗传进化关系。但另一方面毒性基因的多样性高，对其测序区分能力更强。作为致病性的金黄色葡萄球菌，能产生多种毒素蛋白，其中引起食物中毒的主要是肠毒素，所以越来越多的学者把研究的重点转移到关于肠毒素基因在菌株间分布规律的摸索上来。肠毒素是一类结构相关、毒力相似、抗原性不同的胞外蛋白质，除了SEA、SEB、SEC、SED、SEE等5种早已被鉴定的血清型外，近几年还发现了SEG、SHE、SEI、SEJ、SEK、SEL、SEM、SEN和SEO等新型的肠毒素。由于缺乏简单特异的检测方法，新发现的各型肠毒素与食物中毒之间的关系尚未明确。国外有采用PCR方法检测新发现的肠毒素基因的报道15，也有少量的各型肠毒素基因分布的报道66l。在国内，张严峻等人针对从鲜牛奶中获得的29株金黄色葡萄球菌，进行了肠毒素基因菌株间分布规律的研究22。2.真菌毒素的检测真菌( Fungi) 是一类有细胞壁、不含叶绿素、无根叶茎、以腐生或寄生方式生存、能进行有性或无性繁殖的微生物。真菌毒素(mycotoxin) 是真菌产生的次级代谢产物, 目前已知有300 多种。其中对人类危害最大、人类也研究最多的真菌毒素主要有: 黄曲霉毒素, 主要是黄曲霉毒素B1 和M1 ( aflatoxins,AFB1、AFM1) ; 赭( 棕) 曲霉毒素A( ochratoxin A, OTA); 杂色( 柄) 曲霉毒素( sterigmatocystin) ; 展青霉毒素( patulin, PTL) ; 串珠镰刀菌毒素;三硝基丙酸以及属于单端孢霉烯族化合物( trichothecenes) 的T- 2 毒素( T- 2 toxin, T- 2) ; 脱氧雪腐镰刀菌烯醇( 呕吐毒素)( deoxynivalenol, DON); 麦角胺(ergotamine); 细交链孢菌酮(tenuazonicacid)等11。这些真菌毒素不可以污染食品引起食物中毒, 而且有些还具有致癌、致畸、致突变作用, 对人类健康造成极大威胁。2.1 致病机理真菌毒素具有致畸、致癌和致突变性等特性，对人类危害大，污染范围广。目前小部分真菌毒素的毒理作用已经被阐明，但大分真菌毒素的作用机制还不明了。食品中几种常见真菌毒素的致病机理大致如下：(1)黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)：有致癌性，可抑制D N A 、R N A 的合成，也是细胞毒，还可破坏凝血机制、破坏某些酶类等，从而产生症状或致癌；( 2 ) 赭曲霉毒素(o ch rat ox in s，OT A)：可抑制A TP 酶、琥珀酸脱氢酶以及细胞色素c 氧化酶，从而对羟化过程产生作用；(3)单端孢霉烯族毒素(trichothecenes，Ts)：主要是抑制蛋白质、R N A 、D N A 等大分子物质的合成，破坏细胞膜和酶类的功能，对造血系统和免疫系统有较强的毒作用；(4)玉米赤霉烯酮( z e a r al e n o n e ，Zea 或ZEN)：具有雌激素样作用；(5)付马菌素(fumonisins，F ) ：作用机制不甚明了，但与某些癌症的发生密切相关；(6)串珠镰刀菌素(moniliformin，MON)：主要通过抑制丙酮酸脱氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶等发生作用；(7)橘(citrinin，CIT)：在线粒体内聚集且干扰电子传递系统，导致D N A 合成受到抑制，并进一步使RNA和蛋白质合成受到抑制，肝糖原下降，胆固醇和甘油三酸脂合成受阻。2.1检测方法2.1.1 生物鉴定法生物鉴定法是利用真菌毒素能影响微生物、水生动物、家禽等生物体的细胞代谢来鉴定真菌毒素的存在。其方法专一性差，灵敏度低，一般只作为化学分析法的佐证。其特点是待检样品不需很纯，主要用于定性，共有10 种：(1)抑菌试验；(2)对微生物遗传因子影响试验；(3)细菌发光试验；(4)荧光反应；(5)组织培养检测法；(6)鸡胚试验；(7)鸭胚试验；(8)鳟鱼试验；(9)植物试验；( 1 0 ) 饲喂实验动物试验。2.1.2 化学分析最常用的为薄层层析法( T L C )，适用于粮食及其制品、调味品等真菌毒素的检测， 主要是半定量。Cvetnic Z1和Hadiani M R2等分别用TLC 法分离和鉴定伏马菌素和黄曲霉毒素，取得了良好的效果。2.1.3 仪器分析法高效液相色谱法(HPLC)是20世纪70年代发展起来的一种以液体为流动相的新型色谱技术。近年来，高效液相色谱已成为现代仪器分析中应用最广泛的一种方法。其高分离效能，高检测效能，分析快速，为同时测定多种真菌毒素提供了条件。李军等3应用H P L X法，检测谷物中黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素，检测限分别为黄曲霉毒素0.24 g/kg，玉米赤霉烯酮4.0mg/kg 和赭曲霉毒素0.5mg/kg。此外，与质谱联用，还可大大提高分析的灵敏度和可靠性。毛细管电泳技术是20 世纪80 年代发展起来的一种新型液相分离技术。它融合了H P L C 和常规电泳两项技术的优点，具有快速、自动化、可有效分析复杂成分等特点。曾红燕等4建立了粮食样品中玉米赤霉烯酮及其代谢物的毛细管电泳测定方法，玉米赤霉烯酮、黄曲霉Bl、赭曲霉A 的检出限分别为：0.0084、0.081、0.14、0.0016、0.031g/ml。样品加标回收率77.9%103.1%，相对标准偏差0.63%1.98% 。该法灵敏、准确，可用于粮食样品中玉米赤霉烯酮等真菌毒素的测定。Maragos C M 等5建立的玉米中玉米赤霉烯酮的毛细管电泳方法，检测限可达到5 n g / g 。2.1.4 免疫分析法真菌毒素属于半抗原，抗原性弱。检测食品中的真菌毒素常用理化方法或生物学方法。但理化法需要较昂贵的仪器设备，操作复杂。而用真菌毒素单克隆抗体检测真菌毒素敏感性高、特异性强，非常适用于食物样品的检测。这种方法是利用免疫、酶及生化技术，开辟了真菌毒素分析的新领域。目前应用的方法有放射免疫法、亲和层析法和酶联免疫法。放射免疫法特异性强、灵敏度高、比较准确迅速、操作简单、易于标准化；但也有严重的缺点，特别是需要持殊的设备和安全保护，妨碍了更广泛的应用。Offiah N 等6采用放射免疫的方法检测了438份样品中的黄曲霉毒素，其中包括花生、牛奶及其制品等。黄曲霉毒素的检出率为4.1 % 。亲和层析法是利用免疫化学反应原理，采用大剂量的单克隆抗体，选择性吸附提取液中的抗原物质。由于抗原- 抗体反应具有高灵敏、高选择、高特异性等特点，从而大大提高了试样的净化效果及检测灵敏度，同时可显著减少有毒有害试剂的使用，十分有利于操作人员的健康和环境保护。Aksenov I V 等7将免疫亲和层析法与荧光- HPLC 法联用，检测限提高至0.5mg/kg，优化了赭曲霉毒素的检测方法。2.1.5 生物芯片分析法生物芯片是近十几年来在生命科学领域迅速发展起来的一项高新技术，是一项基于基因表达和基因功能研究的革命性技术，它综合了分子生物学、半导体微电子、激光、化学染料等领域的最新科学技术，在生命科学和信息科学之间架起了一道桥梁，是当今世界上高度交叉、高度综合的前沿学科和研究热点。胡娜8采用基因芯片技术检测黄曲霉菌产毒前后产毒相关基因的差异表达情况，发现部分相关基因产毒前后表达差异明显。Tudos等9将酪蛋白与小麦中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)共价连接制成人工抗原固定在芯片上，通过检测溶液中的DON 抗体与固相抗原结合以SPR技术检测反应信号，构建了可以对DON进行定量分析的免疫微阵列，最佳检测限范围为2.530ng/ml，检测结果与使用气质联用(G C - M S )检测相一致。生物芯片技术具有传统的检测方法不可比拟的优点：高通量、多参数同步分析；全自动、快速分析；高准确度、灵敏度分析。利用抗体芯片技术检测真菌毒素，可以实现多种真菌毒素以及其它危害化学品的同时监测，大大缩短样品提取和检测时间，提高工作效率。虽然抗体芯片研究还处在初期发展阶段，但我们相信随着其不断深入发展，抗体芯片技术一定会在食品安全领域中发挥出巨大的作用。目前生物芯片正在成为监督食品的卫生、安全和食品质量和保证人类健康的一种较新的方法，并且将对整个食品领域产生深刻的影响。2.2 LC- MS 检测食品中真菌毒素2.2.1黄曲霉毒素的检测黄曲霉毒素(AF)是由黄曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉所产生的1组毒性代谢产物。目前已分离出20 多种, 根据它们在紫外光下发出的荧光颜色分为2 大族, 即B 族和G族。AFB1、AFB2、AFG1 和AFG2 是4 种基本的黄曲霉毒素, 其余均为衍生物。从化学结构上看, 所有AF 具有相同的基本结构, 它包括1 个双呋喃环和1 个氧杂酮, 前者为毒性结构, 后者有加强毒性及致癌作用。其中AFB1 被公认为是目前致癌力最强的天然物质。AF常常存在于土壤、动植物及各种坚果中, 特别是花生和核桃中, 在大豆、玉米、奶制品及食用油等制品中也经常发现AF。各国大都制定了相关法律来限定其在食品中的含量。例如, 欧盟国家规定, 要求人类生活消费品中的AFB1 的含量不能超过2 g/kg, 总量不能超过4 g/kg; 牛奶和奶制品中的含量不能超过0.05 g/kg3。中国也制定了AFB1 限量标准。林建忠等4用LC-MS 测定食品中的AFB1。使用API 3000 三级四极杆质谱系统和Agilent 液相系统(Agilent 1100)。色谱柱为ECNuceodur100- 5 C18 柱(250 mm4.6 mm); 流动相:10 mmol/L , 乙酸铵甲醇的体积比37; 流速:800 L/min。质谱采用ESI源, 正离子反应监测模式, 前级离子m/z=313.0, 二级离子m/z=285.3。样品经AF 免疫亲和柱纯化后用95粮 食 加 工 2007 年第32 卷第3期LC/MS 进行测定。质谱系统稳定的情况下, 可在1 h之内检测大部分食品中的AFB1 并给出灵敏可靠的结果。本法在0.505.0 g/kg 的AFB1 时回收率为60%90%, 相对标准偏差为9.62%, 检测限达0.05g/kg, 可满足欧盟最新限量要求。Ventura 等5建立了1 种简便的测定Rhammuspurshiana 中黄曲霉毒素B1、G1、B2、G2 的LC-MS 方法。用甲醇- 水混合物提取样品中的AF, 然后用装有聚合物吸附剂的固相萃取柱进行净化。净化液直接进样, 色谱系统装有C18 反相短柱, 使用甲醇- 水的体积比3070 作流动相; 质谱系统是单级四极杆质谱, 带电喷雾电离源, 使用阳离子模式。结果显示有较好的重复性, AFB1、AFB2、AFG1、AFG2 的回收率分别为100%、89%、81%、77%。S/N =3时检测限达10 ng,S/N=10时检测限为25ng。2.2.2串珠镰刀菌毒素的检测串珠镰刀菌毒素(MF) 属剧毒物, 有很强的心脏毒性, 中毒死亡后可见心肌坏死性病变, 近年研究表明该毒素可能是克山病主因。MF 广泛污染粮食作物, 其中对玉米及玉米制品的污染率较高12。Sewram 等13以三乙胺作为离子对试剂应用LCMS测定镰刀菌毒素培养基中的MF 与自然污染的玉米中的MF。HPLC 分析中使用Spectra Series P 2000 泵并联有AS 1000 自动进样器, UV 1000 可变波长紫外检测器, 150 mm 2 mm C18 反相色谱柱( 填充有5mODS- 2) 。流动相: 醋酸铵- 甲醇- 三乙胺的体积比90100.1, pH 8.24, 流速0.5 mL/min。样品过0.45 m 微孔滤膜, 进样量为20 L。229 nm 为紫外检测限。负离子APCI-MS 中应用Finnigan MAT LCQ 离子阱质谱。直接以5 L/min 的流速将30g/mL MF标样混入样品、混和进样以优化MS 参数。APCI气化温度和质谱毛细管柱温为350 和150 。电流保持在5 A, 电压保持在8 V。调整期间, 质谱从m/z 50 扫描至m/z 150, 之后的所有实验都是在SIM模式m/z 97 监测去质子分子离子M- H- 下完成的。5种南非产的Fusarium subglutinans 菌株在玉米颗粒上培养, 用955 的乙腈水溶液提取MF。过C18 反相固相萃取柱, 萃取液上LC-MS 分析。研究发现MF 的响应在进样量10 ng700 ng 之间保持线性, 检测限为10 ng, 信噪比为4。MF 的浓度范围在130 mg/kg 培养基到1 460 mg/kg 培养基之间。将此方法用于自然污染的玉米样品结果表明LC-MS 能够检测所选玉米中10 g/kg的MF。3食品中动物毒素的检测食品中动物毒素中毒以食用贝类和河豚鱼中毒为多见，我国的水产品卫生管理办法中严禁餐饮店将河豚鱼作为菜肴经营15。张纹等25采用酶联免疫法检测菲律宾蛤子肌肉中麻痹性贝毒(PSP)含量。结果显示，以标准PSP 为参照，该检测方法平均灵敏度可达2g/kg，标准溶液测定的变异系数2.00%7.66%，样品精密度测试的变异系数为2.82%8.40%，平均添加回收率达85.35%。该法有快速、灵敏、可靠等特点，适于常规工作中麻痹性贝毒的快速筛选检测。李世平等26应用小鼠生物实验和间接竞争抑制酶联免疫吸附实验(ELISA)同步检测17 份河豚鱼肝组织和20份河豚鱼肌肉组织中的河豚毒素含量，并对两种方法进行比较。结果表明，ELISA 法与小鼠生物实验测得的结果相符合。ELISA 法由于其测定程序简便易行、速度快、灵敏度高，在河豚毒素的定量检测以及在预防河豚鱼中毒方面具有广泛的应用前景。4植物毒素植物毒素是由植物产生的能引起人和动物疾病的有毒物质，分为植物蛋白毒素和植物非蛋白毒素21。国内外常有误食含有植物毒素的食物中毒的报道22，国内外学者采用多种分析测试手段对植物毒素进行分离检测18-22，但有关植物毒素ELISA 法检测的报道并不多19-22。5. 植物蛋白毒素植物蛋白毒素可以直接免疫动物，免疫血清能有效保护动物和培养细胞而对抗相应引起的中毒23。杨运云等先后建立了双抗体夹心酶联免疫法22和间接酶联免疫法24检测蓖麻毒素。方法的线性范围在0.081.25mg/L之间，相关系数r=0.9923，检出限为0.02mg/L。将该法用于检测实际水样、土壤、奶粉和血液蓖麻毒素加标样品，回收率在60%98% 之间。而郭建巍等23建立的检测蓖麻毒素的双抗体夹心ELISA 法，方法灵敏度高，操作简便快捷，但检测自来水样回收率不高。李丽琴等14成功制备了相思子毒素抗血清，通过比较几种不同的抗体纯化方法，制备出高纯度抗体，粗提抗血清能有效地预防和紧急救治相思子毒素中毒。6.植物非蛋白毒素植物非蛋白毒素是小分子有机化合物，需要与载体蛋白连接才能激发免疫反应12。国内外有对动物疯草中毒的报道16，已确认的疯草毒素有苦马豆素等。Tong等17建立间接竞争ELISA 法检测苦马豆素，采用苦马豆素- 人血清白蛋(SW-HBA)结果显示第二次免疫后一些山羊产生的抗-SW 抗体高达28。Lapcik 等18合成香豆雌酚的半抗原和偶联物，建立免疫分析方法检测香豆雌酚，方法的线性范围为204000 pg/ml，检出限为140pg/ml，回收率为94.8%，适合微量样品的检测。总结：生物毒素可污染食品引起食物中毒, 有些还具有致癌、致畸及致突变作用, 对人类健康造成极大威胁。生物毒素在粮食中广泛存在, 因而是食品的重要污染源。随着科学技术水平的日新月异的发展人类对文明程度的要求越来越高特别是对危害人类健康的重要的致病毒素人类进入21 世纪一些致病毒素的快速检测技术也得到了迅速地发展。随着检测方法和分析技术的发展，人们发现生物毒素几乎广泛存在于所有的食品中，所以，食品中的生物毒素污染尤其应引起重视。参考文献:1 陈宁庆. 实用生物毒素学M. 北京: 中国科技出版社,2001。2 李鹏, 赖卫华, 金晶. 食品中真菌毒素的研究J. 农产品加工学刊, 2005, (3):12- 15。3 Jaimez J, et al. 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